03第三章 酶的提取與分離純化ppt課件

酶的提取與分離純化是指將酶從細胞或其他含酶原料中提取出來，再與雜質(zhì)分開，而獲得所要求的酶制品的過程。主要包括細胞破碎、提取、離心分離、過濾與膜分離、沉淀分離、層析分析、電泳分離、萃取分離、濃縮、干燥、結晶等,第四章酶的提取與分離純化,酶的提取、分離純化技術路線,第一節(jié)細胞破碎,細胞破碎是通過各種方法使細胞外層結構破壞的技術過程,細胞結構,細胞破碎方法及其原理,（1）搗碎法利用搗碎機的高速旋轉葉片所產(chǎn)生的剪切力將組織細胞破碎的方法。如：動物內(nèi)臟、植物葉芽、細菌的細胞破碎。（2）研磨法利用研缽、石磨、細菌磨、球磨等研磨器產(chǎn)生的剪切力將組織細胞破碎的方法。是實驗室內(nèi)常用的方法?？梢约尤胄〔Ａ?、玻璃粉、石英砂或氧化鋁作助磨劑。常用于微生物和植物組織細胞破碎。（3）勻漿法利用勻漿器產(chǎn)生的剪切力將組織細胞破碎的方法。通常用于破碎易于分散、比較柔軟、顆粒細小的組織細胞。,一、機械粉碎法,（1）溫度差破碎法利用溫度的突然變化、熱脹冷縮的作用使細胞破碎的方法。如將零下18冷凍的細胞突然放入高溫熱水中或將較高溫度的熱細胞突然冷凍。常用于哪些較為脆弱、易于破碎的細胞（如G），注意操作溫度不能過高，以免引起酶的失活。（2）壓力差破碎法通過壓力的突然變化使細胞破碎的方法。常用的有高壓沖擊法、突然降壓法和滲透壓變化法。高壓沖擊法在結實的圓柱體容器內(nèi)裝上菌體與助磨劑，用活塞或沖擊錘加壓沖擊，以破碎細胞；爆破性減壓法將菌體懸浮在N2/CO2高壓下平衡，37振蕩數(shù)分鐘，然后突然減壓，使細胞壁、膜破碎。,二、物理破碎法,滲透壓變化法是利用滲透壓的變化使細胞破碎。將對數(shù)生長期的細胞懸浮在高滲透壓溶液中（20%蔗糖溶液）平衡一段時間，然后離心收集細胞，將其迅速投入4左右的蒸餾水或其他低滲溶液中，由于細胞內(nèi)外的滲透壓差別而使細胞破碎。適合膜結合蛋白、細胞間質(zhì)酶等的提取，對革蘭氏陽性菌不適用（肽多糖）（3）超聲波破碎法利用超聲波發(fā)生器所產(chǎn)生的聲波或超聲波的作用，通過液體時形成局部減壓，叫空化作用，旋渦生成與消失時，產(chǎn)生很大壓力，從而使細胞破碎。超聲波破碎具有簡便、快捷、效果好等特點，特別適合微生物細胞的破碎。,三、化學破碎法,通過各種化學試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎的方法。常用有機試劑有甲苯、丙酮、丁醇和氯仿等，表面活性劑：特里頓和吐溫。有機溶劑可以使細胞膜的磷脂結構破壞，從而改變細胞膜的通透性，但應當在低溫下操作以防酶變性失活。表面活性劑可以和細胞膜的磷脂以及脂蛋白相互作用，使細胞膜的結構破壞，改變細胞膜通過性。,四、酶促破碎法,通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層結構受到破壞，而達到細胞破碎的方法。自溶法：將細胞在一定的pH和溫度條件下保溫一段時間，利用細胞本身酶系的作用，使細胞破壞而使細胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來的方法。溶菌酶處理用溶菌酶專一性地分解菌體細胞壁上肽多糖分子的-1，4-糖苷鍵，從而破壞細胞壁。酵母細胞：-葡聚糖酶霉菌：幾丁質(zhì)酶,超聲波細胞粉碎機,電動玻璃勻漿機,高壓細胞粉碎機,細胞破碎珠,第二節(jié)酶的提取,酶的提取是指在一定的條件下，用適當?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。酶提取時首先應根據(jù)酶的結構和溶解性質(zhì)，選擇適當?shù)娜軇Ｒ话阏f來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷?、稀堿、稀鹽溶液等進行提取，有些酶與脂質(zhì)結合或含有較多的非極性基團，則可用有機溶劑提取。,一酶的主要提取方法,1、溫度溫度通常控制在04左右。如果酶比較穩(wěn)定時，可以例外。如胃蛋白酶可在37保溫抽提。2、pH選用pH，首先考慮酶的穩(wěn)定性。選用pH不應超過酶的pH穩(wěn)定范圍。其次，從抽提效果出發(fā)，最好遠離待抽提酶的等電點。也就是說，酸性蛋白宜用堿性溶液抽提；堿性蛋白宜用酸性溶液抽提。3、抽提液用量抽提液用量常采用原料量的35倍。有時，為了抽提效果好些需要反復抽提時，抽提溶液比例可能大些。