免疫毒性試驗.doc

1、免疫毒性試驗的指導(dǎo)原則（草案）本指導(dǎo)原則是為了有助于藥品安全性的正確評價，對申報藥品審評時所做免疫毒性試驗提供的標(biāo)準(zhǔn)實施方法。但是。對于所有的藥品進(jìn)行完全一樣的免疫毒性試驗，有時也不盡合理，重要的是：應(yīng)根據(jù)對象藥品的特性采用最適宜的試驗方法。背景在清除細(xì)菌和病毒等外來病原體以及體內(nèi)產(chǎn)生的癌細(xì)胞等，并維持生體正常的過程中，免疫系統(tǒng)起著重要的作用。免疫功能低下容易導(dǎo)致機會感染和產(chǎn)生腫瘤，這在免疫功能缺乏癥和獲得性免疫功能缺乏綜合征（AIDS）的病例中是人們所熟知的。對免疫系統(tǒng)的有害作用（免疫毒性）與其他毒性不同，與其說是其直接對患者的生存帶來威脅，不如說由外來病原體的侵襲和內(nèi)在性癌細(xì)胞的發(fā)生時產(chǎn)生

2、的免疫毒性更有害。關(guān)于藥品審評申報的非臨床免疫毒性試驗，雖然指出了其重要性，但是，構(gòu)成免疫系統(tǒng)的細(xì)胞組織及其相互作用是復(fù)雜的，免疫功能的評價項目很多，除小鼠之外的試驗動物，特別是毒性試驗中通常使用的大鼠，其免疫功能試驗方法的評價尚未充分進(jìn)行，這些都是實情，而且免疫功能試驗方法的設(shè)定較遲。然而，近十年間，包括國際性的共同研究，免疫毒性試驗方法的評價取得了較大的進(jìn)步，即便是使用大鼠進(jìn)行的免疫毒性試驗，也進(jìn)入了堪稱充分而實用的階段。在本指導(dǎo)原則中，利用具有免疫毒性的諸多化學(xué)物質(zhì)在反復(fù)給藥毒性試驗時與免疫毒性有關(guān)的檢查項目中出現(xiàn)異常的現(xiàn)象，其原則是，根據(jù)反復(fù)給藥毒性試驗的結(jié)果，在懷疑存在免疫毒性的場合

3、下，進(jìn)而再做免疫毒性試驗。免疫毒性包括抑制免疫功能、變態(tài)反應(yīng)、自體免疫以及其他的免疫功能異常亢進(jìn)等，但本指導(dǎo)原則并未將試驗藥物特異性的免疫反應(yīng)（藥物變態(tài)反應(yīng)和藥物特異性的自體免疫）作為研究對象。（注1）根據(jù)本指導(dǎo)原則，在符合表1的某一項時，必須進(jìn)行免疫毒性試驗。生物制品及應(yīng)用生物技術(shù)的藥品不列入本指導(dǎo)原則的對象。指導(dǎo)原則的目的為了有效地進(jìn)行藥物免疫毒性的檢查及其性質(zhì)的研究，必須根據(jù)預(yù)測的免疫毒性選擇最適宜的試驗方法和擬定實驗方案。本指導(dǎo)原則的目的是提供進(jìn)行非臨床免疫毒性試驗時可供參考的實驗程序和檢查項目的選擇標(biāo)準(zhǔn)。本指導(dǎo)原則中，作為檢查免疫毒性的試驗，是在過去一直沿用反復(fù)給藥毒性試驗的基礎(chǔ)上，

4、增設(shè)第1階段免疫毒性試驗（第1階段試驗）及第2階段免疫毒性試驗（第2階段試驗）。包括與反復(fù)給藥毒性試驗相關(guān)的免疫毒性的檢查項目和第1階段試驗的主要目的是篩選藥物，這些藥物對免疫系統(tǒng)可能會顯示出直接或間接的毒性。在第1階段試驗中可以同時了解對體液性免疫的影響；第2階段試驗的目的在于從質(zhì)量上和數(shù)量上證明免疫毒性的大小程度。關(guān)于免疫毒性試驗的實施方法，其技術(shù)進(jìn)步很快，可以預(yù)料：比本指導(dǎo)原則所記述的試驗法更為優(yōu)異的方法即將被開發(fā)。當(dāng)著人們進(jìn)行試驗之際，在參考本指導(dǎo)原則的同時，還應(yīng)經(jīng)常獲取新技術(shù)，努力改進(jìn)檢查方法。檢查項目的選擇本指導(dǎo)原則所列示的檢查項目被認(rèn)為是最低限度的要求，根據(jù)試驗藥物的不同性質(zhì)，可

