實(shí)驗(yàn)15 瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法

1、瓊脂糖凝膠電泳的,原理和方法,1,概念：,以,瓊脂糖凝膠,作支持體的電泳方式。,一、概述,瓊脂（,agar,）,:,又名瓊膠、菜燕、凍粉，從石花菜及,其它紅藻類植物提取出來(lái)的藻膠。,1,）瓊脂糖：,由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的,中性物質(zhì),，不帶電荷。,2,）瓊脂膠：,一種含硫酸根和羧基的,強(qiáng)酸性多糖,，由于這些基團(tuán),帶有電荷，在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的,電滲,現(xiàn)象，加之,硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。,2,瓊脂糖鏈依靠分子內(nèi)和分子間氫鍵及其它力的,作用使其互相盤(pán)繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔,型凝膠。,D-,半乳糖,3,6-,脫水,-L-,半乳糖,3,4,5,瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)

2、行平板電泳，其,優(yōu)點(diǎn),1),瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單，電泳速度快，樣品不需事,先處理就可進(jìn)行電泳。,2),瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大,(,約占,98-99%),，近似,自由電泳，樣品擴(kuò)散度較自由電泳小，對(duì)樣品吸附極微，因,此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。,3),瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收，電泳過(guò)程和結(jié)果可直接用紫,外光燈監(jiān)測(cè)及定量測(cè)定。,4),電泳后區(qū)帶易染色，樣品易洗脫，便于定量測(cè)定。制,成干膜可長(zhǎng)期保存。,二、,瓊,脂糖凝,膠,的特點(diǎn),6,瓊脂糖凝膠電泳的,缺點(diǎn),：,1),機(jī)械強(qiáng)度差，易破碎，濃度不能太低；,2),易被細(xì)菌污染，不易保存，臨用前配制；,3),瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴(kuò)散，電泳

3、后,必須立即固定染色；,4),與,PAGE,相比，分子篩作用小，區(qū)帶少。,7,目前，瓊脂糖凝膠電泳常用于,分離、鑒定核酸,，如,DNA,鑒定、,DNA,限制性內(nèi)切酶圖譜制作等。由于這種方法操,作方便，設(shè)備簡(jiǎn)單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基,因工程研究中常用實(shí)驗(yàn)方法之一。,瓊脂糖也可用作為電泳支持物，分離,蛋白質(zhì)和同工酶,。,將瓊脂糖電泳與免疫化學(xué)相結(jié)合，發(fā)展成免疫電泳技術(shù)，,能鑒別其他方法不能鑒別的復(fù)雜體系，由于建立了超微量,技術(shù)，,0.1,g蛋白質(zhì)就可檢出。,三、,瓊,脂糖凝,膠電,泳的,應(yīng),用,8,瓊脂糖凝膠電泳對(duì)核酸的分離作用主要依據(jù)它們的相對(duì)分子質(zhì)量及分子構(gòu)型，,同時(shí)與凝膠的濃度也

4、有密切關(guān)系。,四、,DNA,的瓊脂糖凝膠電泳,DNA,分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。,DNA,分子在高于等,電點(diǎn)的,pH,溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖,-,磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重,復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙漣,DNA,幾乎具有等量?jī)綦姾?，因此它們能以同樣的速度向?極方向移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，,DNA,分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即,DN,A,分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的,DNA,片段泳動(dòng)速度不一樣，,可進(jìn)行分離。,DNA,分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳,不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的,DNA,，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相

5、同，但構(gòu)型不同,的,DNA,分子。,9,1.,核酸分子大小及瓊脂糖的濃度的關(guān)系,1)DNA,分子的大?。?DNA,分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和,分子篩效應(yīng)。,DNA,分子在高于等電點(diǎn)的,pH,溶液中帶,負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖,-,磷酸骨架,在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙漣,DNA,幾乎具,有等量?jī)綦姾?，因此在一定的電?chǎng)強(qiáng)度下，,DNA,分,子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即,DNA,分子本身,的大小和構(gòu)型。,10,在凝膠中，,DNA,片段遷移距離,(,遷移率,),與堿,基對(duì)的對(duì)數(shù)成反比，因此通過(guò)已知大小的標(biāo)準(zhǔn),物移動(dòng)的距離與未知片段的移動(dòng)距離進(jìn)行比較，,便可測(cè)出未知片段的大

6、小。,但是當(dāng),DNA,分子大小超過(guò),20kb,時(shí)，普通瓊脂,糖凝膠就很難將它們分開(kāi)。此時(shí)電泳的遷移率,不再依賴于分子大小，因此，應(yīng)用瓊脂糖凝膠,電泳分離,DNA,時(shí)，分子大小不宜超過(guò)此值。,11,2),瓊脂糖的濃度：,不同大小的,DNA,需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn),行電泳分離,如下表所示,:,12,2.,核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系,不同構(gòu)型,DNA,的移動(dòng)速度次序?yàn)椋?共價(jià)閉環(huán),DNA,(covalently closed circular,，簡(jiǎn)稱,cccDNA),直線,DNA,開(kāi)環(huán)的雙鏈環(huán)狀,DNA,。當(dāng)瓊脂糖濃度太高時(shí)，環(huán)狀,DNA(,一般為球形,),不能進(jìn)入膠中，相對(duì)遷移率為,