,二、影響提取的主要因素,第三節(jié)沉淀分離,沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術過程。,鹽溶：球蛋白在低濃度鹽溶液中，其溶解度隨鹽離子強度升高而加大的現(xiàn)象。這主要是由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽離子后，帶電表層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而與水之間相互作用加強，因而溶解度提高。鹽析：當鹽濃度繼續(xù)升高到一定濃度時，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而降低，結果使蛋白沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。鹽析作用的理論基礎尚不明了，大致是由于高鹽離子使水的相對濃度降低，蛋白質(zhì)失去水化作用，引起分子之間疏水部分吸引力增加，以致沉淀析出。,一、鹽析沉淀法,式中：S為酶或蛋白質(zhì)在離子強度為I時的溶解度（g/L）；S0為酶或蛋白質(zhì)在離子強度為0時的溶解度（g/L）；Ks為鹽析系數(shù)；I為離子強度。溫度和pH一定時，S0為一常數(shù)。,在一定的溫度和pH值條件下（為常數(shù)），通過改變離子強度使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法稱為Ks分段鹽析；而在一定的鹽和離子強度的條件下（KsI為常數(shù)），通過改變溫度和pH值，使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法，稱為分段鹽析。,在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、鉀、鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。這是由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價廉易得。,各種酶所需硫酸銨的沉淀濃度是不同的，所以可用分級沉淀法將各種酶分級沉淀。硫酸銨鹽析時溶液的鹽濃度以飽和度表示，飽和鹽溶液的飽和度為100(在0約為4mol)，調(diào)整鹽濃度有兩種方法：當?shù)鞍踪|(zhì)溶液體積不大，要達到的鹽濃度不高，可加入飽和硫酸銨溶液，100m1硫酸銨溶液，由飽和度S1變?yōu)镾2，應向其中加入的飽和硫酸銨溶液的ml數(shù)(V)為：VVo(S2S1)/(1S2),當?shù)鞍踪|(zhì)原有體積較大，要達到的鹽濃度又較高，此時加入固體硫酸銨為宜。在0、25下，硫酸銨濃度由飽和度Sl增至S2。應向1L溶液中添加的固體硫酸銨的克數(shù)，可以直接查表,鹽析的優(yōu)點：不會引起蛋白質(zhì)變性，經(jīng)透析去鹽后，能得到保持生物活性的純化蛋白質(zhì)。,注意事項：鹽析的成敗決定于溶液的pH值與離子強度，溶液pH值越接近蛋白的等電點，蛋白質(zhì)越容易沉淀。鹽析一般用的硫酸銨，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平鋪放入烤箱內(nèi)60攝氏度烘干后再稱量，這樣更準確。在加入鹽時應該緩慢均勻，攪拌也要緩慢，越到后來速度應該更注意緩慢，如果出現(xiàn)一些未溶解的鹽，應該等其完全溶解后再加鹽，以免引起局部的鹽濃度過高，導致酶失活。鹽析后最好攪拌40分鐘到一個小時而且再在冰浴中放置一段時間。鹽析后的蛋白質(zhì)最好盡快脫鹽處理，以免變性，透析較慢，一般可用超濾或者G-25，G-50處理。,蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，所帶電荷則因pH變化而變化。當?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點（pI）pH時，蛋白質(zhì)的靜電荷為零，相同蛋白質(zhì)分子間沒有了靜電排斥作用而趨于聚結沉淀，溶解度達到最低點。不同蛋白質(zhì)具有不同的pI值，利用蛋白質(zhì)在pI時溶解度最低的原理，可以把不同的蛋白質(zhì)分開。,二、等電點沉淀法,在酶溶液中加入與水互溶的有機溶劑，可降低溶液的介電常數(shù)使酶分子間的靜電引力增強而發(fā)生沉淀。另外，有機溶劑也可能使酶蛋白脫水而發(fā)生沉淀。