菊花組織培養(yǎng)和月季花藥培養(yǎng).ppt

課題1菊花的組織培養(yǎng),通過必修課的學(xué)習(xí)，我們已經(jīng)了解到大多綠色開花植物都是靠種子來繁殖的。那么，有沒有不用種子來培育植物的方法呢？,組織培養(yǎng),扦插,嫁接,壓條,是指在人工培養(yǎng)基上，離體培養(yǎng)植物的器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體，并使其生長、增殖、分化以及再生植株的技術(shù)。,組織培養(yǎng),（一）植物組織培養(yǎng)的基本過程,（1）基礎(chǔ)知識,細(xì)胞離體,必要條件：,一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件,原理:,細(xì)胞的全能性,植物細(xì)胞具有全能性，即已分化的細(xì)胞，具有使后代細(xì)胞形成完整個體的潛能。,原理：,定義：,生物體的每一個細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個體所必需的全部基因,細(xì)胞的分化,概念：,在個體發(fā)育中，相同細(xì)胞的后代在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理功能上發(fā)生穩(wěn)定性差異的過程,結(jié)果：,形成不同的細(xì)胞和組織,原因：,基因在特定的時間和空間條件下的選擇性表達(dá)的結(jié)果,離體的植物器官、組織、細(xì)胞,脫分化,愈傷組織,再分化,根芽,植物體,植物組織培養(yǎng)的基本過程,愈傷組織,（二）影響植物組織培養(yǎng)的因素,1.不同的植物組織，培養(yǎng)的難易程度差別很大。例如，煙草和胡蘿卜的組織培養(yǎng)較為容易，而枸杞愈傷組織的芽誘導(dǎo)就比較難。因此，植物材料的選擇直接關(guān)系到實驗的成敗。對于同一種植物材料，材料的年齡、保存時間的長短等也會影響實驗結(jié)果。菊花的組織培養(yǎng)，一般選擇未開花植株的莖上部新萌生的側(cè)枝。,2.離體的植物組織和細(xì)胞，對營養(yǎng)、環(huán)境等條件的要求相對特殊，需要配制適宜的培養(yǎng)基。常用的一種培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基。其主要成分包括：大量元素，如N、P、K、Ca、Mg、S;微量元素，如B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co；有機物，如甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素，以及蔗糖等。在配制好的MS培養(yǎng)基中，常常需要添加植物激素。,與培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基有何不同？,MS固體培養(yǎng)基成分及比例,微生物培養(yǎng)基以有機營養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無機營養(yǎng)，無機鹽混合物包括植物生長必須的大量元素和微量元素兩大類。,閱讀課文，思考以下問題,1.同微生物培養(yǎng)基相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？,2、你認(rèn)為組織培養(yǎng)過程中，成功的關(guān)鍵有哪些？這些步驟的適宜條件是什么？,組織的脫分化及愈傷組織的再分化。,植物組織培養(yǎng)過程中，影響植物細(xì)胞脫分化、再分化的最重要因素是植物激素，細(xì)胞分裂素與生長素之間的濃度比可以調(diào)控植株組培過程中芽和根的形成。,3.植物激素濃度、使用的先后順序以及用量的比例等，會影響實驗結(jié)果。,植物激素中生長素和細(xì)胞分裂素是啟動細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素。按照不同的順序使用這兩類激素，會得到不同的實驗結(jié)果。,當(dāng)同時使用這兩類激素時，兩者用量的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、長根還是長芽。如為了促進(jìn)芽器官的分化，應(yīng)除去或降低生長素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長素與細(xì)胞分裂素的比例。