CHO細(xì)胞大規(guī)培養(yǎng)

1、摘要 CHO細(xì)胞是中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美國科羅拉多大學(xué)Dr. Theodore T. Puck從一成年雌性倉鼠卵巢分離獲得，為上皮貼壁型細(xì)胞。微載體細(xì)胞培養(yǎng)開始于19世紀(jì)60年代末期，最早使用離子交換凝膠（DEAE-Sephadex A50）作為載體，輕微攪動(dòng)即可懸浮在培養(yǎng)基中。由于這種微載體帶有電荷，利于細(xì)胞貼附于載體上進(jìn)行生長繁殖。載體處于懸浮狀態(tài)時(shí)，這樣既可大大增加細(xì)胞附著面積，又使細(xì)胞能與培養(yǎng)基充分接觸，進(jìn)而有利于細(xì)胞的生長，因此能達(dá)到大量培養(yǎng)細(xì)胞的目的。后來根據(jù)細(xì)胞附著生長的特點(diǎn)，對微載體進(jìn)行改良，使其電荷或其介質(zhì)更利于細(xì)

2、胞附著和生長。培養(yǎng)液中大量的微載體為細(xì)胞提供了極大的附著表面，1 g 微載體其比表面積可達(dá)6000 cm2，從而可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高密度培養(yǎng)。首先將CHO細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基（SAF-CHO-G-004）中進(jìn)行無血清馴化。其次將CHO細(xì)胞（成功用無血清馴化后的細(xì)胞）用0.25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液后，沿導(dǎo)流管加入含明膠微載體和SAF-CHO-G-004細(xì)胞培養(yǎng)基的WhcltonBioster瓶罐中連續(xù)培養(yǎng)生成一定量的種子細(xì)胞。最后將種子細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。運(yùn)用半連續(xù)式培養(yǎng)來操作：在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時(shí)間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補(bǔ)足到原有體積，使反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變。最后在

3、細(xì)胞培養(yǎng)過程中進(jìn)行細(xì)胞常數(shù)的檢查和培養(yǎng)基內(nèi)污染物的檢測一些抗凋亡策略來增加細(xì)胞培養(yǎng)的效率。關(guān)鍵字CHO細(xì)胞;明膠微載體;無血清培養(yǎng);半連續(xù)式培養(yǎng)目錄摘要1關(guān)鍵字：CHO細(xì)胞 明膠微載體 無血清培養(yǎng) 半連續(xù)式培養(yǎng)1緒論31.2CHO細(xì)胞培養(yǎng)的特性32.2.1培養(yǎng)基的物理性質(zhì)52.2.2無血清培養(yǎng)73.1.2蛋白質(zhì)作基質(zhì)的微載體93.1.3微載體培養(yǎng)原理與操作103.2.2微載體培養(yǎng)種子細(xì)胞133.2.3微載體培養(yǎng)的細(xì)胞傳代133.3半連續(xù)式培養(yǎng)（semi-continuous culture） 操作144.2細(xì)胞常數(shù)檢查164.3CHO細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)污染物的檢測164.3.2真菌污染對細(xì)胞的影響及污

4、染物的檢測174.3.3支原體污染對細(xì)胞影響及污染物的檢測175抗凋亡策略在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應(yīng)用185.1 營養(yǎng)物質(zhì)抗凋亡185.2 基因抗凋亡195.3 化學(xué)方法抗凋亡19參考文獻(xiàn)：20緒論1.1引言CHO細(xì)胞是中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美國科羅拉多大學(xué)Dr. Theodore T. Puck從一成年雌性倉鼠卵巢分離獲得，為上皮貼壁型細(xì)胞，是目前生物工程上廣泛使用的細(xì)胞系。工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用較多的是CHO-K1細(xì)胞，為轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，細(xì)胞染色體分布頻率是2n22，系亞二倍體細(xì)胞。ATCC保存CHO-K1細(xì)胞株，編號為CCL-61，被廣泛地用于

