第二章 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和專(zhuān)用生物反應(yīng)器.ppt

1、第二章 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和專(zhuān)用生物反應(yīng)器,動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù),所謂動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)（large-scale culture technology）是指在人工條件下（設(shè)定ph、溫度、溶氧等），在細(xì)胞生物反應(yīng)器（bioreactor）中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。 目前可大規(guī)模培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細(xì)胞及人二倍體細(xì)胞、cho（中華倉(cāng)鼠卵巢）細(xì)胞、BHK-21(倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)、Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎傳代細(xì)胞，是貼壁依賴(lài)的成纖維細(xì)胞)等，并已成功生產(chǎn)了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細(xì)胞生成素、單克隆抗體等產(chǎn)品。,第一

2、節(jié)、常用的培養(yǎng)方法 第二節(jié)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式 第三節(jié)、細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的放大 第四節(jié)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器,動(dòng)物細(xì)胞工程,通常采用的技術(shù)手段,人耳鼠,2001年，一只特別的活老鼠在北京引起轟動(dòng)這是有著一對(duì)紅眼睛的、尾巴長(zhǎng)長(zhǎng)的、渾身沒(méi)毛的小白鼠。值得一提的是，這只小白鼠的背上，竟長(zhǎng)著一只幾乎與身子一般大小的“人耳”。這只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民醫(yī)院副院長(zhǎng)、整復(fù)外科主任曹誼林教授利用組織工程技術(shù)復(fù)制出來(lái)的。,在京展出的數(shù)天，盡管門(mén)票高達(dá)20元，但還是有將近20萬(wàn)人，心甘情愿地掏錢(qián)一睹“人耳鼠”的風(fēng)采。,人耳鼠的出現(xiàn)，透露了怎樣的信息？,“人耳鼠”再出風(fēng)頭,華南虎是我國(guó)特有的虎種。華

3、南虎于1996年被國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟列為極度瀕危的十大物種之一。到目前為止，中國(guó)存活的圈養(yǎng)華南虎僅為70只，其中包括正在南非野化的2只。國(guó)內(nèi)動(dòng)物園圈養(yǎng)的華南虎只有68只，散布在全國(guó)18家城市動(dòng)物園中。,除了在恢復(fù)華南虎棲息地、生存環(huán)境等方面做出積極努力外，我們是否可以借助現(xiàn)代生物技術(shù)的力量，幫助華南虎種群數(shù)量的恢復(fù)？,華南虎,人工關(guān)節(jié)軟骨再生,1.第一次手術(shù): 從病人關(guān)節(jié)軟骨中未 受力的部分，取出一片約為葡萄干大小的健康軟骨組織。 2.分離軟骨細(xì)胞并經(jīng)三星期的體外 培養(yǎng)，使細(xì)胞數(shù)增加約1020倍。 3.第二次手術(shù): 清理軟骨受損的部分，從下方骨頭部位取出一片約與傷口大小相同的骨膜，縫在傷口上方，

4、再將軟骨細(xì)胞注射到骨膜下方。,結(jié)果: 經(jīng)過(guò)復(fù)健一年后即可恢復(fù)正常的生活。,在生物技術(shù)中，人們已廣泛地圍繞著細(xì)菌、酵母、絲狀真菌等微生物的大量培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)各種酶、抗生素、蛋白質(zhì)等產(chǎn)物。然而，許多有重要價(jià)值的蛋白質(zhì)等生物物質(zhì)，必須借助于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)來(lái)獲得，例如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等，如下頁(yè)表所示的是一些已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化和正在研究開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品。,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的必要性,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物,相關(guān)過(guò)程和關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題,1、基因工程和細(xì)胞工程的發(fā)展 2、大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和生物反應(yīng)器的開(kāi)發(fā)。 3、產(chǎn)品的分離濃縮和提純技術(shù)的提高。,動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的歷史可追溯到1907年，美國(guó)生物學(xué)家Harrison在無(wú)

5、菌條件下，以淋巴液為培養(yǎng)基成功地在試管中培養(yǎng)了蛙胚神經(jīng)組織達(dá)數(shù)周，創(chuàng)立了體外組織培養(yǎng)法。,大規(guī)模的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)開(kāi)始于上世紀(jì)60年代，經(jīng)過(guò)多年來(lái)的研究，人類(lèi)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了大量的研究開(kāi)發(fā)，取得了很大的進(jìn)展。盡管如此，目前的技術(shù)水平還遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足細(xì)胞生物產(chǎn)品研究和生產(chǎn)的要求，隨著動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用日趨廣泛，已顯示出很廣闊的發(fā)展前景。,利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的生物制品已占世界生物高技術(shù)產(chǎn)品市場(chǎng)份額的50%。 大量資料表明，生物技術(shù)藥物是當(dāng)前新藥開(kāi)發(fā)的重要領(lǐng)域，生物技術(shù)制藥工業(yè)是下一個(gè)10年制藥工業(yè)的重要新門(mén)類(lèi)，期間將有數(shù)百種生物技術(shù)新藥上市。目前,動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)水平的提高主要集中

6、在培養(yǎng)規(guī)模的進(jìn)一步擴(kuò)大、優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境、改變細(xì)胞特性、提高產(chǎn)品的產(chǎn)率與保證其質(zhì)量上。,表 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展,動(dòng)物細(xì)胞形態(tài) (1)成纖維細(xì)胞型(fibrlblast或mechanocyte type)這種細(xì)胞形態(tài)與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形態(tài)相似故而得名。細(xì)胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，中央有圓形核，胞質(zhì)向外伸出23個(gè)長(zhǎng)短不同的突起。細(xì)胞群常借原生質(zhì)突連接成網(wǎng)，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀、漩渦或火焰狀走行。除真正的纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)來(lái)源的其他組織細(xì)胞，如血管內(nèi)皮、心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞等，也多呈成纖維細(xì)胞形態(tài)。實(shí)際上很多所謂成纖維細(xì)胞并無(wú)產(chǎn)生纖維的能力，只是一種習(xí)慣上概括的稱(chēng)法。,(2)上皮細(xì)胞型(ep