,三、有機溶劑沉淀法,常用于酶的沉淀分離的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等,有機溶劑的濃度以百分體積(m1)比表示。加入量依下式計算V=Vo(S2S1)/(SS2)式中：V為應加入的有機溶劑體積；Vo為原有的體積；S、S1、S2分別為待加的、原溶液中含有的及所達到的有機溶劑百分比濃度。,世界酶學史上第一個酶蛋白結晶便是Sumner在刀豆脲酶抽提液中加入32丙酮得到的脲酶結品。,溫度因為大多數(shù)球蛋白在有機溶劑中不穩(wěn)定，特別是在溫度較高時，更易變性失活。因此，所有操作必須在0以下進行，有機溶劑必須冷卻至-15-20，然后攪拌下緩慢加入，沉淀析出后趕快離心分離，并用預冷緩沖液溶解所得沉淀，以降低有機溶劑濃度。,pH一般在進行有機溶劑法時，溶液pH盡可能靠近待純化酶的pI值。此法分辨率較高、溶劑易除去，但易引起酶的變性失活。,影響有機溶劑沉淀法的因素：,大分子量的非離子型聚合物，如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亞胺(PEI)、單寧酸、硫酸鏈霉素以及離子型表面活性劑(SDS等)，用來沉淀蛋白質(zhì)的方法。它們在一定條件下能與蛋白質(zhì)直接或間接形成絡合物，使蛋白質(zhì)析出，離心后收集沉淀。再用適當?shù)姆椒ㄊ姑溉芙獬鰜?。如：PEG常用到的分子量為6000和4000的20(W/V)的濃度能將許多蛋白質(zhì)沉淀出來。,四、復合沉淀法,五、選擇性變性沉淀法,選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜蛋白等雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶的分離方法。如對于熱穩(wěn)定性好的酶如-淀粉酶，可以通過加熱處理，使大多數(shù)雜蛋白變形沉淀而被除去。,第四節(jié)離心分離,一、離心原理,離心分離是借助于離心機旋轉所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術過程。根據(jù)物質(zhì)顆粒的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度及浮力等特點進行分離。當含有細小顆粒的懸浮液靜置不動時，由于重力場的作用使得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液體小的粒子就會上浮。微粒在重力場下移動的速度與微粒的大小、形態(tài)和密度有關，并且又與重力場的強度及液體的粘度有關。,在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。,1、離心力質(zhì)量為m的粒子以一定的角速度作圓周運動時受到向外的離心力。顆粒沉降速度決定于應用的離心加速度（ac），它決定于轉子的角速度（弧度/秒）與半徑（厘米）。,（1）,由于轉子轉一圈等于2弧度，角速度則為：,（2）,式中n為轉子每分鐘轉數(shù)，為轉子的角速度（弧度/秒）。以（2）帶入（1）中，離心加速度即為：,（3）,由此可知離心力大小與轉速的平方成正比，與半徑成正比。在實際工作中半徑是以平均迴轉半徑計算，即由軸心到離心溶液中心的迴轉半徑計算。通常：低速離心以每分鐘的轉數(shù)表示，如：4000r/min。高速離心（超速），常以相對離心力（RCF）表示，如：65000g。,離心力一般用相對離心力RCF，即離心力的大小相當于地球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。一般用RCFg表示，g為重力加速度（980厘米/秒2）。,2、沉降速度和沉降系數(shù),沉降系數(shù)指單位離心力下顆粒的沉降速度，用S表示。用離心法時，大分子沉降速度的量度，等于每單位離心場的速度。或s=v/2r。s是沉降系數(shù)，是離心轉子的角速度（弧度/秒），r是到旋轉中心的距離，v是沉降速度。沉降系數(shù)以每單位重力的沉降時間表示。由于許多生物大分子的S值很小，所以定義10-13s為一個沉降單位，1S=110-13s。常用S表示某些生物大分子、亞細胞及亞細胞器的大小，如16sRNA，蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)一般在1200之間。,沉降速度是指在離心力作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)運動的距離。