5、以考慮適當(dāng)增加檢查項目。反復(fù)給藥毒性試驗的免疫毒性有關(guān)檢查項目為臟器重量、血液檢查（血液學(xué)檢查及血液化驗）以及組織病理學(xué)檢查中與免疫系統(tǒng)有關(guān)的項目。同時，在反復(fù)給藥的毒性試驗中，建議增加末梢血液淋巴細(xì)胞亞群檢查及脾臟免疫組織化驗等項目（表2-1）。從反復(fù)給藥毒性試驗的免疫毒性有關(guān)檢查項目及增加的檢查項目中發(fā)現(xiàn)異常時（注2），才作免疫毒性試驗。免疫毒性試驗分為2個階段。第1階段試驗進(jìn)行抗體生成的檢查以及脾臟和胸腺臟器重量測定等檢查（表2-2）。天然殺傷細(xì)胞（NK）活性的檢查最好補充到第1階段試驗中。第1階段試驗未見異常的時，可以不進(jìn)行第2階段試驗。第1階段試驗出現(xiàn)異常時，結(jié)合反復(fù)給藥毒性試驗的結(jié)

6、果后，進(jìn)行包括適當(dāng)檢查項目（表2-3）在內(nèi)的第2階段試驗。在第2階段試驗中，必須證明所列免疫毒性的性質(zhì)，特別應(yīng)弄清對受影響細(xì)胞和免疫功能鑒別的影響強度，這是尤為重要！。反復(fù)給藥毒性試驗中，斷定出現(xiàn)明確的免疫毒性，并從其毒性性質(zhì)而言進(jìn)行第1階段試驗的必要性很小時（注3），可直接進(jìn)行第2階段試驗。為了討論免疫毒性的可逆行，根據(jù)需要可對發(fā)現(xiàn)異常的項目進(jìn)行恢復(fù)性試驗。試驗實施的時期通常第1階段試驗在反復(fù)給藥毒性試驗之后進(jìn)行，若有可能，也可以和反復(fù)給藥毒性試驗同時進(jìn)行。第1階段試驗，原則上應(yīng)在臨床試驗開始以前進(jìn)行；第2階段試驗，根據(jù)需要可在適宜的時期內(nèi)進(jìn)行。試驗方案第1階段試驗的試驗方案應(yīng)遵照以下條件，

7、需要進(jìn)行第2階段試驗的場合，應(yīng)當(dāng)制定與其目的最相宜的實驗方案。1. 動物種類、性別及周齡：最好使用與反復(fù)給藥毒性試驗的免疫毒性有關(guān)檢查項目及增加的檢查項目中發(fā)現(xiàn)異常的動物為同一物種、相同種系、一樣的性別和周齡的動物（注4）。反復(fù)給藥毒性試驗中未見雌雄差異時，可以使用雌雄中的任意一種動物（注5）。2. 動物數(shù)量：每組不少于8只，應(yīng)當(dāng)設(shè)定為在統(tǒng)計學(xué)具有足夠數(shù)量的動物數(shù)。各組動物的分配采用隨機分組法。3. 給藥途徑：原則上為臨床應(yīng)用的給藥途徑。4. 劑量等級：原則上應(yīng)當(dāng)設(shè)定不低于3種劑量的給藥組，并另設(shè)對照組。參照反復(fù)給藥毒性試驗的免疫毒性有關(guān)檢查項目及增加的檢查項目中發(fā)現(xiàn)異常時的劑量，設(shè)定劑量的等