7、ithilium cell type) 這種細(xì)胞呈扁平的不規(guī)則三角形，中央有圓形核，生長(zhǎng)時(shí)常彼此緊密連接單層細(xì)胞片，起源于外胚層和內(nèi)胚層組織的細(xì)胞，如皮膚表皮及衍生物(汗腺、皮脂腺等)。腸管上皮、肝、胰和肺泡上皮細(xì)胞。培養(yǎng)時(shí)皆呈上皮型。,(3)游走細(xì)胞型(wondering cell type) 這種細(xì)胞的培養(yǎng)需要在支持物上生長(zhǎng)，一般不連接成片，細(xì)胞胞質(zhì)經(jīng)常出現(xiàn)偽足或突起，呈活躍的游走和變形運(yùn)動(dòng)，速度快而且方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不很穩(wěn)定，有時(shí)亦難和其他型細(xì)胞相區(qū)別，在一定條件下，如培養(yǎng)基化學(xué)性質(zhì)變動(dòng)等，它們也可能變?yōu)槌衫w維細(xì)胞型。,(4)多形性細(xì)胞型(polymorphic cell type)

8、 除上述三種細(xì)胞外，還有一些組織和細(xì)胞，如神經(jīng)組織的細(xì)胞等，難以確定它們的穩(wěn)定形態(tài)，可統(tǒng)歸多形性細(xì)胞。 上述這四種細(xì)胞形態(tài)均屬于貼壁依賴(lài)型細(xì)胞，培養(yǎng)這類(lèi)細(xì)胞時(shí)，常需貼附在支持物上生長(zhǎng)。但由于培養(yǎng)環(huán)境的變化，細(xì)胞形態(tài)常發(fā)生改變。 (5)懸浮型細(xì)胞 這類(lèi)細(xì)胞常呈圓形，不貼附在支持物上，呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。如血液細(xì)胞，淋巴組織細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞。培養(yǎng)這類(lèi)細(xì)胞也可采用微生物培養(yǎng)的方法進(jìn)行懸浮物培養(yǎng)。,（a）成纖維細(xì)胞型；（b）上皮細(xì)胞型； （c）游走細(xì)胞型；（d）多形性細(xì)胞型,圖 動(dòng)物細(xì)胞形態(tài),單克隆抗體,哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有一套復(fù)雜的防御系統(tǒng)保護(hù)自己不受有毒物質(zhì)和病原物的侵害，其中一部分防御反應(yīng)就是淋巴細(xì)胞經(jīng)

9、誘導(dǎo)產(chǎn)生特異的蛋白，這些蛋白可以在其他免疫系統(tǒng)蛋白的幫助下與外來(lái)物質(zhì)結(jié)合，并抵消其生物學(xué)功能。這些特異的蛋白，就是抗體；相對(duì)于抗體，誘發(fā)產(chǎn)生抗體的外來(lái)物質(zhì)即稱(chēng)為抗原。 抗體最早是由德國(guó)微生物學(xué)家貝林發(fā)現(xiàn)的，它們存在于人和脊椎動(dòng)物的血清之中，是這些生物體內(nèi)免疫系統(tǒng)的重要組成成分。由于抗體分子具有極其精確的結(jié)合特異性，可以識(shí)別各種不同的抗原，還可以激活細(xì)胞的其他防衛(wèi)系統(tǒng)以消滅抗原，因此抗體在基礎(chǔ)研究和臨床診斷中獲得了廣泛的重視和應(yīng)用。隨著雜交瘤技術(shù)、蛋白質(zhì)工程和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等技術(shù)的發(fā)展，抗體已逐步在疾病治療等應(yīng)用領(lǐng)域顯示出越來(lái)越廣闊的應(yīng)用前景。,抗體,由B細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白，它能識(shí)別抗原的某一特定

10、位點(diǎn)?？贵w分子由兩個(gè)完全相同的重鏈分子以及兩個(gè)完全相同的輕鏈分子組成。存在于人或哺乳動(dòng)物的血清之中。,抗原,如前所述，抗體分子是免疫系統(tǒng)反應(yīng)的一個(gè)重要組分，因?yàn)榭贵w分子可以識(shí)別各種不同的外來(lái)抗原，同時(shí)可激活宿主的防衛(wèi)系統(tǒng)。 對(duì)于一個(gè)免疫刺激（有毒物質(zhì)或病原物侵入，即抗原），每一個(gè)淋巴細(xì)胞都會(huì)合成并分泌一種單個(gè)的抗體，這些抗體可以高度特異地識(shí)別免疫抗原的特定區(qū)域，也就是抗原決定簇。由于一個(gè)抗原通常都有幾個(gè)不同的抗原決定簇，因此每個(gè)免疫淋巴細(xì)胞都可能產(chǎn)生一種針對(duì)某一個(gè)抗原決定簇的抗體，這些由同一抗原而產(chǎn)生的不同的抗體統(tǒng)稱(chēng)為多克隆抗體。,有毒物質(zhì)或病原物侵入，即抗原 指誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的物質(zhì)。,多克隆抗