,常速離心機又稱為低速離心機,其最大轉速在8000r/min以內(nèi)，相對離心力（RCF）在1104g以下，在酶的分離純化過程中，主要用于細胞、細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物的分離。也用于酶的結晶等較大顆粒的分離。,高速離心機的最大轉速為（12.5）104r/min，相對離心力達到11041105g，在酶的分離中主要用于沉淀、細胞碎片和細胞器等的分離。為了防止高速離心過程中,溫度升高而造成酶的變性失活，有些高速離心機裝設有冷凍裝置，謂之高速冷凍離心機。,超速離心機的最大轉速達(2.512)104r/min，相對離心力可以高達5105g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測；沉降系數(shù)和相對分子質(zhì)量的測定等。,二、離心機的選擇,低速離心機,高冷凍速離心機,大容量離心機,三、離心方法的選用,1、差速離心是采用不同的離心速度和離心時間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法。在選擇離心轉速時，應先采用低速離心，使最大顆粒沉于管底。去掉沉淀后，再增加離心力，分離出中等大小的顆粒。最后按照最小顆粒選擇離心力，使其形成沉淀。對形成的各級沉淀經(jīng)過重懸浮、再離心的過程來進一步純化。,特點：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。優(yōu)點：操作簡單。缺點：分離效果較差，不能一次得到純顆粒。,2、密度梯度離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)得以分離的一種區(qū)帶分離方法。常用的梯度介質(zhì)有蔗糖和甘油。,3、等密梯度離心當欲分離的不同顆粒的密度范圍處于離心介質(zhì)的密度范圍內(nèi)時，在離心力的作用下，不同浮力密度的顆?；蛳蛳鲁两?，或向上漂浮，只要時間足夠長，就可以一直移動到與他們各自浮力密度恰好相等的位置。常用的離心介質(zhì)是銫鹽如氯化銫（CsCl）。,特點：區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)顆粒的密度；適宜分離密度相近而大小不同的固相物質(zhì)。,特點：a.介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。b.適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。,總結：1)等密度梯度離心是一種測定顆粒浮力密度的靜力學方法，關鍵在于選擇氯化銫濃度，使之包括待分離物的密度范圍。2)差速離心是一種動力學方法，關鍵在于選擇適合于各分離物的離心力。3）密度梯度離心兼有以上兩種方法的特點，關鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。,三、離心條件的確定,1、離心時間離心時間的概念依據(jù)離心方法的不同有所差別。常速離心、高速離心和差速離心：離心時間是指顆粒顆粒從離心管中樣品液的液面完全沉降到離心管底的時間，稱為沉降時間或澄清時間。密度梯度離心：離心時間是指形成界限分明的區(qū)帶的時間，稱為區(qū)帶形成時間。等密度離心：離心時間是指顆粒完全達到等密度點的平衡時間，稱為平衡時間。,2、溫度和pH離心溫度控制在4。,第五節(jié)過濾與膜分離,過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術過程。,過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。,過濾介質(zhì)不同,非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì),膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì),過濾的分類及其特性(根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同),一、非膜過濾,1粗濾常壓過濾：以液位差為推動力的過濾方法加壓過濾：以壓力泵或壓縮空氣為推動力的過濾方法減壓過濾：又稱為真空過濾或抽濾，是通過在過濾介質(zhì)的下方抽真空，以增加過濾介質(zhì)上下方之間的壓力差，推動液體通過過濾介質(zhì)，而把大顆粒截留的過濾方法。