8、級（注6）。5. 對照組：設(shè)置僅用溶劑的陰性對照組。根據(jù)需要可以考慮增加正常對照組（注7）及陽性對照組（注8）。6. 給藥期間：原則上采用反復(fù)給藥毒性試驗為基準(zhǔn)的給藥期間。通常每周給藥7次。7. 觀察等：進(jìn)行一般癥狀的觀察及體重測定。與免疫毒性有關(guān)的檢查項目在反復(fù)給藥毒性試驗及免疫毒性試驗中，作為研究對象的免疫毒性有關(guān)檢查項目見表-2。根據(jù)試驗藥物的性質(zhì)及試驗的目的，可從這些檢查項目中選擇需要的項目，制定切實可行的試驗方案。注釋注1：關(guān)于遲發(fā)型藥物變態(tài)反應(yīng)，皮膚過敏試驗的指導(dǎo)原則已經(jīng)制定，但是速發(fā)型藥物變態(tài)反應(yīng)的能夠很好預(yù)測的試驗方法迄今尚未建立。注2：表-1第1項（1）的內(nèi)容是指懷疑出現(xiàn)免疫

9、毒性的場合。所謂免疫毒性有關(guān)檢查的異常是指在該項檢查中給藥組與陰性對照組之間存在統(tǒng)計學(xué)意義的明顯差異，但應(yīng)考慮試驗動物的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)等的范圍及其變化。注3：例如，僅僅發(fā)現(xiàn)嗜中性白細(xì)胞減少，未見其他異常的場合等。注4：通常使用小鼠及大鼠。注5：在同一籠子中飼養(yǎng)多只雄性動物時，應(yīng)當(dāng)考慮籠子的大小，使之不會發(fā)生打斗等飼養(yǎng)方面的問題。注6：高劑量組是將與對照組比較體重抑制不超過10%的用藥量作為本組的劑量。設(shè)計劑量時必須做到：高劑量組應(yīng)出現(xiàn)足夠多的異常，而低高劑量組不應(yīng)發(fā)生異常，希望得出給藥劑量與動物反應(yīng)的某種關(guān)系。高劑量組異常的變化很小，明確知道無須使用3種等級的劑量時，也可以使用2種劑量的給藥組。注7

10、：通常沒有必要，但是所用溶劑對免疫毒性試驗產(chǎn)生影響時，必須設(shè)置正常對照組。注8：設(shè)置陽性對照組的目的在于評價檢查手段是否妥當(dāng)。如果采用了另一種方法進(jìn)行試驗，即：使用少量動物觀察給予環(huán)磷酰胺等陽性對照藥物后的影響，則可省去該陽性對照組。參考文獻(xiàn)1）.種種試驗法，Methods in Immunotoxicology Vols. 1 and 2( ed. by Burleson, G. R. ,et. al. ); Environmental Health Griteria 180.Principles and Methods for Assessing Direct Immunotoxicity

11、 Associated with Exposure to Ghemical.pp.164_225 (1996); ImmunoTox Letter. （日本免疫毒性學(xué)會發(fā)行） 揭載免疫毒性試驗-等參照。表-1 本指導(dǎo)原則中免疫毒性試驗的對象藥物1依據(jù)下述（1）至（3）的任意一項，均被懷疑為試驗藥物存在免疫毒性時：（1）該品反復(fù)給藥毒性試驗及其他毒性試驗的結(jié)果；（2）與具有免疫毒性的已知藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似；（3）其他情況。2. 試驗藥物的臨床應(yīng)用符合于下列（1）至（2）的場合（注1）：（1）免疫功能缺失癥；（2）與具有免疫抑制作用的藥物（注2）聯(lián)合用藥。注1：具有合理理由時，可從試驗對象中排除。

12、注2：免疫抑制劑、抗癌藥物、抗變態(tài)反應(yīng)藥物及甾體化合物等中具有免疫抑制作用的藥物。表-2 免疫毒性的有關(guān)檢查項目 . 反復(fù)給藥毒性試驗的檢查項目1. 一般狀態(tài)及體重；2. 血液學(xué)檢查：免疫毒性的有關(guān)檢查必須進(jìn)行血細(xì)胞計數(shù)和測定白細(xì)胞的分類百分率。3, 血液化驗：免疫毒性的有關(guān)檢查必須測定白蛋白/球蛋白比率（A/G）。4. 臟器重量：免疫毒性的有關(guān)檢查必須測定脾臟、胸腺及腎上腺的重量。5. 組織病理學(xué)檢查：免疫毒性的有關(guān)檢查必須進(jìn)行脾臟、胸腺、淋巴結(jié)、骨髓、腸道（包括淋巴集結(jié)）、肝臟、腎臟、腎上腺及皮膚的檢查。6. 最好增加末梢血液淋巴細(xì)胞亞群檢查及脾臟免疫組織化驗等項目。. 第1階段免疫毒性試