11、體,在一個(gè)血清樣品中包含了對(duì)同一抗原分子上不同抗原決定簇的多種抗體。,單克隆抗體,由雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的針對(duì)某一特定抗原決定簇的單一類(lèi)型的抗體。,抗體,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)一般步驟,放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程示意圖,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境,動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖和代謝等生理性質(zhì)在很大程度上受到各種環(huán)境因素的影響。為了使動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)處于最佳狀態(tài)，了解環(huán)境因素對(duì)其影響無(wú)疑是很重要的，影響動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖的環(huán)境因素很多，主要有溫度、PH值、營(yíng)養(yǎng)成分、溶氧、氣體環(huán)境、滲透壓以及其他因素。,溫 度,細(xì)胞在體外生存的基本條件之一，來(lái)源不同的動(dòng)物細(xì)胞，其最適的生長(zhǎng)溫度是不盡相同的，例

12、如昆蟲(chóng)細(xì)胞的最適溫度是25-28，人和哺乳動(dòng)物的細(xì)胞的最適溫度是37.細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比，高于最適溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝和生長(zhǎng)將會(huì)受到影響，甚至導(dǎo)致死亡?？偟膩?lái)說(shuō)，動(dòng)物細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力比對(duì)高溫的耐受力強(qiáng)，如溫度升至45時(shí)，1h內(nèi)人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞將被殺死；相反，降低細(xì)胞置于25-35時(shí)，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，但速度減慢，并維持長(zhǎng)時(shí)間不死，甚至于放在4，數(shù)小時(shí)后再置于37培養(yǎng)，細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)。,PH 值,合適的PH值是細(xì)胞生存的必要的條件之一。動(dòng)物細(xì)胞合適的PH值一般在7.2-7.4，低于6.8或高于7.6時(shí)都對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利的影響，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞退變或死亡。不同的細(xì)胞對(duì)PH值也有不同的要求，

13、原代培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)PH值的變化耐受性差，傳代細(xì)胞對(duì)PH值變化的耐受性較強(qiáng)。而對(duì)于同一種細(xì)胞，增長(zhǎng)期和維持期的最適PH也不盡相同，對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，偏堿性環(huán)境比酸性環(huán)境更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。,營(yíng)養(yǎng)成分,細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖以及產(chǎn)物的合成都必須從環(huán)境中攝取各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以合成細(xì)胞物質(zhì)及在新陳代謝中起調(diào)節(jié)作用。這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括碳源、氮源、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、生長(zhǎng)因子等。,溶氧及氣體環(huán)境,滲透壓等其它因素,其它環(huán)境條件,培養(yǎng)器皿,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)表面為什么要光滑、無(wú)毒？ 在培養(yǎng)過(guò)程中，如何才能保持無(wú)菌與無(wú)毒的環(huán)境？,培養(yǎng)基的組成,培養(yǎng)基是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的基本溶液，是組織細(xì)胞培養(yǎng)最重要的條件。用于

14、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基可以分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基兩 大類(lèi)。,天然培養(yǎng)基是使用最早、最為有效的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，它主要取自于動(dòng)物體液或從動(dòng)物組織分離提取而得，其優(yōu)點(diǎn)是營(yíng)養(yǎng)成分豐富、培養(yǎng)效果良好；缺點(diǎn)是成分復(fù)雜、個(gè)體差異大、來(lái)源有限。,天然培養(yǎng)基的種類(lèi)有很多，包括生物性液體（如血清）、組織浸出液（如胚胎浸出液）、凝固劑（如血漿）等。,血液組成：紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和血漿。 高速離心，分三層：上層為血漿-40%多。 血漿冷凍到-30度，離心，分層：上層為血清，下層為雜蛋白（少）。,血清,組織細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的天然培養(yǎng)基是血清，這是因?yàn)檠逯泻邪ù蠓肿拥牡鞍踪|(zhì)和核酸等豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)繁

15、殖、粘附及中和某些物質(zhì)的毒性起著一定的作用。用于組織細(xì)胞培養(yǎng)的血清的種類(lèi)很多，其來(lái)源主要是動(dòng)物，有小牛血清、胎牛血清、馬血清、兔血清以及人血清等，最廣泛使用的是小牛血清和胎牛血清。優(yōu)質(zhì)的血清外觀應(yīng)為透明、無(wú)溶血、淡黃色、無(wú)沉淀物。,血漿,組織浸出液,血漿不僅可用來(lái)支持培養(yǎng)組織塊，而且還供給細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但由于血漿很容易發(fā)生傳染，目前已很少單獨(dú)使用。一般使用的是禽類(lèi)血漿。,組織浸出液常用的是胚胎浸出液（如雞胚浸出液），它的主要成分含有大分子核蛋白和小分子的氨基酸，有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。,水解乳蛋白,水解乳蛋白是常用的一種天然培養(yǎng)基，是由乳白蛋白經(jīng)水解而制得，氨基酸的含量較高。一般配制成0.5

16、%的溶液，或與合成培養(yǎng)基以1：1共同使用。,合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞體內(nèi)生存環(huán)境中各種已知物質(zhì)在體外人工條件的模擬，經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)篩選、強(qiáng)化和重新組合后形成的培養(yǎng)基。 這種培養(yǎng)基在很多方面有天然培養(yǎng)基所無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，它既能給細(xì)胞提供一個(gè)近似于體內(nèi)的生存環(huán)境，又便于控制和提供標(biāo)準(zhǔn)化體外生存環(huán)境。 目前所有的細(xì)胞培養(yǎng)都已采用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)、組成和含量都相對(duì)固定的各種合成培養(yǎng)基，并已有配制好的干粉型商品。盡管現(xiàn)在的合成培養(yǎng)基成分和含量已經(jīng)較為復(fù)雜，但仍然不能完全滿(mǎn)足體外培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的需要，合成培養(yǎng)基中還是需要加入一定量的天然培養(yǎng)基予以補(bǔ)充。,合成培養(yǎng)基,常用的合成培養(yǎng)基,目前

