單克隆抗體制備ppt課件VIP

.,實驗研究的目的性功能、形態(tài)、數(shù)量實驗設(shè)計的科學(xué)性全面、動態(tài)、鮮明、對應(yīng)、對照實驗方法的合理性確切、先進(jìn)實驗原理的內(nèi)涵性意義、要點實驗操作的規(guī)范性準(zhǔn)備、嚴(yán)格、準(zhǔn)確、重復(fù),.,免疫血清和單克隆抗體的制備,.,一、免疫血清的制備1.原理：機體具有多種B細(xì)胞克隆，將適當(dāng)?shù)目乖镔|(zhì)注入人或動物體內(nèi)后可被不同的B細(xì)胞克隆同時識別，經(jīng)過一定時間，受刺激的B細(xì)胞克隆針對抗原表位的多少而產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體，每一抗原表位都能誘發(fā)相應(yīng)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生單克隆抗體，此獲得的血清即為含多種單克隆抗體的混合物，稱之為多克隆抗體免疫血清，簡稱免疫血清。優(yōu)質(zhì)免疫血清的產(chǎn)生，主要取決于抗原的純度和免疫原性，以及動物的免疫應(yīng)答能力。此外，尚需考慮免疫途徑、抗原劑量、注射次數(shù)、時間間隔和有無佐劑等因素。,.,免疫原1.抗原種類微生物抗原、組織抗原和免疫球蛋白抗原。2.抗原純度一般的抗原只要達(dá)到親合層析或SDSPAGE電泳純即可。3.抗原用量在一定范圍內(nèi)與免疫應(yīng)答強度呈正相關(guān)。在應(yīng)用完全弗氏佐劑時，蛋白質(zhì)類抗原劑量以0.51mg/kg體重為宜，加強免疫約為基礎(chǔ)劑量的1/21/3。,.,4.抗原的處理1）顆粒性抗原：紅細(xì)胞、菌體等制成懸液，不需佐劑，直接免疫。菌體數(shù)11010個/ml為宜。2）可溶性蛋白質(zhì)抗原（如人IgG）、病毒抗原、細(xì)菌可溶性抗原組分等，可以直接與弗氏完全佐劑（1：1V/V）混合、乳化。3）半抗原（多糖、多肽、激素、化學(xué)藥品）需與載體偶聯(lián)。常用載體有牛血清白蛋白（BSA）、鑰孔嘁血藍(lán)素(KLH)、雞血清蛋白（OA）；偶聯(lián)劑有過碘酸鈉、戊二醛和碳化二亞胺等。KLH是最常用的載體蛋白，碳化二亞胺是最常用的偶聯(lián)劑。,.,佐劑1.概念佐劑屬非特異性免疫增強劑，與抗原一起注射或預(yù)先注入機體時，可增強機體免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答的類型。2.種類1）卡介苗（BCG）、短小棒狀桿菌（CP）、脂多糖（LPS）、細(xì)胞因子；2）氫氧化鋁、明礬；3）雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸（polyI：C）和雙鏈多聚腺苷酸：鳥苷酸（polyA：U）；4）礦物油、脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物（ISCOMs）、CPG寡核苷酸。,.,3.弗氏完全佐劑1）成分：羊毛脂、液體石蠟和滅活卡介苗。2）配方：羊毛脂：液體石蠟為1：2，也可1：1。滅活卡介苗（220mg/ml）。4.弗氏不完全佐劑，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐劑。5.用法：佐劑與抗原等量混合，充分乳化。,.,動物選擇對免疫動物的主要要求有：1.應(yīng)選擇與抗原物質(zhì)親緣關(guān)系遠(yuǎn)的動物，特別是在制備抗免疫球蛋白血清時更要注意。抗原物質(zhì)的來源生物與被免疫動物親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，免疫應(yīng)答能力越強，抗體產(chǎn)生水平越高，抗體親和力也越強。2.動物生理狀態(tài)正常，發(fā)育成熟，體重符合規(guī)定。家兔初始免疫體重通常在22.5kg。3.性別上以雄性成年動物較常用，也可采用雌性非妊娠動物。不能應(yīng)用患病或剛剛病愈、有免疫缺陷或應(yīng)用免疫抑制劑的動物。,.,免疫方法1.免疫途徑1）注射方法：靜脈、腹腔、肌肉、皮下、皮內(nèi)和淋巴結(jié)等。2）免疫方法：小劑量、多點、多途徑方法。3）顆粒性抗原（細(xì)菌懸液、紅細(xì)胞懸液）采用小鼠腹腔注射。4）可溶性抗原（如IgG）采用弗氏完全佐劑的乳劑（油包水型），家兔背部多點皮下注射法。,.,2.可溶性抗原免疫1）方法：基礎(chǔ)免疫（初次免疫）后三周左右，進(jìn)行加強免疫，以后每隔2周加強免疫一次。2）加強免疫次數(shù)取決于試血結(jié)果。家兔耳緣靜脈、小鼠眶靜脈少量采血，分離血清，免疫雙擴實驗測定血清效價1：32或ELISA法測定抗體效價1：10000，表明抗體效價較高，可采兔頸動脈或心臟全部血液，分離血清。4）如抗體效價較低，繼續(xù)加強免疫，一般需45次。若仍不能達(dá)到抗體效價要求，應(yīng)考慮重新免疫。3.顆粒性抗原免疫第一周注射2次，隨后每周加強免疫1次，45天試血。,.,3.操作程序1）健康雄性家兔體重2.53kg，背部皮下多點注射。2）基礎(chǔ)免疫：抗原完全佐劑(抗原劑量4mg/只)2ml(1:1V/V)吸入兩支注射器內(nèi)，三通連接，反復(fù)推拉混合至乳化懸液。3）加強免疫：抗原不完全佐劑(抗原劑量2.5mg/只)，間隔710天加強一次。約23次。