5、重組DNA蛋白的表達(dá)。由于該細(xì)胞存在遺傳缺陷，無脯氨酸合成基因，不能將谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?_-半醛，培養(yǎng)過程中需在培養(yǎng)基中添加L-脯氨酸才能生長。并且由于該細(xì)胞已經(jīng)霍亂毒素適應(yīng)，形態(tài)學(xué)有所改變。最初細(xì)胞為貼壁型細(xì)胞，經(jīng)多次傳代篩選后，也可懸浮生長。1.2CHO細(xì)胞培養(yǎng)的特性CHO細(xì)胞雖可像微生物細(xì)胞一樣，在人工控制條件的生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，但其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性與微生物細(xì)胞相比，有顯著差別：動(dòng)物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大得多，無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，對剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差；倍增時(shí)間長，生長緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時(shí)須用抗生素；培養(yǎng)過程需氧量少(氧傳質(zhì)系數(shù)kLa 大于10 h-1即可滿足每

6、毫升107 個(gè)細(xì)胞的生長)；培養(yǎng)過程中細(xì)胞相互粘連以集群形式存在；原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50 代即退化死亡；代謝產(chǎn)物具有生物活性，生產(chǎn)成.本高，但附加值也高。2.1DMEM培養(yǎng)基的組成與制備序號化合物名稱含量 (mg/L)序號化合物名稱含 量 (mg/L)1 無水氯化鈣200.0017 L-絲氨酸42.002 硝酸鐵 .9H2 O 0.1018 L-蘇氨酸95.003 氯化鉀400.0019 L-色氨酸16.004 無水硫酸鎂97.6720 L-酪氨酸鈉鹽104.005氯化鈉6400.0021 L-纈氨酸94.006 無水磷酸二氫鈉125.0022 D-泛酸鈣4.007 L-鹽酸精氨酸84.00

7、23 氯化膽堿4.008 L-鹽酸胱氨酸63.0024 葉酸4.009 L-谷氨酰胺584.0025 肌醇7.2010 甘氨酸30.0026 煙酰胺4.0011 L-鹽酸組氨酸42.0027 核黃素0.4012 L-異亮氨酸105.0028 鹽酸硫胺4.0013 L-亮氨酸105.0029 鹽酸吡哆辛4.0014 L-鹽酸賴氨酸146.0030 葡萄糖1000.0015 L-甲硫氨酸30.0031 丙酮酸鈉110.0016 L-苯丙氨酸66.0032 酚紅15.002.1.1DMEM培養(yǎng)基的組成將一袋培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水（水溫2030

8、）到950毫升，輕微攪拌溶解。 （1）加入2.438克碳酸氫鈉。 （2）輕微攪拌溶解，加注射用水至1升。 （3）用1mol / L 氫氧化鈉溶液或 1mol / L鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。 （4）用0.2m濾膜正壓過濾除菌。 （5）溶液應(yīng)在28下避光保存。2.2.1培養(yǎng)基的物理性質(zhì) 無菌：無菌是保證培養(yǎng)細(xì)胞生存的首要條件。培養(yǎng)液不僅對細(xì)胞是高營養(yǎng)物，對細(xì)菌和霉菌也是高度營養(yǎng)物，細(xì)胞培養(yǎng)中如污染微生物，其繁殖比細(xì)胞快且能產(chǎn)生毒素使細(xì)胞死亡，因此細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵之一是防止污染。污染微生物可來源于組織培養(yǎng)液、器皿、組織本身、工作者本身。因此，培養(yǎng)室的空氣等要徹底消毒，所有操作均要嚴(yán)格實(shí)行無菌操作，