17、合成培養(yǎng)基的種類(lèi)已有數(shù)十種，大多數(shù)培養(yǎng)基都是為適應(yīng)某種組織細(xì)胞的生長(zhǎng)而在某種合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改良而來(lái)的。目前較為常用的有199培養(yǎng)液、 Eagle (MEM、DMEM)培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液、HAM培養(yǎng)液等?；A(chǔ)培養(yǎng)基的產(chǎn)品配方成分是公開(kāi)的，并被業(yè)界普遍采納和使用。例如:MEM、DMEM、1640、199、PRMI1640、IMDM、F12等細(xì)胞培養(yǎng)基。,個(gè)性化培養(yǎng)基在國(guó)外生物制藥企業(yè)被普遍采用。不同的生物制品，不同的細(xì)胞株，不同的生產(chǎn)工藝，都需要與之對(duì)應(yīng)的個(gè)性化細(xì)胞培養(yǎng)基來(lái)支持。,個(gè)性化細(xì)胞培養(yǎng)基被國(guó)際生物制藥公司普遍采用,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法,所謂動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是將動(dòng)物組織或細(xì)胞從機(jī)體

18、取出，分散成單個(gè)細(xì)胞，給予必要的生長(zhǎng)條件，模擬體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，使其在體外繼續(xù)生長(zhǎng)和繁殖。,微生物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞性質(zhì)的比較,微生物和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法的比較,與微生物細(xì)胞培養(yǎng)類(lèi)似，動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)有兩種類(lèi)型：一類(lèi)是非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞，這類(lèi)細(xì)胞可以采用與微生物培養(yǎng)類(lèi)似的方法進(jìn)行懸浮培養(yǎng)；另一類(lèi)是貼壁依賴(lài)性細(xì)胞，它們需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面上生長(zhǎng)。,第一節(jié) 常用的培養(yǎng)方法,體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞有兩種類(lèi)型 一種是非貼壁依賴(lài)型細(xì)胞，來(lái)源于血液、淋巴組織的細(xì)胞，許多腫瘤細(xì)胞（包括雜交瘤細(xì)胞）和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞屬于這一類(lèi)型，可采用類(lèi)似微生物培養(yǎng)的方法進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。 另一種是貼壁依賴(lài)型細(xì)胞，大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞

19、，包括非淋巴組織的細(xì)胞和許多異倍體細(xì)胞屬于這一類(lèi)型，他們需要附著于帶適量正電荷的固體或半固體表面上生長(zhǎng)。,在貼壁培養(yǎng)過(guò)程中，貼壁依賴(lài)性細(xì)胞需要附著在帶適量正電荷或半固體的表面上，原來(lái)是圓形的細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展開(kāi)來(lái)，然后開(kāi)始有絲分裂，并很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。一般可在數(shù)天后鋪滿(mǎn)生長(zhǎng)表面，形成致密的細(xì)胞單層。,一、貼壁培養(yǎng),細(xì)胞貼壁一般分為：貼壁因子吸附于培養(yǎng)表面、細(xì)胞與表面接觸、細(xì)胞貼壁于培養(yǎng)表面和貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)表面上擴(kuò)展等幾個(gè)步驟。,大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于貼壁依賴(lài)型細(xì)胞,常用的細(xì)胞系 Hela：美國(guó)婦女宮頸癌細(xì)胞 Vero：非洲綠猴腎細(xì)胞 BHK：倉(cāng)鼠腎細(xì)胞 CHO：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞,細(xì)胞貼壁過(guò)程

20、,細(xì)胞接觸抑制,接觸抑制(contact inhibition),細(xì)胞在貼壁生長(zhǎng)過(guò)程中，隨著細(xì)胞分裂，數(shù)量不斷增加，最后形成一個(gè)單層，此時(shí)細(xì)胞間相互接觸，細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)停止，數(shù)量不再增加。,原代培養(yǎng)：傳代培養(yǎng)：,從供體獲取組織或細(xì)胞后的初次培養(yǎng)，一般把第1代細(xì)胞的培養(yǎng)與傳10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)統(tǒng)稱(chēng)為原代培養(yǎng)。,將原代培養(yǎng)的細(xì)胞分離稀釋后轉(zhuǎn)入到新的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，稱(chēng)為傳代培養(yǎng)。一般是10代以后傳到40、50代。,1、傳代培養(yǎng)的細(xì)胞都能一直傳代下去嗎？,2、有些細(xì)胞為何能一直傳代下去？,問(wèn)題,取 的組織、器官,細(xì)胞懸浮液,酶,10代細(xì)胞,培養(yǎng),培養(yǎng),無(wú)限傳代,單個(gè)細(xì)胞,加 液,動(dòng)物胚胎 或幼齡動(dòng)物

21、,胰蛋白,培養(yǎng),原代,傳代,微載體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn),1、表面積/體積比大。 2、微載體懸浮于培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境均一，簡(jiǎn)化了這些環(huán)境因素的檢測(cè)和控制。用簡(jiǎn)單顯微鏡能觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。 3、培養(yǎng)基利用率高。 4、采樣重演性好。 5、收獲過(guò)程不復(fù)雜。 6、放大較容易。 7、勞動(dòng)強(qiáng)度小，占用空間小。,影響微載體培養(yǎng)的特殊因素,微載體濃度 接種濃度 攪拌轉(zhuǎn)速,二、懸浮培養(yǎng),所謂懸浮培養(yǎng)，是指細(xì)胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長(zhǎng)的過(guò)程。主要用于非貼壁依賴(lài)型細(xì)胞培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等。 動(dòng)物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。由于動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)（如：沒(méi)有細(xì)胞壁保護(hù)，不能耐受劇烈的攪拌和通氣），因此在許多方面又