2微濾微孔過濾：微濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒直徑為0.22m，主要用于細菌、灰塵等，物質(zhì)顆粒的過濾。常用于無菌水、礦泉水、汽水的生產(chǎn)。,采用高分子膜以外的材料，如濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷和燒結金屬等作為過濾介質(zhì)的分離技術。包括粗濾和部分微濾。,借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M行分離的技術稱為膜分離技術。膜分離所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時也可以采用動物膜等。膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑的顆粒截留。膜的孔徑有多種規(guī)格可供使用時選擇。,膜分離,加壓膜分離,微濾超濾反滲透,電場膜分離,電滲析離子交換膜電滲析,擴散膜分離,透析,二、膜分離技術,1、加壓膜分離,1）微濾：以微濾膜作為過濾介質(zhì)的膜分離技術。如空氣過濾。,2）反滲透,反滲透膜的孔徑小于20，截留物質(zhì)分子量小于1000Da。主要用于分離各種離子和小分子物質(zhì)，用于無離子水制備、海水淡化等。,反滲透裝備,超過濾是在加壓的條件下，將酶溶液通過一層只允許小分子物質(zhì)選擇透過微孔半透膜而酶等大分子物質(zhì)被截留，從而達到濃縮的目的。如果采用不同孔徑的膜，同時又具有分級分離的作用。優(yōu)點：不需加熱，更適用于熱敏物濃縮；無相變化、設備簡單、操作方便；能在廣泛的pH條件下操作等。,3）超濾,超濾膜一般有兩層組成，表層和基層，表層要面向待超濾的物料溶液。,中空纖維超濾,超濾膜主要類型：平面膜將膜平鋪在多孔支持板上，加壓下(可帶有攪拌)酶溶液從膜面流過水及小分子溶質(zhì)透過膜孔而排比，大分子(如酶)被截留.管式膜將管式膜置于多孔硬管的外側或內(nèi)側，酶溶液在管內(nèi)或管外流動，水和分子溶質(zhì)透過越濾膜，而大分子物質(zhì)被截留而濃縮。中空纖維將聚砜作成中空纖維膜，成束中空纖維裝在圓筒真空超濾器中。,超濾設備,2電場膜分離,1）電滲析,2）離子交換膜電滲析,在半透膜的兩側分別裝上正、負電極。在電場的作用下，小分子的帶電物質(zhì)或離子向著與其本身所帶電荷相反的電極移動，透過半透膜，達到分離的目的。主要用于酶溶液脫鹽。,用離子交換膜代替一般的半透膜。離子交換膜帶有某種基團，只讓戴一種電荷的顆粒通過。選擇透過性強。應用：脫鹽，海水淡化，純水制備，從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸及凝膠電洗脫。,3擴散膜分離,透析膜的使用,透析(Dialysis)是利用蛋白質(zhì)不能通過半透膜,使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無機鹽、單糖、水等分開,將待提純的溶液裝入半透膜的透析袋中，放入蒸餾水或緩沖液中，小分子物質(zhì)借擴散進入透析袋外的蒸餾水或緩沖液中。這樣通過更換透析袋外液，使透析袋內(nèi)的小分子物質(zhì)降至最低。如右圖。,第六節(jié)層析分離,層析技術，亦稱色譜技術，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學性質(zhì)（分子的大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等）的差別，使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相為固定的(稱為固定相)，另一個相則流過此固定相(稱為流動相)并使各組分以不同速度移動，從而達到分離。,層析分離方法,吸附層析是利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析是各種層析技術中應用最早的技術。,一、吸附層析,1吸附層析原理,吸附：任何兩個相之間都可以形成一個界面，其中一個相中的物質(zhì)在兩相界面上密集的現(xiàn)象。吸附劑：凡是能夠將其他物質(zhì)聚集到自己表面上的物質(zhì)。一般是固體或液體，常用的是固體吸附劑。能聚集于吸附劑表面的物質(zhì)稱為被吸附物。吸附劑與被吸附物之間的相互作用力主要是范德華力，其特點是可逆的。,吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當樣品液全部進入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。利用固定相的固體吸附劑表面對不同組分吸附力的大小及洗脫液對它的溶解作用（解吸作用）的差異進行分離。在洗脫時，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。,固體表面的吸附理論以郎格茂的吸附理論較為著名。他認為，在固體內(nèi)部各個原子(或原子團)的吸引力可以平均地分配到周圍原子或原子團上去，從而使吸引力場成為飽和平衡的狀態(tài)。但在表面的各個原子或原子團的吸引力不能得到飽和，還有一面伸向空間，能夠吸附住空間中與它鄰近的其他分子這種化合價力的剩余力量就是吸附劑吸附力的本質(zhì)。,2洗脫方法：溶劑洗脫法置換洗脫法前緣洗脫法,溶劑洗脫法,是采用單一或者混合的溶劑進行洗脫的方法，是目前應用最廣泛的方法。,置換洗脫法,前緣洗脫法,所用的洗脫液是置換洗脫液。置換洗脫液中含有一種吸附力比被吸附組分更強的物質(zhì)，稱為置換劑。當用置換洗脫劑沖洗層析柱時，置換劑取代了原來被吸附組分的位置，使被吸附組分不斷下向移動，經(jīng)過一段時間之后，樣品中的各組分按吸附力從強到弱的順序先后流出，最后流出的是置換劑本身。,是連續(xù)向吸附層析柱內(nèi)加入欲分離的混合溶液，即所用的洗脫液為含有各組分的混合液本身。,常用來吸附酶的吸附劑有硅藻土、活性氧化鋁、磷酸鈣膠、羥基磷灰石、活性炭等。常用的洗脫劑有：石油醚、環(huán)己烷、四氯化碳、甲苯、乙醚、氯仿、丙酮、乙醇、甲醇等,吸附劑來源豐富、價格低廉、可再生，吸附設備簡單。,3吸附劑,二分配層析,分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。,分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質(zhì)在兩項溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)。,在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動，稱為流動相。溶質(zhì)在兩相之間進行連續(xù)的動態(tài)分配。,1、紙上層析,以濾紙為支持物的分配層析。組成濾紙的纖維素是親水物質(zhì)，能形成水相和展層溶劑的兩相系統(tǒng)，被分離物質(zhì)在兩相中的分配保持平衡關系。紙層析用于分析簡單的混合物時可做單向層析。,2、薄層層析,是將吸附劑、載體或其他活性物質(zhì)（如纖維素、硅膠、離子交換劑、氧化鋁或聚酰胺等）均勻涂鋪在平面板（如玻璃板、塑料片、金屬片等）上，形成薄層（常用厚度為0.25毫米左右）后，在此薄層上進行層析分離的分析方法。薄層層析較紙層析優(yōu)越在于分辨高，展層時間短。,是利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的的一種層析分離方法。,三、離子交換層析,離子交換劑是含有若干活性基團的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團（活性基團）而制成。作為不溶性母體的不溶性物質(zhì)通常有苯乙烯樹脂、酚醛樹脂、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等。按活性基團的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進行酶的分離純化。,1、離子交換劑的選擇與處理,1）離子交換劑的類型強酸性陽離子樹脂這類樹脂含有大量的強酸性基團，如磺酸基SO3H，容易在溶液中離解出H+，故呈強酸性。樹脂離解后，本體所含的負電基團，如SO3，能吸附結合溶液中的其他陽離子。這兩個反應使樹脂中的H+與溶液中的陽離子互相交換。弱酸性陽離子樹脂這類樹脂含弱酸性基團，如羧基COOH，能在水中離解出H+而呈酸性。樹脂離解后余下的負電基團，如R-COO(R為碳氫基團)，能與溶液中的其他陽離子吸附結合，從而產(chǎn)生陽離子交換作用。這種樹脂的酸性即離解性較弱，在低pH下難以離解和進行離子交換，只能在堿性、中性或微酸性溶液中(如pH514)起作用。,強堿性陰離子樹脂這類樹脂含有強堿性基團，如季胺基(亦稱四級胺基)NR3OH(R為碳氫基團，CH3)，能在水中離解出OH而呈強堿性。