9、各種物品拿入操作臺前應(yīng)消毒，用灑精擦表面，用前于紫外線照；操作者洗手、泡手，酒精擦手，打開培養(yǎng)管前須在火焰上烙燒一下瓶口以使灰塵固定，操作時(shí)須將瓶、管斜放，吸管注入液體應(yīng)避免和瓶口接觸，操作時(shí)禁止講話。 溫度：組織培養(yǎng)的最適溫度為35-37，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝和生長將會(huì)受到影響，甚至導(dǎo)致死亡。培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐受力比高溫強(qiáng)。溫度增加2-3對細(xì)胞產(chǎn)生不良影響，使之在24小時(shí)死亡，溫度在43以上，細(xì)胞大多被殺滅，而低溫對細(xì)胞影響較小，細(xì)胞置于25-35時(shí)，細(xì)胞仍能生存和生長，但速度緩慢，放在4數(shù)小時(shí)之后，再置37培養(yǎng)，細(xì)胞仍能繼續(xù)生長。 氣體：氣體也是細(xì)胞生存的必需條件之一。所需的氣

10、體主要有O2和CO2。O2參與三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量供給細(xì)胞生長、增殖和合成各種成分。CO2既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物也是細(xì)胞所需成分。它主要與維持培養(yǎng)液pH值有直接關(guān)系。 pH值：多數(shù)細(xì)胞的適宜pH值為7.0-7.4，偏離此范圍對細(xì)胞可產(chǎn)生有害的影響。培養(yǎng)液中的緩沖體系主要是碳酸氫鹽/ CO2。細(xì)胞代謝產(chǎn)生的各種酸使pH下降，而培養(yǎng)液中的NaHCO3產(chǎn)生CO2排入空間又使pH增加。 培養(yǎng)器皿的處理：培養(yǎng)器皿處理的好壞與否對于細(xì)胞的貼壁生長影響很大。它們只有貼附于不起化學(xué)作用的物體的表面時(shí)，才能生長、生存或維持功能。目前，常用的器皿主要有玻璃及塑料二大類。玻璃器皿一般須用清潔液浸泡1至7天，清水沖洗20次后

11、再用蒸餾水過洗2次，烤干備用。用前160高溫消毒2小時(shí)后使用。96孔或24孔塑料板一般用2%NaOH浸泡4小時(shí)后，清水洗凈再用1N HCL浸泡4小時(shí)，用清水沖洗后再用蒸餾水漂洗，37干燥后，紫外線燈照射消毒；新橡皮塞須先用1/2NnaOH煮沸15分鐘，沖洗后再用4%HCL煮沸15分鐘，清水沖洗后用蒸餾水洗5次，煮沸10分鐘滅菌，或送高壓滅菌。 總之，細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下可迅速增殖，但若遇到不良環(huán)境細(xì)胞會(huì)變圓，停止生長，甚至死亡，這是細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。綜上所述，細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件主要包括了營養(yǎng)液、無菌條件、PH、溫度、氣體條件和培養(yǎng)器皿的清潔度。培養(yǎng)液水質(zhì)配制培養(yǎng)液前要制備純凈的水。平衡鹽溶液組

12、織培養(yǎng)中所用的各種平衡鹽溶液主要有三個(gè)功效：作為稀釋和灌注的液體，維持細(xì)胞滲透壓;提供緩沖系統(tǒng)，是培養(yǎng)液的酸堿維持在培養(yǎng)細(xì)胞生理范圍內(nèi);提供細(xì)胞正常代謝所需的水分和無機(jī)離子。因此，平衡鹽溶液的組成和含量應(yīng)符合如下條件：要與培養(yǎng)物來源的動(dòng)物血清相近似；呈溶液狀態(tài)，利于物質(zhì)的傳遞和擴(kuò)散；是等滲的，否則會(huì)引起細(xì)胞的收縮（高滲透壓）和膨脹（低滲透壓）.2.2.2無血清培養(yǎng)無血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的完全培養(yǎng)基可以滿足大部分細(xì)胞培養(yǎng)的要

13、求，但對有些實(shí)驗(yàn)卻不適合，如觀察一種生長因子對某種細(xì)胞的作用，這時(shí)需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。無血清培養(yǎng)基的基本配方:基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加了維生素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺、羥基丁酸鈉等成分。無血清培養(yǎng)基的組成及其主要補(bǔ)充成分:激素和生長因子、結(jié)合蛋白、貼壁因子和擴(kuò)展因子、低分子量營養(yǎng)因子、微量元素。特別需要強(qiáng)調(diào)的是：配制無血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因?yàn)闊o