13、驗的檢查項目1. 抗體的生成：在給藥過程中的適宜時期，使用羊的紅細(xì)胞等T淋巴細(xì)胞依賴性抗原進(jìn)行免疫。將羊的紅細(xì)胞作為抗原使用，在空斑形成細(xì)胞（PFC）測定時，4天前測定血清的抗體值，67天前進(jìn)行免疫。由羊的紅細(xì)胞進(jìn)行免疫采用靜脈內(nèi)給藥。測定空斑形成細(xì)胞（PFC），最后一次給予試驗藥物的第2天，制作每只動物的脾臟細(xì)胞，并進(jìn)行測定。測定血清抗體時，最后一次給予試驗藥物的第2天，采集每只動物的血液，制作血清，一直保存到測定之時（根據(jù)需要可以冷凍）?？贵w的測定采用酶標(biāo)記免疫吸附測定法（ELISA）。2. 用于抗體生成檢查的試驗動物，應(yīng)進(jìn)行一般狀態(tài)、體重、脾臟重量、胸腺重量以及其他一些特殊需要的項目進(jìn)行

14、檢查。3. 根據(jù)需要，可以進(jìn)行天然殺傷細(xì)胞（NK）的檢查。為了進(jìn)行天然殺傷細(xì)胞（NK）的檢查，與抗體生成的檢查不同，必須設(shè)置給藥組及對照組。最后一次給予試驗藥物的第2天，制作脾臟細(xì)胞，使用適宜的標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行測定。. . 第2階段免疫毒性試驗的檢查項目1. 骨髓細(xì)胞的分類百分率：使用后肢骨骼。2. 淋巴細(xì)胞亞群的檢查：對于末梢血液以及脾臟的B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞亞群和天然殺傷細(xì)胞（NK），使用對于適宜表面標(biāo)記等具有特異性的抗體進(jìn)行計數(shù)，并求出其組成比。也可以用流式細(xì)胞測量法進(jìn)行檢查。3. 血液化驗：進(jìn)行血清蛋白質(zhì)的電泳。4.免疫球蛋白的分類檢查：最后一次給予試驗藥物的第2天，采集血樣

15、，制作血清，保存（根據(jù)需要可以冷凍）。采用酶標(biāo)記免疫吸附測定法（ELISA）進(jìn)行免疫球蛋白的分類（IgM、IgG、IgA和IgE）水平的測定5. 免疫組織的化驗：對淋巴組織、腎臟（包括免疫復(fù)合物沉著）以及皮膚等的免疫組織進(jìn)行化驗。6, 免疫功能的檢查：（1）抗體生成的檢查：見上所述。（2）天然殺傷細(xì)胞（NK）活性的檢查：如上所述。（3）其他免疫功能的檢查：可以適當(dāng)增加由Mitogene等引起的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、細(xì)胞障礙性T細(xì)胞的活性、血清補體、細(xì)胞因子的生長、巨噬細(xì)胞和多態(tài)型白細(xì)胞的吞噬活性、遲延型變態(tài)反應(yīng)（注1）、宿主抗性、淋巴結(jié)反應(yīng)（注1、注2）、瞬時型變態(tài)反應(yīng)（注1）、自體抗體、尿蛋白以及其他的檢查。（注1）將這些變態(tài)反應(yīng)用作指標(biāo)，討論其抑制和亢進(jìn)。（2）有時將自體免疫的激發(fā)活性作為指標(biāo)。免疫毒性試驗的工作程序（此為用于說明的概述性參考資料，準(zhǔn)確內(nèi)容請見指導(dǎo)原則的原文）新型候補藥物生物制品及應(yīng)用生物技術(shù)的藥品除外反復(fù)給藥的毒性試驗（表2-