簡答植物組織培養(yǎng)

1、（一）、某培養(yǎng)基的配方是MSBA 1.5 mg/LNAA2.5 mg/LIBA 1.0 mg/L+ 2.5%蔗糖0.7瓊脂粉。MS母液的濃度分別是：大量元素50倍，微量元素100倍，鐵鹽20倍，有機物100倍；BA母液濃度1.0 mg/ml ，NAA母液濃度0.5mg/ml，IBA母液濃度0.2mg/ml。要配制800ml該培養(yǎng)基，需要吸取各種母液各多少ml？分別稱取蔗糖、瓊脂粉各多少克？（要求寫出計算步驟）1.BA=0.8*1.5/1=1.2ml 2.NAA=0.8*2.5/0.5=4ml 3.IBA=0.8*1/0.2=4ml4.蔗糖=800*2.5%=20g 5.瓊脂粉=800*0.7%

2、=5.6g（二）、如何減輕試管苗玻璃化現(xiàn)象？如何防止外植體的真菌污染？1. （1）利用固體培養(yǎng)方法，增加瓊脂濃度，降低培養(yǎng)基中的滲透勢，造成細胞吸水阻遏。或提高培養(yǎng)基中蔗糖含量或加入滲透劑，減少培養(yǎng)基中植物材料可獲得的水分，這也可以抑制玻璃化的發(fā)生。 （2） 適當降低培養(yǎng)基中的細胞分裂素和赤霉素的濃度?；蛘撸m當增加培養(yǎng)基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Zn元素含量，降低N和CL元素比例，特別是降低胺態(tài)氮的濃度，提高硝態(tài)氮量。（3）增加自然光照。 因為自然光中的紫外線能促進試管苗成熟。（4）改善培養(yǎng)器皿的氣體交換狀態(tài)封口膜（5）在培養(yǎng)基中添加其他物質(zhì)。如添加馬鈴薯汁可降低油菜的玻璃苗的

3、產(chǎn)生頻率。2.在接種前要求無菌室內(nèi)做到用空氣循環(huán)過濾裝置使空氣過濾滅菌或通過紫外線照射滅菌外，再利用超凈工作臺接種前，應(yīng)開機15min以達到空氣的充分過濾滅菌。而且接種時嚴格操作，如在接種前去掉橡皮筋，打開棉塞時動作要輕及去掉瓶塞后瓶子應(yīng)拿成斜角，最好瓶口放在酒精火焰的前方等等（三）、簡答出一般莖段是怎樣選材消毒和接種的？ 選材：較幼嫩的材料，器官的生理狀態(tài)和發(fā)肓年齡，外植體的大小為0.51.0cm消毒：自來水較長時間沖洗+70%酒精浸泡植物種+無菌水沖洗23次+2%10%NaClO（0.1%HgCl2）12min+無菌水沖洗3次。（第三章5頁）接種：左手拿三角瓶或果醬瓶，用右手輕輕取下封口膜

4、或蓋子將三角瓶或果醬瓶的口靠近酒精燈火焰，瓶口稍微傾斜，這樣瓶口外部在火焰上旋轉(zhuǎn)灼燒數(shù)秒鐘，后用鑷子將外植體送入瓶中。一植物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵是什么？1.無毒無菌的環(huán)境2.生長素或生長素類似物3.通常用固體培養(yǎng)基(瓊脂)4.先進行植物組織或器官的脫分化5.長出根來后要保證根呼吸所需氧氣二植物外植體的表面消毒劑種類1、漂白粉（1%10%的濾液）2、次氯酸鈉溶液（0.5%10%）3、氯化汞（0.1%1%）4、酒精（70%75%）5、過氧化氫（3%10%）6、新潔爾滅等。三植物組織培養(yǎng)技術(shù)的常見難題及防治方法。1污染問題：分為細菌和真菌 1）外植體的滅菌要徹底 . 要獲得完全 無菌的接種材料2）嚴格