14、血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護(hù)細(xì)胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對細(xì)胞產(chǎn)生致死性損害。這是無血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。為了使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)，關(guān)鍵的是使所培養(yǎng)細(xì)胞： （1）處于對數(shù)生長中期 （2）90% 活細(xì)胞率 （3）適應(yīng)時(shí)以較高的起始細(xì)胞接種3細(xì)胞培養(yǎng)方法與操作3.1細(xì)胞培養(yǎng)方法固定化培養(yǎng)方法在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)細(xì)胞的目的不僅僅要求催化活細(xì)胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)細(xì)胞的目的不僅僅要求催化活力，更重要的是利用細(xì)胞來合成和分泌蛋白，因此如何保持細(xì)胞的活性顯得尤為重要。由于動(dòng)物細(xì)胞的極度敏感性，上述這些固定化方法會(huì)對動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生毒性，另外多糖(如卡拉膠等)由于具有很高

15、的離子強(qiáng)度也會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生毒害。微載體細(xì)胞培養(yǎng)法是一種用于培養(yǎng)錨地依賴性細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。這種培養(yǎng)技術(shù)是在生物反應(yīng)器內(nèi)加入培養(yǎng)液和一種對細(xì)胞無毒害作用的材料支撐的顆粒(微載體)，使細(xì)胞在微載體表面附著和生長，并通過不斷攪拌使微載體保持懸浮狀態(tài)。培養(yǎng)液中大量的微載體為細(xì)胞提供了極大的附著表面，1 g 微載體其比表面積可達(dá)6000 cm2，從而可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高密度培養(yǎng)。微載體的直徑在60250 靘，由天然葡聚糖、凝膠或各種合成的聚合物組成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由這些材料及其改良型制成的微載體主要參考了細(xì)胞的粘附特性，在其表面帶有大量電荷及其他生長基質(zhì)物質(zhì)，因而有利于細(xì)胞的粘附、鋪展和增殖。3

16、.1.1微載體培養(yǎng)原理與操作原理：其原理是將對細(xì)胞無害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長，同時(shí)通過持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。細(xì)胞只有貼附在固體基質(zhì)表面才能增殖，故細(xì)胞在微載體表面的貼附是進(jìn)一步鋪展和生長的關(guān)鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。細(xì)胞能否在微載體表面黏附，要取決于細(xì)胞與微載體的接觸概率和相融性。攪拌轉(zhuǎn)速：由于動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，對剪切力敏感，因而無法靠提高攪拌轉(zhuǎn)速來增加接觸概率。通常的操作方式是：在貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時(shí)攪時(shí)停；數(shù)小時(shí)后，待細(xì)胞附著于微載體表面時(shí)，維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)速，進(jìn)入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，最大速度75r

17、/min。3.1.2蛋白質(zhì)作基質(zhì)的微載體 明膠微載體，用明膠水溶液與疏水性有機(jī)液體如礦物油，明膠混合即聚結(jié)成微珠，繼用戊二醛交聯(lián)，最后用NaBH4還原，即得到淡黃色明膠微載體。這種微載體，具有優(yōu)良的表面性質(zhì)和光學(xué)性質(zhì)，比重略大于水，基質(zhì)是非剛性，無毒，能與多種細(xì)胞自然配位結(jié)合。特別是培養(yǎng)上皮形態(tài)細(xì)胞，如用其他基質(zhì)微載體，收獲細(xì)胞非常困難，但用明膠微載體時(shí)，用膠原酶消化細(xì)胞-微載體，明膠即完全溶解于消化液中，游離細(xì)胞懸浮在液體上層，收獲很容易，且活細(xì)胞收率可達(dá)98%。所以，明膠微載體，是培養(yǎng)貼壁依賴細(xì)胞的一種優(yōu)良微載體。Corning GlassWorks新近修飾了明膠基質(zhì)，合成新的明膠微載體，