高利于根的分化，抑制芽的形成生長素/細(xì)胞分裂素適中利于促進(jìn)愈傷組織的形成低利于芽的分化，抑制根的形成,4.除了上述因素外，PH、溫度、光照等條件也很重要。不同的植物對各種條件的要求往往不同。進(jìn)行菊花的組織培養(yǎng)，一般將PH值控制在5.8左右，溫度控制在18-22，并且每日用日光燈照射12h。,生長素/細(xì)胞分裂素,高有利于根的分化、抑制芽的形成低有利于芽的分化、抑制根的形成,（一）制備MS固體培養(yǎng)基,（二）外植體消毒,（三）接種,（四）培養(yǎng),（五）移栽,（六）栽培,二、實驗操作,二、實驗操作,（一）制備MS固體培養(yǎng)基,1、配置各種母液,2、配置培養(yǎng)基,3、滅菌,分裝好的培養(yǎng)基連同其他器械一起進(jìn)行高壓蒸汽滅菌,1、選材：菊花莖段，取生長旺盛的嫩枝,（二）外植體消毒,2、消毒,流水沖洗,菊花莖段用流水沖洗后可少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右,酒精處理,用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分?jǐn)?shù)為70的酒精中搖動23次，持續(xù)67s，立即將外植體取出，在無菌水中清洗,消毒液處理,取出后用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1的氯化汞溶液中12min，取出后在無菌水中至少清洗3次，漂凈消毒液,（三）接種,污染的主要來源是空氣中的細(xì)菌和孢子，接種室消毒是至關(guān)重要的。用70的酒精噴霧使空氣消毒，酒精或新潔爾滅搽洗工作臺并用紫外線照射20分鐘,1、接種室消毒,2、無菌操作要求,操作要在酒精燈火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼燒滅菌，接種后立即蓋好瓶蓋。,（四）培養(yǎng),接種后的錐形瓶最好放在無菌箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)期間應(yīng)定期消毒。培養(yǎng)溫度控制在18-22，并且脫分化形成愈傷組織后，每日用日光燈光照12h。,（五）移栽,移栽生根的菊花試管苗之前，應(yīng)先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長幾日,1、打開封口膜,2、清洗轉(zhuǎn)移,用流水清洗根部的培養(yǎng)基，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時間,（六）栽培,3、移栽,珍珠巖：固體基質(zhì)型，含水量高、蓄水性強、透性好，適合栽培,幼苗長壯后，移栽到土壤中,幼苗移栽后，每天觀察并記錄幼苗的生長情況，適時澆水、施肥，直至開花,課堂2月季的花藥培養(yǎng),1、被子植物定義：凡是種子有果皮包被著，胚珠有子房壁包被著的植物，就叫做被子植物,一、被子植物和裸子植物,2、裸子植物定義：凡是胚珠裸露，外面沒有子房壁包被，種子外面沒有果皮包被的植物稱為裸子植物,實例：玉米、大豆、梨、杏,實例：松、杉、柏,3、花的結(jié)構(gòu),4、花的作用,被子植物的有性生殖是在花里進(jìn)行的，雌蕊和雄蕊是進(jìn)行有性生殖的主要部分,二、被子植物花粉粒的形成,1、雄蕊的結(jié)構(gòu),雄蕊：,2、花藥的結(jié)構(gòu),花粉是小孢子母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂而形成的，因此，花粉是單倍體的生殖細(xì)胞,3、被子植物的花粉發(fā)育,花粉粒的形成,經(jīng)歷時期：,四分體時期、單核期、雙核期,兩個精子和一個營養(yǎng)核的基因型相同,四、產(chǎn)生花粉植株的兩條途徑,五、影響花藥培養(yǎng)的因素,1、材料的選擇,接種的花藥時期,選擇合適的花粉發(fā)育時期是提高誘導(dǎo)成功率的重要因素,因為并不是任何時期的花粉都可以經(jīng)過培養(yǎng)產(chǎn)生愈傷組織或胚狀體，花粉發(fā)育的過程中，只有某一個時期對離體刺激敏感。,選材是否成功是花藥培養(yǎng)成功的關(guān)鍵,選材,最適合花藥培養(yǎng)的小孢子發(fā)育時期為單核靠邊期,選擇單核期以前的花藥接種，質(zhì)地幼嫩，極易破碎；選擇單核期之后的花藥接種，花瓣已有些松動，又給材料的消毒帶來困難，且難以挑選到單核期的花藥。