22、與經(jīng)典的發(fā)酵不同。 懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度較低，轉(zhuǎn)化細(xì)胞懸浮培養(yǎng)有潛在的致癌危險(xiǎn)，培養(yǎng)病毒易失去病毒標(biāo)記而降低免疫能力。,三、固定化培養(yǎng),固定化培養(yǎng)是既適用于貼壁依賴(lài)性細(xì)胞，又適用于非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞的包埋培養(yǎng)方式，具有細(xì)胞生長(zhǎng)密度高、抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。 由于所培養(yǎng)的細(xì)胞的不同，固定化培養(yǎng)的方式也有不同，一般對(duì)于貼壁依賴(lài)性細(xì)胞通常采用膠原包埋，而對(duì)于非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞則常用海藻酸鈣包埋。,常用的細(xì)胞固定化的方法有 1、吸附：選擇適當(dāng)?shù)臈l件，將細(xì)胞和支持物混合，細(xì)胞便貼附在支持物的表面。 2、共價(jià)貼附：細(xì)胞和支持物通過(guò)化學(xué)鍵結(jié)合，減少了細(xì)胞泄露。 3、離子/共價(jià)交聯(lián)：如果用聚合物（聚氨等）處

23、理細(xì)胞懸液，則會(huì)在細(xì)胞之間形成橋使之絮結(jié)。 4、包埋：此法步驟簡(jiǎn)單，條件溫和，細(xì)胞和高聚物或單體混合，隨著凝膠的形成，細(xì)胞嵌入到高聚物網(wǎng)絡(luò)中。 5、微囊化：是在液體狀態(tài)和生理?xiàng)l件下制備的。對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)條件改變不大。,表 2-1 動(dòng)物細(xì)胞固定化各種方法的特點(diǎn),第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式,動(dòng)物細(xì)胞無(wú)論是貼壁培養(yǎng)或是懸浮培養(yǎng)，均可分為分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式、灌注式等多種培養(yǎng)方式。,一、分批式培養(yǎng),分批式培養(yǎng)是指先將細(xì)胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，同時(shí)產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后，終止培養(yǎng)。,在細(xì)胞分批培養(yǎng)過(guò)程中，不向培養(yǎng)系統(tǒng)補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而只向培養(yǎng)基通入氧

24、，能夠控制的參數(shù)只有PH、溫度和通氣量，因此細(xì)胞所處的生長(zhǎng)環(huán)境隨著營(yíng)養(yǎng)物的消耗和產(chǎn)物、副產(chǎn)物的積累時(shí)刻都在發(fā)生變化，不能使細(xì)胞自始至終處于最優(yōu)的條件下，因而分批培養(yǎng)并不是一種很好的培養(yǎng)方式。分批培養(yǎng)過(guò)程的持征如圖所示。,分批式培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線(xiàn),在分批式培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞的生長(zhǎng)可分為延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期等五個(gè)階段。 為什么說(shuō)采用分批式培養(yǎng)細(xì)胞效果不佳？,分批式培養(yǎng),二、流加式培養(yǎng)（補(bǔ)料分批式）,流加式培養(yǎng)是指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適宜的條件下接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，產(chǎn)物不斷形成，而在此過(guò)程中隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，不斷地向系統(tǒng)中補(bǔ)充新的營(yíng)養(yǎng)成分，使細(xì)胞進(jìn)一

25、步生長(zhǎng)代謝，直到整個(gè)培養(yǎng)結(jié)束后取出產(chǎn)物。,流加式培養(yǎng)只是向培養(yǎng)系統(tǒng)補(bǔ)加必要的營(yíng)養(yǎng)成分，以維持營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度不變。由于流加式培養(yǎng)能控制更多的環(huán)境參數(shù)，使得細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成容易維持在優(yōu)化狀態(tài)。,流加式培養(yǎng)有何特點(diǎn)？,流加操作的特點(diǎn)就是能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度。一方面，它可以避免某種營(yíng)養(yǎng)成分的初始濃度過(guò)高而出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象。另外一個(gè)方面，能防止某些限制性營(yíng)養(yǎng)成分在培養(yǎng)過(guò)程中被消耗而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成，這是流加式操作與分批式操作的明顯不同。此外，由于新鮮培養(yǎng)液的加入，整個(gè)過(guò)程中反應(yīng)體積是變化的，這也是它的一個(gè)重要特征。 最常見(jiàn)的流加物質(zhì)是葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源物質(zhì)。,根據(jù)流加控

26、制方式不同，有兩種流加式培養(yǎng)方式：無(wú)反饋控制流加和有反饋控制流加。 無(wú)反饋控制流加包括定流量加和間斷流加等； 有反饋控制流加一般是連續(xù)或間斷地測(cè)定系統(tǒng)中限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度，并以此為控制指標(biāo)來(lái)調(diào)節(jié)流加速率或流加液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度等。,流加控制方式,三、半連續(xù)式培養(yǎng),半連續(xù)式培養(yǎng)又可稱(chēng)為反復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)，是指在分批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，將分批培養(yǎng)的培養(yǎng)液部分取出，并重新補(bǔ)充加入等量的新鮮培養(yǎng)基，從而使反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變的培養(yǎng)方式。,四、連續(xù)操作,連續(xù)式操作是指將細(xì)胞種子和培養(yǎng)液一起加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮的培養(yǎng)液不斷加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，使反應(yīng)條件