18、培養(yǎng)后的細(xì)胞-微載體，用0.13%0。2%胰蛋白酶或0.4%Dispase溶液消化12分鐘，明膠珠即完全溶解。明膠微載體的缺點(diǎn)是能吸附或捕捉培養(yǎng)基中有效營養(yǎng)成分，特別是血清。3.2操作步驟3.2.1細(xì)胞的無血清馴化取處于對數(shù)生長期的貼壁CHO細(xì)胞，活率大于95%，開始進(jìn)行無血清馴化。細(xì)胞馴化在轉(zhuǎn)瓶（spinner-bottle）中進(jìn)行。將無血清細(xì)胞培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基的按1：1（V/V）的比例進(jìn)行混合，接種密度為2105cells/ml的細(xì)胞，在37、5CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。 根據(jù)細(xì)胞生長和活率情況，在降血清的每一階段可穩(wěn)定傳代13代，接種密度維持在2105cells/ml。逐步提高無血清細(xì)胞

19、培養(yǎng)基在混合液中的比例（V/V），即降低混合液中的血清含量，傳代過程的細(xì)胞接種密度仍維持為2- 4105cells/ml。直至混合液中的血清濃度降低至0.1-0.2%，每一代的細(xì)胞活率大于90后，此時(shí)可將細(xì)胞完全培養(yǎng)在CHO無血清無動(dòng)物組分培養(yǎng)基中。在CHO無血清無動(dòng)物組分培養(yǎng)基中進(jìn)行放大培養(yǎng)，建立起適應(yīng)無血清無動(dòng)物組分培養(yǎng)的CHO種子細(xì)胞庫。 連續(xù)適應(yīng)分好幾步把細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到SAF-CHO-G-004細(xì)胞培養(yǎng)基中，與直接適應(yīng)相比較，連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩?xì)胞更加溫和一些。（1）以2倍正常接種密度接種生長活躍的物到75%有血清培養(yǎng)基：25SAF-CHO-G-004細(xì)胞培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)

20、。 （2）當(dāng)細(xì)胞密度5105細(xì)胞/ml時(shí)，以2105到3105細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，在有血清培養(yǎng)基：SAF-CHO-G-004細(xì)胞培養(yǎng)基為5050的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。 （3）以2106到3106細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，25有血清培養(yǎng)基和75% SAF-CHO-G-004細(xì)胞培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。 （4）當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1106到3106細(xì)胞/ml（接種后4到6天），在100SAF-CHO-G-004細(xì)胞培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。 （5）每隔3到5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1106到3106細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90時(shí)，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。 建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物，直到每一次細(xì)胞適應(yīng)了

21、新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前，可能需要在SAF-CHO-G-004細(xì)胞培養(yǎng)基/有血清混合培養(yǎng)基中進(jìn)行幾次傳代。在適應(yīng)過程中，最好不要讓細(xì)胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SAF-CHO-G-004細(xì)胞培養(yǎng)基包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界因素的影響。3.2.2微載體培養(yǎng)種子細(xì)胞將上述CHO細(xì)胞（成功用無血清馴化后的細(xì)胞）用0.25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液后，用培養(yǎng)基調(diào)整接種細(xì)胞濃度為3105/mL。沿導(dǎo)流管加入含明膠微載體和SAF-CHO-G-004細(xì)胞培養(yǎng)基的WhcltonBioster瓶罐中37，50 r/min 攪拌30分鐘靜置30分鐘（37