這種樹脂的正電基團能與溶液中的陰離子吸附結合，從而產(chǎn)生陰離子交換作用。弱堿性陰離子樹脂含有弱堿性基團，如伯胺基(亦稱一級胺基)-NH2、仲胺基(二級胺基)-NHCH3、或叔胺基(三級胺基)-N(CH3)2，它們在水中能離解出OH而呈弱堿性。這種樹脂的正電基團能與溶液中的陰離子吸附結合，從而產(chǎn)生陰離子交換作用。,離子交換纖維素,在交換纖維素中，最常用的是DEAE纖維素和CM纖維素。,離子交換交聯(lián)葡聚糖,2)離子交換劑的選擇a.強、弱離子交換劑的選擇：強型：適用的pH范圍廣，制備無離子水弱型：適用的pH范圍窄，分離生物大分子物質(zhì)b.陰、陽離子交換劑的選擇：酶的穩(wěn)定性若pI穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶負電荷，用陰離子交換劑,3)離子交換劑的處理,陽離子交換樹脂的預處理步驟首先用清水對樹脂進行沖洗（最好為反洗）洗至出水清澈無混濁、無雜質(zhì)為止。而后用45%的HCl和NaOH在交換柱中依次交替浸泡24小時，在酸堿之間用大量清水淋洗（最好用混合床高純度去離子水進行淋洗）至出水接近中性，如此重復23次，每次酸堿用量為樹脂體積的2倍。最后一次處理應用45%的HCl溶液進行，用量加倍效果更好。放盡酸液，用清水淋洗至中性即可待用。陰離子交換樹脂的預處理步驟首先用清水對樹脂進行沖洗（最好為反洗），洗至出水清澈無混濁、無雜質(zhì)為止。而后用45%的NaOH和HCl在交換柱中依次交替浸泡24小時，在堿酸之間用大量清水淋洗（最好用混合床高純度去離子水進行淋洗）至出水接近中性，如此重復23次，每次酸堿用量為樹脂體積的2倍。最后一次處理應用45%的NaOH溶液進行，用量加倍效果更好。放盡堿液，用清水淋洗至中性即可待用。,2離子交換層析的基本操作,1）層析柱和裝柱離子交換層析要根據(jù)分離的樣品量選擇合適的層析柱，離子交換用的層析柱一般粗而短，不宜過長。直徑和柱長比一般為1:10到1:50之間，層析柱安裝要垂直。裝柱時要均勻平整，不能有氣泡。裝柱方法有干法和濕法裝柱兩種,2）平衡緩沖液,3）上樣,平衡緩沖液的離子強度和pH的選擇首先要保證各個待分離物質(zhì)如蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。其次是使待分離樣品與離子交換劑有較穩(wěn)定的結合。而盡量使雜質(zhì)不與離子交換劑結合或結合不穩(wěn)定。,上樣量也不宜過大，一般為柱床體積的15為宜，以使樣品能吸附在層析柱的上層，得到較好的分離效果。樹脂交換容量。,4）洗脫緩沖液：,常用梯度洗脫，通常有改變離子強度和改變pH兩種方式。改變離子強度通常是在洗脫過程中逐步增大離子強度，從而使與離子交換劑結合的各個組分被洗脫下來；而改變pH的洗脫，對于陽離子交換劑一般是pH從低到高洗脫，陰離子交換劑一般是pH從高到低。由于pH可能對蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，故一般通常采用改變離子強度的梯度洗脫。,有線性梯度、凹形梯度、凸形梯度以及分級梯度等洗脫方式。一般線性梯度洗脫分離效果較好，故通常采用線性梯度進行洗脫。,5）洗脫速度,洗脫液的流速也會影響離子交換層析分離效果，洗脫速度通常要保持恒定。一般來說洗脫速度慢比快的分辨率要好，但洗脫速度過慢會造成分離時間長、樣品擴散、譜峰變寬、分辨率降低等副作用，所以要根據(jù)實際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對集中某個區(qū)域造成重疊，則應適當降低洗脫速度來提高分辨率；如果分辨率較好，但洗脫峰過寬，則可適當提高洗脫速度。,6）再生,酸堿交替浸泡處理和轉型,又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達到物質(zhì)分離的一種層析技術。,四凝膠層析,凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進出于一個個顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離的目的。,1、凝膠層析的基本原理,凝膠層析的基本概念,外水體積（V0）：指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動相的體積。內(nèi)水體積（Vi）:是指凝膠顆粒中孔穴的體積。洗脫體積（Ve）：是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積。