4）試血：末次注射后第7天取少量靜脈血，免疫雙擴試驗血清檢測，抗血清效價1：32（或ELISA法檢測抗體效價1：10，000）時頸動脈放血，分離血清，分裝，保存。,.,二單克隆抗體的制備1975年Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交瘤細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無性繁殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)，這項技術(shù)上的突破使血清學(xué)的研究進(jìn)入了一個高度準(zhǔn)確的新紀(jì)元。,.,1.原理根據(jù)致敏的單一B細(xì)胞克隆具有分泌特異性抗體和骨髓瘤細(xì)胞在體外長期增殖的特性，采用細(xì)胞融合技術(shù)在體外可將上述兩種細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞因具備了B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的雙重特性，即可分泌抗體，又能在HAT培養(yǎng)基中長期存活。因此，可通過HAT選擇性培養(yǎng)，篩選出克隆化目的雜交瘤細(xì)胞株，再利用雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清或雜交瘤細(xì)胞接種小鼠產(chǎn)生的腹水，獲取大量的來源于雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體（monoclonalantibody,mAb）。,.,2.試劑與器材（1）細(xì)胞融合劑：聚乙二醇（PEG）（2）0.2mol/LL-谷氨酰胺貯存液（3）200雙抗（青、鏈霉素）溶液（4）RPMI-1640培養(yǎng)液（5）15%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液（6）100氨基蝶呤（A）貯存液（7）100次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷貯存液（8）1HAT培養(yǎng)液（9）1HT培養(yǎng)液（10）1008-雜氮鳥嘌呤貯存液,.,（11）細(xì)胞凍存液：90ml含30%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液+10mlDMSO（12）0.2MpH7.4磷酸鹽緩沖液（13）主要儀器設(shè)備：CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、精密天平、低溫和普通冰箱、液氮罐、離心機、高壓滅菌器、烤箱、水浴鍋、除菌濾器、酶聯(lián)免疫測定儀等。（14）常規(guī)實驗器材：血細(xì)胞記數(shù)板、各種吸管、離心管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、24孔和96孔培養(yǎng)板、細(xì)胞凍存管、注射器、微量移液器等。（15）抗體純化器材與試劑。（16）小鼠實驗器材：手術(shù)剪刀、鑷子等解剖器材。（17）骨髓瘤細(xì)胞：小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0或NS-1。,.,3.實驗流程（1）實驗動物免疫：BALB/c小鼠，雌性，68W。常規(guī)免疫方案：0、15、30天，72h后制備脾細(xì)胞懸液?；A(chǔ)免疫：10100g抗原(可溶性抗原)完全佐劑0.2ml(1:1V/V)，背部皮下多點注射。加強免疫：同量抗原不完全佐劑，間隔710天一次。約23次，皮下或腹腔注射。試血：取靜脈血，ELISA法檢測血清中抗體滴度，當(dāng)效價達(dá)到1：400以上時，進(jìn)行加強免疫。弱免疫原免疫方案：0天、30天、45天、60天、75天。,.,（2）免疫動物脾細(xì)胞懸液的制備：將末次免疫后3天BALB/c小鼠處死，消毒，無菌取出脾臟，置入無菌PBS或培養(yǎng)液中。在100目的鋼網(wǎng)上研磨脾臟。收集細(xì)胞于50ml離心管中，1500rpm離心5分，去上清。加入10mlPBS用吸管輕微混勻，1500rpm離心5分，去上清，用10mlRPMI培養(yǎng)液懸浮。細(xì)胞計數(shù)（細(xì)胞數(shù)/ml=N/4104稀釋倍數(shù)）用1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1108/ml,.,（3）飼養(yǎng)細(xì)胞制備在組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若加入其他活細(xì)胞則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長繁殖，所加入的細(xì)胞稱飼養(yǎng)細(xì)胞。常用的是小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。將正常BALB/c小鼠腹部消毒后，注射預(yù)冷的無血清培養(yǎng)液5ml，輕揉腹部數(shù)次，于腹部左下處剪開腹膜，吸取細(xì)胞懸液，反復(fù)23次，用培養(yǎng)液離心洗滌2次。用15%FCS-RPMI-1640調(diào)細(xì)胞濃度為2105/ml，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，100l/孔。