22、）。37，50 r/min 攪拌2分鐘再靜置24小時(shí)（37）（以利細(xì)胞貼附） 、37，50 r/min 持續(xù)攪拌培養(yǎng)每天換液1/23/4量，并取樣23mL，行染色計(jì)數(shù)連續(xù)培養(yǎng)三天細(xì)胞在明膠微載體上生長良好，經(jīng)計(jì)數(shù)可達(dá)1106/ml細(xì)胞濃度，擴(kuò)增了三倍?；具_(dá)飽和密度，此時(shí)可以消化傳代，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。3.2.3微載體培養(yǎng)的細(xì)胞傳代連續(xù)培養(yǎng)3天左右，細(xì)胞已基本在載體上鋪滿，已達(dá)飽和，此時(shí)為了擴(kuò)大生產(chǎn)細(xì)胞，采用胰酶檸檬酸鹽消化，并進(jìn)行高速攪拌，可成功地將CHO細(xì)胞從載體上解離，取樣檢查，計(jì)算解離率。即消化前先取樣染色計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)為分母，消化后取細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)為分子，兩者進(jìn)行比較即得解離率。結(jié)

23、果解離率可達(dá)69%，當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增至34倍時(shí)，消化解離效果好。解離的細(xì)胞又可擴(kuò)大再吸附，再進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞密度又可達(dá)1106/mL。3.3半連續(xù)式培養(yǎng)（semi-continuous culture） 操作半連續(xù)式培養(yǎng)又稱為重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形式。在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時(shí)間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補(bǔ)足到原有體積，使反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變。 這種類型的操作是將細(xì)胞接種一定體積的培養(yǎng)基，讓其生長至一定的密度，在細(xì)胞生長至最大密度之前，用新鮮的培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物，每次稀釋反應(yīng)器培養(yǎng)體積的1/23/4，以維持細(xì)胞的指數(shù)生長狀態(tài)，

24、隨著稀釋率的增加培養(yǎng)體積逐步增加。或者在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每隔一定時(shí)間，定期取出部分培養(yǎng)物，或是條件培養(yǎng)基，或是連同細(xì)胞、載體一起取出，然后補(bǔ)加細(xì)胞或載體，或是新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)的一種操作模式。剩余的培養(yǎng)物可作為種子，繼續(xù)培養(yǎng)，從而可維持反復(fù)培養(yǎng)，而無需反應(yīng)器的清洗、消毒等一系列復(fù)雜的操作。在半連續(xù)式操作中由于細(xì)胞適應(yīng)了生物反應(yīng)器的培養(yǎng)環(huán)境和相當(dāng)高的接種量，經(jīng)過幾次的稀釋、換液培養(yǎng)過程，細(xì)胞密度常常會(huì)提高。 用明膠微載體系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的放大：可通過增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進(jìn)行在DMEM-無血清培養(yǎng)基中用半連續(xù)式培養(yǎng)（semi-continuous culture） 操作進(jìn)行放

25、大。4細(xì)胞培養(yǎng)過程中檢測4.1細(xì)胞生長的檢測細(xì)胞計(jì)數(shù) 消化后的細(xì)胞要加入培養(yǎng)液中，制成一定濃度的細(xì)胞懸液，在分裝入培養(yǎng)容器之前，需計(jì)算出細(xì)胞懸液的濃度，即細(xì)胞數(shù)/L懸液。另外也應(yīng)測定細(xì)胞生活狀態(tài)，區(qū)別出活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)，只有活細(xì)胞才有效數(shù)值，計(jì)算出細(xì)胞濃度后，根據(jù)擬分裝的瓶數(shù)和所需濃度，再將細(xì)胞懸液稀釋進(jìn)行培養(yǎng)?；铙w染色 臺盼藍(lán)活體染色簡單易行，是常用檢查細(xì)胞存活的方法，用臺盼藍(lán)染液，染后可見死細(xì)胞染成均勻的藍(lán)色，活體細(xì)胞不著色。細(xì)胞計(jì)數(shù) 用血球計(jì)數(shù)板做細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)情況用營養(yǎng)液稀釋與否均可。做法是用吸管吸取少許染色的細(xì)胞懸液滴于計(jì)數(shù)板上，使懸液自由充滿蓋片下方間隙，勿留氣泡。稍后片刻，鏡下觀