,分配系數(shù)分配系數(shù)是指某個組分在固定相和流動相中的濃度比。對于凝膠層析，分配系數(shù)實質(zhì)上表示某個組分在內(nèi)水體積和在外水體積中的濃度分配關系。在凝膠層析中，分配系數(shù)通常表示為：Ka=(Ve-V0)/(Vi),當Ka=0，即VeVo，說明該組分不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，而只存在于流動相中（完全排阻的大分子），洗脫時最先流出當Ka=1，即VeVo+Vi，對于，由于它可以自由地擴散進入到凝膠顆粒內(nèi)部所有微孔（完全滲透的小分子），洗脫時最后流出。分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。,排阻極限排阻極限是指不能進入凝膠顆?？籽▋?nèi)部的最小分子的分子量。所有大于排阻極限的分子都不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，直接從凝膠顆粒外流出，所以它們同時被最先洗脫出來。排阻極限代表一種凝膠能有效分離的最大分子量，大于這種凝膠的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到分離。例如SephadexG-50的排阻極限為30000，它表示分子量大于30000的分子都將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來。,2、凝膠的選擇和處理,葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠是指由天然高分子葡聚糖與交聯(lián)劑交聯(lián)而成的凝膠。常見的有兩大類，商品名分別為Sephadex和Sephacryl。葡聚糖凝膠中最常見的是Sephadex系列。Sephadex的主要型號是G-10G-200，后面的數(shù)字是凝膠的吸水率（單位是ml/g干膠）乘以10。如SephadexG-50，表示吸水率是5ml/g干膠。數(shù)字越大的，排阻極限越大，分離范圍也越大。,聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。改變丙烯酰胺的濃度，就可以得到不同交聯(lián)度的產(chǎn)物。聚丙烯酰胺凝膠商品名為Bio-GelP，主要型號有Bio-GelP-2Bio-GelP-300等10種，后面的數(shù)字基本代表它們的排阻極限的10-3，所以數(shù)字越大，可分離的分子量也就越大。排阻極限最大的Bio-GelP-300為4105,瓊脂糖與瓊脂糖凝膠瓊脂糖是從瓊脂中分離出來的天然線性多糖，它是瓊脂去掉其中帶電荷的瓊脂膠得到的。瓊脂糖在100C時呈液態(tài)，當溫度降至45C以下時，多糖鏈以氫鍵方式相互連接形成雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經(jīng)凝聚即成為束狀的瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠的排阻極限很大，分離范圍很廣，適合于分離大分子物質(zhì)，但分辨率較低。,凝膠的選擇首先要根據(jù)分離組分的分子量大小確定一個合適的分離范圍。另外一個方面就是凝膠顆粒的大小。顆粒小，分辨率高，但相對流速慢，實驗時間長，有時會造成擴散現(xiàn)象嚴重；顆粒大，流速快，分辨率較低但條件得當也可以得到滿意的結果。,3、凝膠層析的基本操作,（1）層析柱的選擇層析柱的長度對分辨率影響較大，長的層析柱分辨率要比短的高；但層析柱長度不能過長，否則會引起柱子不均一、流速過慢等實驗上的一些困難。一般柱長度不超過100cm，為得到高分辨率，可以將柱子串聯(lián)使用。層析柱的直徑和長度比一般在1:251:100之間。脫鹽柱由于對分辨率要求較低，所以一般比較短。,（2）凝膠柱的鑒定凝膠柱填裝后用肉眼觀察應均勻、無紋路、無氣泡。另外通?？梢圆捎靡环N有色的物質(zhì)，如藍色葡聚糖-2000、血紅蛋白等上柱，觀察有色區(qū)帶在柱中的洗脫行為以檢測凝膠柱的均勻程度。如果色帶狹窄、平整、均勻下降，則表明柱中的凝膠填裝情況較好，可以使用；如果色帶彌散、歪曲，則需重新裝柱。,（3）洗脫液的選擇由于凝膠層析的分離原理是分子篩作用，它不象其它層析分離方式主要依賴于溶劑強度和選擇性的改變來進行分離，所以凝膠層析洗脫液的選擇不那么嚴格。洗脫液的選擇主