27、處于一種恒定狀態(tài)。 與分批式操作和半連續(xù)式操作不同。連續(xù)培養(yǎng)可以控制細(xì)胞所處的環(huán)境條件長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定，因此，可以使細(xì)胞維持在優(yōu)化狀態(tài)下，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成。,五、灌注式操作培養(yǎng),灌注式操作是指細(xì)胞接種后進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)基不斷加入反應(yīng)器，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，但細(xì)胞留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種不斷的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。,細(xì)胞灌注培養(yǎng)系統(tǒng)實(shí)例,動(dòng)物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)一般是采用灌注培養(yǎng)。灌注培養(yǎng)是把細(xì)胞接種后進(jìn)行培養(yǎng)，一方面連續(xù)向反應(yīng)器中注入新鮮的培養(yǎng)基，同時(shí)又連續(xù)不斷地取出等量的培養(yǎng)液，但是過(guò)程中不取出細(xì)胞，細(xì)胞仍留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種營(yíng)養(yǎng)不斷的狀態(tài)。當(dāng)高密度培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，必須確保

28、補(bǔ)充給細(xì)胞以足夠的營(yíng)養(yǎng)以及除去有素毒的代謝物。灌注培養(yǎng)時(shí)用新鮮的培養(yǎng)液進(jìn)行灌注，可以確保上述目的的實(shí)現(xiàn)。通過(guò)調(diào)節(jié)灌注速度，可以把培養(yǎng)過(guò)程保持在穩(wěn)定的、廢代謝物低于抑制水平的狀態(tài)下。灌注培養(yǎng)過(guò)程的特征如圖所示。,采用灌注培養(yǎng)的優(yōu)越性不僅在于大大提高了細(xì)胞生長(zhǎng)密度，而且有助于產(chǎn)物的表達(dá)和純化。因此，灌注培養(yǎng)已經(jīng)應(yīng)用于許多不同的培養(yǎng)系統(tǒng)中，規(guī)模已達(dá)幾百升。,灌注培養(yǎng)的特點(diǎn),灌注培養(yǎng)過(guò)程的特征,不同培養(yǎng)方式對(duì)CHO細(xì)胞生產(chǎn)人組織血纖維溶酶原激活劑（tPA)產(chǎn)量和活性的影響,第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的放大,放大通常是指生產(chǎn)規(guī)模的增大和生產(chǎn)能力的增加。放大的目的是更大規(guī)格重現(xiàn)某個(gè)過(guò)程并實(shí)現(xiàn)預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。,5

29、個(gè)不同階段（動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)由實(shí)驗(yàn)室建立的細(xì)胞株到反應(yīng)器的大規(guī)模培養(yǎng)）,第一階段，篩選和開(kāi)發(fā)能表達(dá)所需產(chǎn)物的細(xì)胞系。 第二階段，在方瓶和轉(zhuǎn)瓶中確定該細(xì)胞系對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境的要求。 第三階段，細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器中進(jìn)行，最理想的是采用由生產(chǎn)規(guī)模的反應(yīng)器縮小的臺(tái)式反應(yīng)器。 第四階段，在中試規(guī)模進(jìn)一步根據(jù)生產(chǎn)的實(shí)際條件和可能性，確定過(guò)程的控制方案，根據(jù)細(xì)胞株的實(shí)際情況尋求過(guò)程的優(yōu)化方案，對(duì)培養(yǎng)的環(huán)境作進(jìn)一步的調(diào)整。 第五階段，擴(kuò)大到生產(chǎn)規(guī)模。,細(xì)胞培養(yǎng)放大過(guò)程的5個(gè)主要階段,放大過(guò)程中的主要影響因素,一、培養(yǎng)基組成 二、限制細(xì)胞生長(zhǎng)的因素 三、污染的控制 四、產(chǎn)物表達(dá)的控制 五、硬件和過(guò)程設(shè)計(jì)參數(shù) 六

30、、產(chǎn)物收獲,一、培養(yǎng)基組成,血清的作用在于向細(xì)胞提供激素（生化因子）、轉(zhuǎn)移蛋白和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。目前血清是培養(yǎng)基中不可缺少的組分，并成為達(dá)到最優(yōu)化和經(jīng)濟(jì)性目標(biāo)的障礙。降低血清用量和采用無(wú)血清培養(yǎng)基成為研究的熱點(diǎn)。,血清培養(yǎng)基的考慮,1、血清中含有廣泛的微量組分，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有相當(dāng)大的作用，但對(duì)其存在的作用至今還未充分確定。 2、對(duì)通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)獲得產(chǎn)物的過(guò)程，血清的存在是純化的主要障礙，甚至難以使產(chǎn)物形成醫(yī)藥產(chǎn)品。 3、血清常受病毒污染，其中許多對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)害，但增加了未知因素，未操作者不能控制。 4、血清是培養(yǎng)基成本的主要部分 5、血清不僅有生長(zhǎng)促進(jìn)活力，而且有生長(zhǎng)抑制活力。 6、實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)過(guò)程的

31、標(biāo)準(zhǔn)化困難。,二、限制細(xì)胞生長(zhǎng)的因素,在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中有許多因素限制了細(xì)胞生長(zhǎng)。與微生物發(fā)酵相比，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)能達(dá)到的細(xì)胞密度比較低。根據(jù)不同的細(xì)胞類(lèi)型、培養(yǎng)系統(tǒng)和培養(yǎng)基組成，其范圍為每毫升（0.5-5）106個(gè)細(xì)胞。,三、污染的控制,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物可能被各種微生物病毒污染。這些污染物的來(lái)源包括細(xì)胞種子、血清、試劑、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和操作人員。 在生產(chǎn)過(guò)程或?qū)嶒?yàn)室空間中，完全沒(méi)有微生物的污染是不可能的，這需要通過(guò)改進(jìn)設(shè)備的設(shè)計(jì)消除這些污染源，其中反應(yīng)器的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)人員也常是重要的污染源，無(wú)菌操作技術(shù)的良好訓(xùn)練是污染控制的基礎(chǔ)。,四、產(chǎn)物表達(dá)的控制,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物有兩大類(lèi)。一是細(xì)胞本身，