26、察并計(jì)算出四角大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，壓線只計(jì)上線和右線的細(xì)胞，然后按下式計(jì)算出細(xì)胞濃度：細(xì)胞數(shù)/L原液=四角大格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)/4*10000*稀釋倍數(shù)4.2細(xì)胞常數(shù)檢查細(xì)胞生長 初代組織培養(yǎng)或細(xì)胞懸液接種以后，都有一個(gè)長短不同的潛伏期。一般在第二天就可見細(xì)胞生長，一周就可接連成片。細(xì)胞生長的四個(gè)階段游離期：剛接種后，細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回收，胞體變圓形。吸附期：為細(xì)胞貼附于培養(yǎng)壁過程。繁殖期：生長期。退化期：當(dāng)細(xì)胞長滿瓶壁以后，如不及時(shí)做傳代，由于營養(yǎng)物消耗和代謝物積累，細(xì)胞進(jìn)入退化期。細(xì)胞形態(tài) 生長良好的細(xì)胞，在一般顯微鏡下觀察時(shí)透明度大，輪廓不清，只有用相差顯微鏡，才能看見細(xì)胞

27、的細(xì)微形態(tài)。營養(yǎng)液：在正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色4.3CHO細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)污染物的檢測4.3.1細(xì)菌污染對培養(yǎng)細(xì)胞的影響及污染物的檢測常見的污染細(xì)菌有大腸桿菌、假單孢菌、葡萄球菌等。細(xì)菌污染初期由于培養(yǎng)體系的抗生素作用，其繁殖處于抑制狀態(tài)，細(xì)胞生長不受明顯影響，污染情況用倒置顯微鏡觀察不易判斷。懷疑培養(yǎng)細(xì)胞有細(xì)菌污染時(shí)，取10ml細(xì)胞懸液離心1000轉(zhuǎn)5分鐘，沉淀中加入無抗生素培養(yǎng)液2ml,將細(xì)胞放培養(yǎng)箱培養(yǎng)。如果培養(yǎng)無真的細(xì)菌污染，24小時(shí)內(nèi)可以獲得陽性結(jié)果。當(dāng)污染的細(xì)菌量比較大或者細(xì)菌增殖到一定基數(shù)時(shí)，大約每20分鐘一代，會(huì)使培養(yǎng)系統(tǒng)中很快產(chǎn)生大量細(xì)菌，后者不僅可以消耗培養(yǎng)系統(tǒng)中的養(yǎng)分，還能釋

28、放大量代謝產(chǎn)物。幾個(gè)小時(shí)后，增殖的細(xì)菌就可以導(dǎo)致培養(yǎng)液外觀渾濁，肉眼就可以判斷。細(xì)菌污染大多數(shù)可以改變培養(yǎng)液pH，使培養(yǎng)液變渾濁、變色。用相差顯微鏡觀察，可見滿視野都是點(diǎn)狀的細(xì)菌顆粒，原來的清晰培養(yǎng)背景變得模糊，大量的細(xì)菌甚至可以覆蓋細(xì)胞，對細(xì)胞的生存構(gòu)成威脅。用青霉素、鏈霉素可以預(yù)防細(xì)菌污染有效。4.3.2真菌污染對細(xì)胞的影響及污染物的檢測微生物污染中以真菌最多，真菌種類繁多，形態(tài)各異，但是污染后易于發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見；有的散在生長，鏡下可見呈絲狀、管狀、樹枝狀，縱橫交錯(cuò)穿行于細(xì)胞之間。念珠菌和酵母菌卵圓形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長。真菌生長迅速，能在短

29、時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)胞生長、產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺死細(xì)胞?？拐婢苿︻A(yù)防和排除真菌污染有效。4.3.3支原體污染對細(xì)胞影響及污染物的檢測細(xì)胞培養(yǎng)（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是個(gè)世界性問題,是細(xì)胞培養(yǎng)最常見的、干擾試驗(yàn)結(jié)果的一種污染。但由于不易被察覺，有些污染的細(xì)胞仍在被應(yīng)用。研究表明，95以上是以下四種：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。以上是最常見的污染細(xì)胞培養(yǎng)的支原體菌群，但能夠污染細(xì)胞的支原體種類是很多的，國外調(diào)查證明，大約有二十多種支原體能污染細(xì)胞，有的細(xì)胞株可以同時(shí)污染兩種