5、遵守?zé)o菌操作規(guī)程 3）加入抗生素 4）無菌培養(yǎng) 5）控制外植體的接種數(shù)量 6）一旦發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有了污染的苗頭，最好馬上轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基上 2 外植體和愈傷組織的褐化問題 選擇適宜的外植體及最佳培養(yǎng)基對于易褐變的材料注意改善培養(yǎng)條件，并進行連續(xù)轉(zhuǎn)接，勤換新鮮培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑，如抗壞血酸、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白等。在培養(yǎng)基中加入吸附劑，如：活性炭。 3 玻璃化的問題 （1）利用固體培養(yǎng)方法，增加瓊脂濃度，降低培養(yǎng)基中的滲透勢，造成細胞吸水阻遏。或提高培養(yǎng)基中蔗糖含量或加入滲透劑，減少培養(yǎng)基中植物材料可獲得的水分，這也可以抑制玻璃化的發(fā)生。 （2） 適當降低培養(yǎng)基中的細胞分裂素和赤霉

6、素的濃度?；蛘撸m當增加培養(yǎng)基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Zn元素含量，降低N和CL元素比例，特別是降低胺態(tài)氮的濃度，提高硝態(tài)氮量。（3）增加自然光照。 因為自然光中的紫外線能促進試管苗成熟。（4）改善培養(yǎng)器皿的氣體交換狀態(tài)封口膜（5）在培養(yǎng)基中添加其他物質(zhì)。如添加馬鈴薯汁可降低油菜的玻璃苗的產(chǎn)生頻率。 四活性炭、蔗糖在組織培養(yǎng)中的作用。1.促進芽的增殖、莖和苗的生長。在莖尖培養(yǎng)和莖段培養(yǎng)時，為防止褐變和有害物質(zhì)的積累，常在培養(yǎng)基中加入適量活性炭。2.用于生根培養(yǎng)基?；钚蕴孔顝V泛的應(yīng)用是用于培養(yǎng)物的生根。一般認為活性炭創(chuàng)造的黑暗環(huán)境有利于根的誘導(dǎo)和根系的生長。3.用于胚培養(yǎng)，促進成

7、苗?；钚蕴靠购只Ч葯幟仕?、聚乙烯吡咯烷酮效果都好。4.用于花藥培養(yǎng)?；ㄋ幣囵B(yǎng)的主要目的是誘導(dǎo)花粉發(fā)育成單倍體，可以快速地獲得純系，縮短育種周期。五病毒在植物體內(nèi)的運轉(zhuǎn)方式。從細胞到細胞的短距離運轉(zhuǎn)，經(jīng)過細胞間的胞間連絲向鄰近細胞中擴散，速度很慢。煙草普通花葉病毒運轉(zhuǎn)速度為6-13m/h。長距離運轉(zhuǎn)，通過寄主植物韌皮部的輸導(dǎo)組織隨著營養(yǎng)輸送進行轉(zhuǎn)移,速度很快。一旦病毒進入韌皮部，運轉(zhuǎn)速度突然增快。例如：水稻條紋葉枯病毒運轉(zhuǎn)速度為25cm/h。六花藥和花粉培養(yǎng)與單倍體的關(guān)系。培養(yǎng)花粉粒的單倍體植株，并使單倍體加倍，作為育種材料的來源?；ǚ壑仓杲?jīng)染色體加倍而來的二倍體，在遺傳上是純合的，其自交后

8、代不再分離，縮短育種周期。七懸浮培養(yǎng)的材料必須達到的要求。一般條件下，以幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織為最佳（質(zhì)量好，分化能力強）。用顆粒細小，疏松易碎，外觀濕潤，鮮艷的白色或黃色的愈傷組織，比較疏松易碎，經(jīng)過幾次篩選，繼代全穩(wěn)定后，可以用于誘導(dǎo)懸浮細胞系。八植物組織培養(yǎng)技術(shù)的主要用途。植物組織培養(yǎng)技術(shù)是近代生物科學(xué)發(fā)展起來的一門新技術(shù)，是生物技術(shù)(即生物工程）的主要組成部分，是在超凈的組培室中進行快繁脫毒即工廠化的裁培室中進行規(guī)模生產(chǎn)。自從問世以來，對農(nóng)業(yè)、林業(yè)、蔬菜、果樹、花卉以及藥用植物新品種培育，品種脫毒，提純復(fù)壯，快速無性繁殖，擴大種苗生產(chǎn)均產(chǎn)生了劃時代影響。1）在植物育種中的應(yīng)用2）在植物脫毒

