實(shí)驗(yàn)五耐高溫酵母菌株的誘變選育

1、實(shí)驗(yàn)一 耐高溫酵母菌株的誘變選育一、目的要求通過(guò)實(shí)驗(yàn)，觀察紫外線對(duì)酵母菌的誘變效應(yīng)，學(xué)習(xí)物理因素誘變育種的方法。二、基本原理紫外線對(duì)微生物有誘變作用，主要引起是DNA的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成共價(jià)結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體），從而引起菌體遺傳性變異。測(cè)定紫外光的劑量有直接法（以爾格/平方毫米表示絕對(duì)劑量）和間接法（以輻照時(shí)間或致死率作為相對(duì)劑量）兩種。微生物所受射線的劑量決定于燈的功率、照射距離和時(shí)間。如果功率和距離是固定的話，則劑量就和照射的時(shí)間成正比，故照射時(shí)間的長(zhǎng)短可作為相對(duì)劑量。一般用15W的紫外燈，距離固定在左右，選用致死率達(dá)9099.9%所需的輻射時(shí)間進(jìn)行誘變處理。但

2、各類微生物所需的最適時(shí)間不同，一般營(yíng)養(yǎng)體需輻照35分鐘，芽孢要10分鐘，芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)體要13分鐘，革蘭氏陽(yáng)性菌和無(wú)芽孢菌較易殺死，用30秒，放線菌的分生孢子用30秒2分鐘。輔射不宜在肉湯等成分復(fù)雜的液體中進(jìn)行，以免化學(xué)反應(yīng)的干擾；同時(shí)要有電磁攪拌設(shè)備，以求照射均勻，尤其在菌液濃度較大或菌體、孢子等較大而重時(shí)很容易在處理期間發(fā)生沉降，此時(shí)電磁攪拌更顯重要。照射前紫外燈宜先開燈預(yù)熱2030分鐘，使光波穩(wěn)定。三菌種與儀器菌種：酵母菌 儀器：血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡，紫外線燈（15W），電磁攪拌器，離心機(jī) 四實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（1）菌懸液的制備（a）取培養(yǎng)24小時(shí)的酵母菌的斜面1支，用無(wú)菌生理鹽水將菌苔洗下，并倒入

3、盛有玻璃珠的大試管中，振蕩30分鐘，以打碎菌塊。（b）將上述菌液離心（1500r/min，離心5分鐘），棄去上清液，將菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌23次，最后制成菌懸液。（c）用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升108個(gè)。（2）馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基溶化后，冷至55左右時(shí)倒平板，凝固后待用。（3）紫外線處理（a）將紫外線燈開關(guān)打開預(yù)熱約20分鐘。（b）取直徑9cm無(wú)菌平皿1套，分別加入上述菌懸液67ml，并放入無(wú)菌大頭針于平皿中。（c）將盛有菌懸液的1平皿置于磁力攪拌器上，在距離為30cm，功率為15W的紫外線燈下分別攪拌照射30s，60s，90s，120s，150s，180s。(4) 稀釋在紅燈

4、下，將上述經(jīng)誘變處理的菌懸液以10倍稀釋法稀釋成10-1-10-6（具體可按估計(jì)的存活率進(jìn)行稀釋）。(5)涂平板取10-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋度涂平板，每個(gè)稀釋度涂平板3只，每只平板加稀釋菌液01ml，用無(wú)菌玻璃刮棒涂勻。以同樣操作，取未經(jīng)紫外線處理的菌稀釋液涂平板作對(duì)照。(6)培養(yǎng)將上述涂勻的平板，靜置2min后，用黑布（或黑紙）包好，置36、42、50三個(gè)不同溫度下培養(yǎng)24小時(shí)。注意每個(gè)平皿背面要標(biāo)明處理時(shí)間和稀釋度。(7)計(jì)數(shù)將培養(yǎng)24小時(shí)后的平板取出進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)對(duì)照平板上菌落數(shù)，計(jì)算1.不同溫度下菌的存活率2.不同紫外線處理時(shí)間菌的存活率3.同一溫度下稀釋倍數(shù)的準(zhǔn)確性五實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察與記錄將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入表8 六思考題 (1) 用于誘變的菌懸液（或孢子懸液）為什么要充分振蕩？(2) 經(jīng)紫外線處理后的操作和培養(yǎng)為什么要在暗處或紅光下進(jìn)行？稀釋倍數(shù)平均菌落處理時(shí)間 （個(gè)數(shù)/皿）溫度10-510-610-7存活率%致死率%360（對(duì)照）306090120150180420（對(duì)照）306090120150180500（對(duì)