,.,（4）骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞用10FCS-RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)1周，23天換液一次，依細(xì)胞生長情況34天傳代一次，適宜密度3105/ml。融合之前3天，每天換一半培養(yǎng)液，使細(xì)胞保持在對數(shù)生長期。取對數(shù)生長骨髓瘤細(xì)胞離心，用無血清培養(yǎng)液洗2次，調(diào)細(xì)胞濃度為12107/ml備用。,.,（5）細(xì)胞融合1）將骨髓瘤細(xì)胞與脾臟細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合，在50ml離心管中用無血清培養(yǎng)液洗1次，離心棄上清；2）1min內(nèi)加入37預(yù)溫的1ml50PEG溶液，邊加邊搖37水浴1min；3）加37預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml；4）離心，棄上清，用含20小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸；5）將上述細(xì)胞加入已有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100l，放入375CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。,.,（6）融合細(xì)胞觀察、換液及雜交瘤抗體檢測細(xì)胞培養(yǎng)3天后，使用HAT培養(yǎng)液換液；3天后，再次使用HAT培養(yǎng)液換液。當(dāng)細(xì)胞克隆集落大于3mm時，利用間接ELISA法篩選分泌單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞克隆。,.,（7）雜交瘤細(xì)胞克隆化將分泌單克隆抗體陽性的雜交瘤細(xì)胞克隆按有限稀釋法稀釋細(xì)胞（用HAT培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞），于96孔培養(yǎng)板中加入0.1ml/孔，培養(yǎng)2周，利用間接ELISA法挑選單個陽性雜交瘤細(xì)胞克隆孔并再次進(jìn)行亞克隆，直至亞克隆時全部克隆孔細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗體檢出陽性率為100%為止。,.,（8）雜交瘤細(xì)胞凍存與復(fù)蘇將陽性細(xì)胞克隆在培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)，收集細(xì)胞，離心1000轉(zhuǎn)、5分，棄上清，加入細(xì)胞凍存液，移至凍存管，-70冰箱過夜，然后液氮長期保存。將凍存管從液氮中取出，立即放入37水浴中，使之迅速融化。用培養(yǎng)液洗滌1次后，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。,.,（9）單克隆抗體的大量制備BALB/c雌性小鼠接種雜交瘤細(xì)胞前12周，腹腔注射降植烷預(yù)處理。用無血清培養(yǎng)液洗滌雜交瘤細(xì)胞23次，調(diào)細(xì)胞濃度12106/ml，每只小鼠腹腔注射0.51ml細(xì)胞懸液。待小鼠腹部明顯膨大時，收集腹水，離心，收集上清，分裝，-80保存。,.,（10）單克隆抗體純化鹽析法腹水10ml等量生理鹽水混勻，在電磁攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸胺20ml，4放置0.5h以上或過夜。離心（3000rpm）30min，棄上清。沉淀加生理鹽水20ml溶解后，再次加入飽和硫酸胺10ml，4放置0.5h或過夜。離心（3000rpm）30min，棄上清。沉淀加盡量少生理鹽水溶解，裝入透析袋中，用流動自來水透析40min，再用生理鹽水透析24h，中間換液34次，檢測無NH4離子存在即可。-20備用。,.,凝膠柱層析實驗原理：凝膠本身是多孔的分子篩，在交聯(lián)劑作用下形成三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)凝膠柱時，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小不同，由大到小洗脫而進(jìn)行分離。（大分子蛋白質(zhì)不能進(jìn)入凝膠粒內(nèi)部，在膠粒間隙隨洗脫液最先流出。而小分子蛋白質(zhì)進(jìn)入膠粒內(nèi)部洗脫較慢。）關(guān)鍵點：1.裝柱切忌有氣泡和斷層，有斷層要重裝柱；2.加樣時緩沖液面恰好在濾紙片上，及時加樣避免柱干涸，干涸凝膠不能繼續(xù)使用；3.因操作時間長，宜在4操作，防止影響免疫球蛋白活性。,.,（11）單克隆抗體免疫學(xué)性質(zhì)檢定1）單克隆抗體特異性測定；2）單克隆抗體亞類測定；3）單克隆抗體效價測定；4）親和力測定；5）識別抗原表位的測定。,.,.,4.單克隆抗體制備的幾處要點：1）相對分子量為4000的PEG融合效率最高。2）免疫原性較強的抗原可不用佐劑，但一般可溶性蛋白抗原免疫時需要佐劑，并且乳化要充分。一般多采用背部多點注射法