9、和離體快繁中的應(yīng)用3）在次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)中的應(yīng)用4）在植物種質(zhì)資源保存和交換中的應(yīng)用5）在遺傳、生理、生化、病理等研究中的應(yīng)用九原生質(zhì)體的融合方式和純化步驟融合方式：自發(fā)融合：在溶解細胞壁過程中，有些原生質(zhì)體能彼此融合形成同核體。誘導(dǎo)融合：用物理或化學(xué)的方法來誘導(dǎo)原生質(zhì)體的融合。步驟：兩個或多個原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近，局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合，融合完成，形成球形的異核體或同核體。純化：沉淀物重新懸浮于清洗培養(yǎng)基中，在50g離心3-5min后再懸浮，如此反復(fù)洗滌2-3次。為了純化出有活力的原生質(zhì)體，將沉淀懸浮于少量清洗培養(yǎng)基，置于含有蔗糖溶液（21%）的上部，在100g下離心5-10min

10、后，在蔗糖溶液和原生質(zhì)體懸浮培養(yǎng)基的界面上會出現(xiàn)一個純凈的原生質(zhì)體帶，將此帶吸收后，再反復(fù)洗滌2次，最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)基洗一次。10、植物離體保存的主要步驟一 、常溫保存：在常溫（205）下，通過改變培養(yǎng)基中某些培養(yǎng)物質(zhì)的濃度，改變培養(yǎng)的環(huán)境條件，可達到保存目的。在保存材料上覆蓋一層礦物油如石蠟、硅酮油或液態(tài)石油。降低培養(yǎng)環(huán)境的氧分壓。二 、常低溫和低溫保存：常低溫（15-0 ）和低溫（0- -50 ）保存，還可輔以改變培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，以減緩材料的生長速度減緩繼代時間，故又稱為最小生長法。 根據(jù)植物對溫度的耐受力確定其抑制生長的保存溫度。在低 溫保存時還可以結(jié)合低壓來取得更好的效果主要通

11、過降低培養(yǎng)物周圍的大氣壓，也可以通過在正常的氣壓下加入惰性氣體而降低氧分壓。低氣壓和低氧壓都可抑制植物的生長，但不會導(dǎo)致培養(yǎng)物表現(xiàn)型上的差異。三 、超低溫保存：快速冷凍法：適用于培養(yǎng)物細胞體能小，胞質(zhì)濃、含水量低、液泡化程度低的材料。將植物材料從0或其他預(yù)處理溫度直接投入液氮罐中，降溫速度為1000/min以上。這種快速降溫可使細胞內(nèi)的水在迅速越過-140這一冰晶形成的危險溫度期后，細胞內(nèi)的水形成“玻璃化”狀態(tài)，不會對細胞產(chǎn)生破壞作用。慢速冷凍法：適用于含有大液泡的成熟細胞，這種細胞含水量高，在慢速降溫過程中，可以使細胞內(nèi)的水有充足的時間不斷地滲到細胞外結(jié)冰而避免在細胞內(nèi)結(jié)冰。將植物材料以0.

12、110/min的降溫速度從0降到-100左右，而后立即浸入液氮罐中或以同樣的速度連續(xù)降溫至-196。脫水干燥法：將培養(yǎng)材料的含水量降到一定程度，在進入液氮罐中，這樣可使植物免遭凍死。無菌氣流中干燥、硅膠干燥、2129烘箱內(nèi)真空干燥法等方法將含水量降到27-40%。玻璃化法：用高濃度的復(fù)合玻璃化保護劑使樣品脫水減輕機械損傷和溶液效應(yīng)，應(yīng)用價值高。包埋脫水法：將樣品用高濃度的蔗糖進行預(yù)處理，包埋到海藻酸膠中，避免了二甲亞砜和甘油的毒性。11、防止外植體的真菌污染在接種前要求無菌室內(nèi)做到用空氣循環(huán)過濾裝置使空氣過濾滅菌或通過紫外線照射滅菌外，再利用超凈工作臺接種前，應(yīng)開機15min以達到空氣的充分過