32、另一是由細(xì)胞分泌的某些產(chǎn)物。由細(xì)胞分泌的產(chǎn)物可以分為3類(lèi)： 1、天然產(chǎn)物，如淋巴因子、激素、病毒等。 2、基因工程產(chǎn)物，如病毒亞單位蛋白。 3、融合細(xì)胞產(chǎn)物，如單克隆抗體。,產(chǎn)物表達(dá)的最優(yōu)化條件,細(xì)胞生長(zhǎng)的最優(yōu)化條件并不一定是產(chǎn)物表達(dá)的最優(yōu)化條件。產(chǎn)物常常在細(xì)胞的衰退期得到最佳表達(dá)，而不是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。目前在穩(wěn)定期或衰退期控制基因表達(dá)仍很困難。 產(chǎn)物表達(dá)的問(wèn)題主要是生物學(xué)方面的，這些問(wèn)題的生物學(xué)解決辦法有： 1、建立能更高密度生長(zhǎng)或?qū)ιL(zhǎng)條件要求不太嚴(yán)格的細(xì)胞系。 2、開(kāi)發(fā)能大量生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)品的細(xì)胞系。 3、有可能通過(guò)誘導(dǎo)分裂或誘導(dǎo)存在質(zhì)粒的表達(dá)使細(xì)胞具有高水平的產(chǎn)物表達(dá)。 4、開(kāi)發(fā)更好的克隆載

33、體。,五、硬件和過(guò)程設(shè)計(jì)參數(shù),與大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)有關(guān)的反應(yīng)器和設(shè)備問(wèn)題可歸納為： 1、細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的控制（溫度、溶解氧、二氧化碳、pH值、滲透壓） 2、污染的排除（閥門(mén)設(shè)計(jì)、流體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、培養(yǎng)基滅菌） 3、抑制潛在的生物病毒物的擴(kuò)散（反應(yīng)器的取樣，產(chǎn)物的收獲） 4、為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞提供足夠的表面積（固體介質(zhì)的性質(zhì)、培養(yǎng)系統(tǒng)的比表面積） 5、在培養(yǎng)中對(duì)剪切力的控制（攪拌、通氣、細(xì)胞收獲）,六、產(chǎn)物收獲,得到大量的細(xì)胞所需解決的問(wèn)題包括： 1、開(kāi)發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)方法和工藝，提高細(xì)胞密度，使收獲細(xì)胞容易。特別是貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。 2、凍存好細(xì)胞，確保細(xì)胞種子的重復(fù)性。,與蛋白質(zhì)收獲有關(guān)的問(wèn)題包括：,1、在生

34、長(zhǎng)培養(yǎng)基中存在污染產(chǎn)物的血清蛋白質(zhì)。 2、由培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞產(chǎn)物濃度很低。 3、在培養(yǎng)條件下產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。,解決蛋白質(zhì)純化的方法包括：,1、使用無(wú)血清（甚至無(wú)蛋白）培養(yǎng)基使“污染”蛋白量最少。 2、開(kāi)發(fā)產(chǎn)物特異的親和柱。 3、開(kāi)發(fā)篩選技術(shù)以快速地確定產(chǎn)生大量產(chǎn)物的細(xì)胞克隆。 4、開(kāi)發(fā)在無(wú)血清培養(yǎng)基中穩(wěn)定蛋白質(zhì)產(chǎn)物以及抑制細(xì)胞內(nèi)、外蛋白酶活性的方法。 5、采用中空纖維、微囊或其他合適的技術(shù)分離或濃縮產(chǎn)物。 純化的步驟不僅要求效率高，而且盡量不在產(chǎn)物中加入不需要的組分。,第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器,生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)需滿(mǎn)足的要求,1、生物因素：生物相容性，模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境。 2、化學(xué)

35、因素：必須提供足夠的停留時(shí)間，完成所需要的轉(zhuǎn)化率，符合過(guò)程反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的要求。 3、傳質(zhì)因素：滿(mǎn)足物質(zhì)傳遞的要求。 4、傳熱因素：有能力除去和加入反應(yīng)過(guò)程的熱量。 5、安全因素：有毒害的反應(yīng)物和產(chǎn)物的隔離，有優(yōu)良的防污染性能。 6、操作因素：便于操作和維修。,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器,自20世紀(jì)，70年代以來(lái)，用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的生長(zhǎng)反應(yīng)器有了很大的發(fā)展，種類(lèi)越來(lái)越多，規(guī)模也越來(lái)越大。根據(jù)生物反應(yīng)器的不同用途，有懸浮培養(yǎng)用、貼壁培養(yǎng)用、包埋培養(yǎng)用生物反應(yīng)器等，其種類(lèi)大致上有塑料增殖器、填充床增殖器、多層板增殖器、螺旋增殖器、管式螺旋增殖器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀增殖器、流化床反應(yīng)器、中空纖維及其他膜式反

36、應(yīng)器、槳式攪拌反應(yīng)器、棒式攪拌反應(yīng)器、船舶推進(jìn)槳反應(yīng)器、傾斜槳葉攪拌反應(yīng)器、般帆形攪拌反應(yīng)器、往復(fù)振動(dòng)錐孔篩板攪拌反應(yīng)器、籠式通氣攪拌反應(yīng)器、雙層籠式通氣攪拌反應(yīng)器、空氣提升式反應(yīng)器等。,一、生物反應(yīng)器的種類(lèi),1、懸浮培養(yǎng)用 有空氣提升式（如英國(guó)Celltech公司和瑞士Chemap公司）、攪拌槽（如美國(guó)NBS公司和德國(guó)GBF）、中空纖維管（如美國(guó)Bioresponse和Invitron公司）及陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀生物反應(yīng)器。 2、貼壁培養(yǎng)用 有攪拌槽（微載體系統(tǒng)）、中空纖維管和陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀生物反應(yīng)器。 3、包埋培養(yǎng)用 有流化床（如美國(guó)Bellco公司）、固定床生物反應(yīng)器。,二、氣升式細(xì)胞