,花藥培養(yǎng)時期的選擇,其它時期選擇的缺點,花藥培養(yǎng)時間,為了挑選到單核期的花藥，通常選擇完全未開放的花蕾。盛開的或略微開放的花，都不宜選作實驗材料。,選擇完全未開放花蕾的原因,完全未開放的花蕾，可挑選到單核期的花藥，菌少、易消毒,單核期花藥的挑選,一般月季的花藥培養(yǎng)時間選在五月初到五月的中旬，即月季的初花期。初花期的花蕾營養(yǎng)狀態(tài)及生理狀態(tài)會比較好，可能提高花粉的誘導(dǎo)成功率,月季花藥培養(yǎng)時的花粉粒最好是（）A、四分體時期B、單核居中期C、單核靠邊期D、二核或三核花粉粒,C,2、培養(yǎng)基：,花藥培養(yǎng)基所采用的培養(yǎng)基可能因植物的不同而有所變化小麥中為N6，馬鈴薯、月季中為MS，油菜中為B5培養(yǎng)基,某些植物的花粉細(xì)胞核不易著色，需采用焙花青-鉻礬法，這種方法能將花粉細(xì)胞核染成藍(lán)黑色。,六、實驗操作,（一）材料的選取,最常用的方法有醋酸洋紅法,1、確定花粉發(fā)育時期方法：,醋酸洋紅法染色機理,醋酸洋紅為堿性染色劑，而花粉細(xì)胞內(nèi)有染色體，染色體主要成分是DNA和蛋白質(zhì),易被堿性染料著色染成紅色。,醋酸洋紅的配置,2、醋酸洋紅法,將花藥放在載玻片上，加一滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)1的醋酸洋紅，用鑷柄將花藥搗碎，蓋上蓋玻片在顯微鏡下檢查。,染色操作,3、焙花青鉻釩法,將無水酒精與冰醋酸按體積比為3：1的比例混勻,卡諾氏固定液的配制方法,作用：能迅速穿透細(xì)胞,將其固定并維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性,還要能夠增強染色體的嗜堿性,達(dá)到優(yōu)良染色效果。,花藥應(yīng)該在卡諾氏固定液中固定20min，然后取出放在載玻片上，加焙花青鉻釩溶液染色，蓋上蓋玻片后在顯微鏡下檢查。,焙花青鉻釩溶液的配制方法,染色操作,（二）材料的消毒,1、酒精處理,花蕾用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精浸泡30秒，立即取出。無菌水清洗無菌吸水紙吸干花蕾表面的水分,2、消毒液處理,（三）接種和培養(yǎng),放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞溶液中24分鐘（也可質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈣溶液或飽和漂白粉溶液）無菌水沖洗35次用于培養(yǎng)花藥，實際上多數(shù)未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或穎片保護(hù)，通常處于無菌狀態(tài)，所以只要將整個花蕾或幼穗消毒即可。,在無菌條件下除去萼片和花瓣用鑷子取出花藥,要徹底去除花絲，因為與花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成,立即將花藥接種于培養(yǎng)基上，通常每瓶接種花藥7-10個。,1、剝?nèi)』ㄋ?勿損傷花藥，以免誘導(dǎo)出非花粉愈傷組織,2、接種,注意：,培養(yǎng)條件：溫度控制在25左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。,3、培養(yǎng),培養(yǎng)：一般經(jīng)過20-30天培養(yǎng)后，會發(fā)現(xiàn)花藥開裂，長出愈傷組織或釋放出胚狀體長出愈傷組織則將愈傷組織及時轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，以便進(jìn)一步分化出再生植株,注意：如果花藥開裂釋放出胚狀體，則一個花藥內(nèi)就會產(chǎn)生大量幼小植株，必須在花藥開裂后盡快將幼小植株分開，分別移植到新的培養(yǎng)基上，否則這些植株將很難分開。,在花藥培養(yǎng)中，特別是通過愈傷組織形成的花粉植株，常常會出現(xiàn)染色體倍性的變化（主要原因是營養(yǎng)核和生殖核融合造成的）,4、鑒定和篩選,5、植物組織培養(yǎng)技術(shù)與花藥培養(yǎng)技術(shù)的異同點：,注意花藥離體培養(yǎng)和單倍體育種的區(qū)別,選學(xué),1、雌蕊的組成,柱頭、花柱、子房,2、子房的結(jié)構(gòu),被