13、濾滅菌。而且接種時嚴格操作，如在接種前去掉橡皮筋，打開棉塞時動作要輕及去掉瓶塞后瓶子應(yīng)拿成斜角，最好瓶口放在酒精火焰的前方等等。12、培養(yǎng)基的配制基本方法（1）首先在燒杯內(nèi)放一定量的蒸餾水，以免加入藥液時濺出。（2）再按母液順序，根據(jù)不同母液的不同倍數(shù)取規(guī)定的量。（3）加完后一并倒入已溶化的瓊脂中，再放入蔗糖，定容至所需體積，繼續(xù)加溫并不斷攪拌，待瓊脂煮透后端離火源，根據(jù)培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)基體積加入所需要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。（4）當培養(yǎng)基配制好后應(yīng)立即進行PH值的調(diào)整。最好用酸度計。如無條件也可用精密PH試紙， pH值可用1mol L-1KOH（或NaOH）溶液和2mol L-1HCI調(diào)整。（5）配

14、制好的培養(yǎng)基要趁熱分裝，分裝時可采用燒杯漏斗直接分注。一般以占試管或三角瓶等培養(yǎng)容器的1/41/3為宜。（6）由于未經(jīng)滅菌處理的培養(yǎng)基既可能帶有各種雜菌，同時又是各種雜菌良好的生長繁殖場所，因此培養(yǎng)基分裝后應(yīng)立即置于滅菌鍋內(nèi)進行滅菌（7）高壓滅菌后的培養(yǎng)基凝固后，宜將培養(yǎng)基放倒培養(yǎng)室中預(yù)培養(yǎng)23天若沒有雜菌污染才可放心使用。13、植物脫毒程序、途徑和鑒定方法。程序：利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，脫除植物細胞中浸染的病毒，生產(chǎn)健康的繁殖材料。 途徑：植物莖尖培養(yǎng)脫毒法提高脫毒效果：熱處理脫毒法和莖尖脫毒法相結(jié)合。 化學(xué)處理脫毒法和莖尖脫毒法相結(jié)合。鑒定方法：1 直接鑒定法直接觀察植株莖葉有無某種病毒引起

15、的可見癥狀2 生物鑒定法（敏感植物鑒定法）有些植物對病毒極為敏感，一旦感染病毒就會在其葉片乃至全株上表現(xiàn)特有的病斑，把這種植物稱為病毒敏感植物或指示植物。3 抗血清鑒定法當動物被病毒感染或人工注射異體蛋白質(zhì)時，一種特異性丙種球蛋白稱為免疫球蛋白體在特殊細胞內(nèi)形成，進入血液存在于血清和體液內(nèi)。這種含有特異性“抗體”的血清稱為“抗血清”。4 電子顯微鏡鑒定法 用電鏡直接觀察經(jīng)脫毒培養(yǎng)的葉片，檢查是否有病毒質(zhì)粒的存在，還可以測量病毒顆粒的大小、形狀和結(jié)構(gòu)。5 分子檢測法將待測樣品的總RNA與cDNA合成的試劑盒進行反應(yīng)，合成cDNA，然后利用病毒DNA特有的序列設(shè)計引物進行PCR反應(yīng)，即可知道在寄主

16、中是否有病毒基因的存在及表達。莖段消毒方法和過程。自來水較長時間沖洗+70%酒精浸泡植物種+無菌水沖洗23次+2%10%NaClO（0.1%HgCl2）12min+無菌水沖洗3次六、論述題為什么莖尖培養(yǎng)可獲得無特定病毒植株？怎樣獲得無特定病毒的試管苗？獲得的無病毒苗用一種方法鑒定其真的無特定病毒的植株？1）感染病毒植株的體內(nèi)病毒的分布并不均勻，病毒的數(shù)量隨植株部位及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域的病毒的感染深度越低，生長點則幾乎不含或含病毒很少。2）1.了解植物攜帶何種病毒，病毒在體內(nèi)的分布位置2.母體植株的選擇和預(yù)處理3.莖尖的剝離4.脫毒效果檢測3）取培養(yǎng)植株的葉片置于研缽中，加入少量的水和等量的0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.0），磨成勻獎，將其涂抹在指示植株葉片上，在指示植物的葉片撒上金剛砂，通過輕輕摩擦使汁浸入葉片表皮細胞而又不損傷葉片。5分鐘后用清水清洗葉面