30、以上的支原體。據(jù)查，目前各實(shí)驗(yàn)室使用的二倍體細(xì)胞和傳代細(xì)胞中約有11%的細(xì)胞受到支原體污染。5抗凋亡策略在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應(yīng)用 生物反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)過程中，細(xì)胞凋亡在細(xì)胞死亡中占主要部分。最近研究顯示在大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器中細(xì)胞的死亡中80%是凋亡所導(dǎo)致,而不是以前所認(rèn)為的壞死。而在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞死亡是維持細(xì)胞高活性和高密度的最大障礙。理論上講，防止或延長細(xì)胞死亡，可以極大提高生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白的產(chǎn)量。 細(xì)胞凋亡由一系列基因精確地調(diào)控，是多細(xì)胞生物發(fā)育和維持穩(wěn)態(tài)所必需的生理現(xiàn)象。已知凋亡的最終執(zhí)行者是Caspase家族，它們均為半胱氨酸蛋白酶，各識別一個(gè)4氨基酸序列，并在

31、識別序列C端天冬氨酸殘基處將底物切斷。Caspase含有可被自身識別的序列，可以切割活化自身而導(dǎo)致信號放大，并作用于下游Caspase成員，從而形成Caspase家族的級聯(lián)放大，最終作用于效應(yīng)蛋白，引起細(xì)胞凋亡。 5.1 營養(yǎng)物質(zhì)抗凋亡 在常規(guī)生物反應(yīng)器構(gòu)造中，營養(yǎng)耗竭或缺乏培養(yǎng)基中特殊的生長因子則引起凋亡，例如血清，糖或特殊氨基酸的耗盡。培養(yǎng)基中添加氨基酸或其它關(guān)鍵營養(yǎng)可抑制凋亡、延長培養(yǎng)時(shí)間從而提高產(chǎn)品的生產(chǎn)。大規(guī)模培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡主要由于營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭或代謝產(chǎn)物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補(bǔ)加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動(dòng)物細(xì)胞在無血清、無蛋白培養(yǎng)基

32、中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。 5.2 基因抗凋亡 與凋亡相關(guān)的一系列基因產(chǎn)物可對其進(jìn)行正、負(fù)向的調(diào)控，因此可通過導(dǎo)入相應(yīng)基因來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。Bcl-2基因是目前最為有效的抗凋亡基因，在多種細(xì)胞系中均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗凋亡活性。 5.3 化學(xué)方法抗凋亡 凋亡發(fā)生時(shí)細(xì)胞許多部位發(fā)生生化物質(zhì)的改變，有些變化如改變細(xì)胞氧化還原條件產(chǎn)生活性氧在凋亡信號階段發(fā)生，其它的如破壞線粒體膜電位、激活caspase則發(fā)生在凋亡效應(yīng)階段，這在絕大多數(shù)細(xì)胞死亡中是相同的。因此,阻止這些生化物質(zhì)的改變可能阻止或至少延遲細(xì)胞凋亡的發(fā)生，運(yùn)用化學(xué)物質(zhì)可抑制信號效應(yīng)階段的發(fā)生，被認(rèn)為是抗調(diào)亡策略之一。展望通過幾十年的發(fā)展至今，CHO細(xì)胞已成為生物技術(shù)藥物最重要的表達(dá)或生產(chǎn)系統(tǒng)，這種局面人將持續(xù)并且其所占比例有逐年增大趨勢。CHO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)及其生物反應(yīng)器工程可廣泛應(yīng)用于抗體、基因重組蛋白質(zhì)藥物、病毒疫苗等生物技術(shù)產(chǎn)品的研究開發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)。國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)及其生物反應(yīng)器工程研究和開發(fā)應(yīng)用方面，長期以來得到國家重大科技攻關(guān)計(jì)劃、863計(jì)劃等的大力支持，擁有一支精干的研究開發(fā)團(tuán)隊(duì)