第12章 轉(zhuǎn)基因、基因敲除和RNA干涉.ppt

1、第十二章 基因敲除和RNA干涉,內(nèi)容,第一節(jié) 基因敲除,基因敲除（gene knock-out）又稱(chēng)基因打 靶，通過(guò)外源DNA與染色體DNA之間的同源重 組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造，具有 專(zhuān)一性強(qiáng)、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn) 定遺傳等特點(diǎn)。,二、基因敲除技術(shù),定義：通過(guò)一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。,1、應(yīng)用DNA同源重組原理進(jìn)行基因敲除。,2、利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除,3、RNA干擾也可以引起基因敲除,基因敲除技術(shù)與諾貝爾獎(jiǎng),醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的諾貝爾獎(jiǎng)（2007年）已經(jīng)揭曉。三位在基因敲除技術(shù)方面進(jìn)行了卓越、開(kāi)拓性工作并取得了顯著成就的科學(xué)家分享了諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，他們

2、是美國(guó)鹽湖城猶他州大學(xué)的Marie Capecchi教授、美國(guó)北卡羅來(lái)納州大學(xué)的Oliver smithies教授以及英國(guó)加蒂夫大學(xué)的Martin Evans教授 摘自中華醫(yī)學(xué)信息 2007年第22卷第21期,基因敲除分為完全基因敲除和條件型基因敲 除（又稱(chēng)不完全基因敲除）兩種。 完全基因敲除是指通過(guò)同源重組法完全消除 細(xì)胞或者動(dòng)物個(gè)體中的靶基因活性，條件型 基因敲除是指通過(guò)定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間和空間的基因敲除。,一、實(shí)現(xiàn)基因敲除的多種原理和方法,1 利用基因同源重組進(jìn)行基因敲除 基因敲除是80年代后半期應(yīng)用DNA同源重組原理發(fā)展起來(lái)的。80年代初，胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成

3、功奠定了基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。 1985年，首次證實(shí)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎(chǔ)。 到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型。 直到現(xiàn)在，運(yùn)用基因同源重組進(jìn)行基因敲除依然是構(gòu)建基因敲除動(dòng)物模型中最普遍的使用方法。,步驟,基因載體的構(gòu)建 ES 細(xì)胞的獲得 同源重組 選擇篩選已擊中的細(xì)胞 表型研究 得到純合體,1、條件性基因敲除法,條件性基因敲除法可定義為將某個(gè)基因的修飾限制于小鼠某些特定類(lèi)型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法,噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)、酵母 細(xì)胞的FLP/FRT系統(tǒng)，尤以Cre/Loxp系統(tǒng) 應(yīng)用最為廣

4、泛。,2、4誘導(dǎo)性基因敲除法,誘導(dǎo)性基因敲除也是以Cre/loxp 系統(tǒng)為基礎(chǔ)，但卻是利用控制Cre 表達(dá)啟動(dòng)子的活性或所表達(dá)的Cre 酶活性具有可誘導(dǎo)的特點(diǎn) 幾種誘導(dǎo)性類(lèi)型如下：四環(huán)素誘導(dǎo)型(圖4)；干擾素誘導(dǎo)型；激素誘導(dǎo)型；腺病毒介導(dǎo)型, 誘導(dǎo)基因突變的時(shí)間可人為控制； 可避免因基因突變而致死胎的問(wèn)題 在2 個(gè)loxP 位點(diǎn)之間的重組率較高；如用病毒或配體DNA 復(fù)合物等基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)來(lái)介導(dǎo)Cre 的表達(dá)，則可省去建立攜帶Cre 的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的過(guò)程。,二、隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除,細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫(kù)，然后通過(guò)相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞

5、 逆轉(zhuǎn)率病毒可用于動(dòng)植物細(xì)胞的插入；對(duì)于植物細(xì)胞而言農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)座子比較常用；噬菌體可用于細(xì)菌基因敲除,基因捕獲法,最近發(fā)展起來(lái)的利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除的新型方法 neo 基因插入到ES 細(xì)胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件實(shí)現(xiàn)表達(dá) 中靶基因的信息可以通過(guò)篩選標(biāo)記基因側(cè)翼cDNA或染色體組序列分析來(lái)獲得,基因捕獲法的優(yōu)缺點(diǎn),建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的ES 細(xì)胞庫(kù) 節(jié)省大量篩選染色體組文庫(kù)以及構(gòu)建特異打靶載體的工作及費(fèi)用 更有效和更迅速地進(jìn)行小鼠染色體組的功能分析,第二節(jié) RNA干涉,概念 原理,概念,這種向生物體中導(dǎo)入雙鏈RNA 后,引起生物體內(nèi)同源基因沉默(

6、silencing) 的現(xiàn)象稱(chēng)作RNA 干涉 自然條件下，RNA 干涉對(duì)于抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)、生物體的發(fā)育和基因表達(dá)調(diào)控都有重要作用,RNAi阻斷基因表達(dá)的機(jī)理,雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后，能夠在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA 雙鏈RNA還能在RdRP 的作用下自身擴(kuò)增后，再被Dicer酶裂解成siRNA SiRNA的雙鏈解開(kāi)變成單鏈，和已知蛋白形成復(fù)合物（Argonaute2）結(jié)合，復(fù)合物同與siRNA互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，一方面使mRNA被RNA酶裂解， 以SiRNA作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互補(bǔ)鏈。結(jié)果mRNA也變成了雙鏈RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。 這些新生成的siRNA也具有誘發(fā)RNAi的作用，通過(guò)這個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，細(xì)胞內(nèi)的siRNA大大增加， 長(zhǎng)的雙鏈RNA阻斷基因表達(dá)的效果明顯強(qiáng)于短的雙鏈RNA,步驟,設(shè)計(jì)反向DNA序列 重組載體 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 檢測(cè)目的