37、培養(yǎng)生物反應(yīng)器,氣升式反應(yīng)器的基本原理如圖所示。氣體混合物從底部的噴射管進(jìn)入反應(yīng)器的中央導(dǎo)流管使得中央導(dǎo)流管側(cè)的液體密度低于外部區(qū)域從而形成循環(huán)。氣升式生物反應(yīng)器主要采用內(nèi)循環(huán)式，但也有采用外循環(huán)式。,氣升式生物反應(yīng)器,與攪拌式生長(zhǎng)反應(yīng)器相比，氣升式生物反應(yīng)器產(chǎn)生的湍流溫和而均勻，剪切力相當(dāng)小，反應(yīng)器內(nèi)沒(méi)有機(jī)械運(yùn)動(dòng)部件，因而細(xì)胞損傷率比較低；同時(shí)由于采用直接噴射空氣供氧，氧傳遞速率高；液體循環(huán)量大，能使細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)成分均勻地分布于培養(yǎng)基中。,氣升式生物反應(yīng)器特點(diǎn),氣升式反應(yīng)器和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的抗體產(chǎn)率比較,在氣升式生物反應(yīng)器中，溶氧的控制可以通過(guò)自動(dòng)調(diào)節(jié)進(jìn)入空氣的速率來(lái)實(shí)現(xiàn)；PH值可通過(guò)在進(jìn)氣中加

38、入二氧化碳或加入氫氧化鈉來(lái)控制。 八種細(xì)胞的有關(guān)培養(yǎng)數(shù)據(jù)，可以看出同傳統(tǒng)的方法（培養(yǎng)瓶和滾瓶）相比，氣升反應(yīng)器的抗體產(chǎn)量平均提高4.6倍。,三、中空纖維管生物反應(yīng)器,中空纖維管生物反應(yīng)器如下頁(yè)圖所示，它的用途較廣，既可培養(yǎng)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴(lài)性細(xì)胞，細(xì)胞的密度最高可達(dá)109/ml數(shù)量級(jí)。如果控制系統(tǒng)不受污染，能長(zhǎng)期運(yùn)轉(zhuǎn)。已用這種反應(yīng)器培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞型和生產(chǎn)的分泌產(chǎn)物如表所示（P44，表2-6）。,中空纖維反應(yīng)器示意圖,中空纖維管生物反應(yīng)器已進(jìn)入工業(yè)生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。,中空纖維式生物反應(yīng)器,平床式中空纖維式生物反應(yīng)器,四、通氣攪拌生物反應(yīng)器,CelliGen

39、籠式通氣攪拌器,攪拌式生物反應(yīng)器,Celligen plus,Celligen 310,Celligen系列生物反應(yīng)器工作原理,CellGen plus生物反應(yīng)器,五、無(wú)泡攪拌反應(yīng)器,無(wú)泡攪拌反應(yīng)器是一種裝有膜攪拌器的生物反應(yīng)器。它采用多孔的疏水性塑料管裝配成通氣攪拌漿，具有良好的氧通透性，同時(shí)解決了通氣和均相化的要求。這類(lèi)反應(yīng)器能提供動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)中所需的氧，產(chǎn)生的剪切力較小，在通氣中不產(chǎn)生泡沫，已廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究和中試、工業(yè)生產(chǎn)。,六、動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器的控制,1、溶氧值：可通過(guò)改變通入培養(yǎng)罐內(nèi)氣體中的氧氣和氮?dú)獾谋壤?2、PH的調(diào)節(jié)：可采用二氧化碳/碳酸氫鈉緩沖液系統(tǒng)。 3、溫度和攪拌轉(zhuǎn)

40、速的控制。,其它：流化床生物反應(yīng)器,流化床生物反應(yīng)器的基本原理類(lèi)似于流態(tài)床化學(xué)反應(yīng)器，不同的是，流態(tài)化的固體是帶有細(xì)胞的微粒。培養(yǎng)液通過(guò)反應(yīng)器垂直向上循環(huán)流動(dòng)不斷提供給細(xì)胞必要的營(yíng)養(yǎng)成分，使細(xì)胞得以在微粒中生長(zhǎng)；同時(shí)，不斷地加入新鮮的培養(yǎng)液，并不斷地排除培養(yǎng)產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物。下頁(yè)圖為生產(chǎn)用CF-IMMOTM流化床生物反應(yīng)器的示意圖，這種反應(yīng)器的傳質(zhì)性能很好，并在循環(huán)系統(tǒng)中采用膜氣體交換器，能快速提供給高密度細(xì)胞所需的氧，同時(shí)排除代謝產(chǎn)物；反應(yīng)器中的液體流速足以使細(xì)胞微粒懸浮卻不會(huì)損壞脆弱的細(xì)胞。由于流化床生物反應(yīng)器滿(mǎn)足了高密度細(xì)胞培養(yǎng)、使高產(chǎn)量細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間停留在反應(yīng)器中、優(yōu)化細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成的環(huán)境等細(xì)胞培養(yǎng)的要求，流化床生物反應(yīng)器既可用于貼壁依賴(lài)性細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞的培養(yǎng)。,生產(chǎn)用CF-IMMOTM流化床生物反應(yīng)器示意圖,流化床生物反應(yīng)器與其它方法培養(yǎng)達(dá)到的細(xì)胞比較,固定床或流化床式生物反應(yīng)器,透析袋或膜式生物反應(yīng)器,動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)