7、0(Rm=O),，,而同等大小的直線雙鏈,DNA(,剛性棒狀,),則可以長(zhǎng)軸方向前,進(jìn),(Rm,O),，由此可見(jiàn)，這,3,種構(gòu)型的相對(duì)遷移率主要取,決于凝膠濃度，但同時(shí)也受到電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng),度等的影響。,13,3.,電泳方法,1),凝膠類型,用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型,及水平型,(,平板型,),。水平型電泳時(shí)，凝膠板完全浸,泡在電極緩沖液下,1-2mm,，故又稱為潛水式。目前,更多用的是后者，因?yàn)樗颇z和加樣比較方便，電,泳槽簡(jiǎn)單，易于制作，又可以根據(jù)需要制備不同規(guī),格的凝膠板，節(jié)約凝膠，因而受到人們的歡迎。,14,2),緩沖液系統(tǒng),缺少離子時(shí)，電流太小，,DNA,遷移慢

8、；相反，高,離子強(qiáng)度的緩沖液由于電流太大會(huì)大量產(chǎn)熱,，嚴(yán),重時(shí)，會(huì)造成膠熔化和,DNA,的變性。,常用的電泳緩沖液有,EDTA(pH8.0),和,Tris-,乙酸,(,TAE),，,Tris-,硼酸,(TBE),或,Tris-,磷酸,(TPE),等，濃度,約為,50mmol/L(pH7.5-7.8),。電泳緩沖液一般都配,制成濃的貯備液，臨用時(shí)稀釋到所需倍數(shù)。,TAE,緩沖能力較低，后兩者有足夠高的緩沖能力,，因此更常用。,TBE,濃溶液長(zhǎng)期貯存會(huì)出現(xiàn)沉淀，,為避免此缺點(diǎn)，室溫下貯存,5,溶液，用時(shí)稀釋,10,倍。,0.5,工作液也可提供足夠的緩沖能力。,15,3),凝膠的制備,以稀釋的電極緩

9、沖液為溶劑，用沸水浴或微波,爐配制一定濃度的溶膠，冷卻至,45-50,時(shí)灌入,水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。,4),樣品配制與加樣,DNA,樣品用適量,Tris-EDTA,緩沖液溶解，緩沖溶,解液內(nèi)含有,0.25%,溴酚藍(lán)或其他指示染料，含有,1,0%-15%,蔗糖或,5%-10%,甘油，以增加其比重，使樣,品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結(jié)果產(chǎn)生,U,形條帶，可改用,2.5% Ficoll(,聚蔗糖,),代替蔗糖,或甘油。,16,5),電泳,瓊脂糖凝膠分離大分子,DNA,實(shí)驗(yàn)條件的研究結(jié)果表,明：在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓,條件下，線性,DNA,分子的電泳遷移率與

10、所用的電壓呈正,比。但是，在電場(chǎng)強(qiáng)度增加時(shí)，較大的,DNA,片段遷移率,的增加相對(duì)較小。因此隨著電壓的增高，電泳分辨率,反而下降，為了獲得電泳分離,DNA,片段的最大分辨率，,電場(chǎng)強(qiáng)度不宜高于,5V/cm,。,電泳系統(tǒng)的溫度對(duì)于,DNA,在瓊脂糖凝膠中的電泳行,為沒(méi)有顯著的影響。通常在室溫下進(jìn)行電泳，只有當(dāng),凝膠濃度低于,0.5%,時(shí)，為增加凝膠硬度，可在,4,，進(jìn),行電泳。,6),染色和拍照,常用熒光染料溴乙錠,(EB),染色，在紫外光下觀察,D,NA,條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出,照片，并進(jìn)行有關(guān)的數(shù)據(jù)分析。,五、瓊脂糖凝膠電泳分離血漿脂蛋白,?,原理,血漿脂蛋白經(jīng)飽和蘇丹

11、黑,B,預(yù)染后，以瓊,脂糖凝膠為支持介質(zhì)，在,pH8.6,巴比妥緩沖液,中電泳，根據(jù)各脂蛋白的組成、大小、形狀,分離成不同區(qū)帶。,(,一,),血漿脂蛋白,(lipoprotein),的組成,ApoA ApoB,蛋白質(zhì)：即載脂蛋白,ApoC ApoD ApoE,甘油三酯,（,TG,）,脂類,：,磷脂,（,PL,）,游離膽固醇,（,FC,）,膽固醇酯,（,CE,）,少量糖,（二）分類,1.,按電泳法分,乳糜微粒（,chylomicron,CM,）,?,-,脂蛋白,（,?,-,位）,前,?,-,脂蛋白（,?,2,-,位）,?,-,脂蛋白,（,?,1,-,位）,2.,按超速離心法分,乳糜微粒,( 0.

12、96 ),(chylomicron, CM),極低密度脂蛋白,(0.96,?,1.006),(very low density lipoprotein, VLDL),中間密度脂蛋白,(1.006,?,1.019),(intermediate density lipoprotein, IDL),低密度脂蛋白,LDL(1.019,?,1.063),(low density lipoprotein, LDL),高密度脂蛋白,HDL(1.063,?,1.21),(high density lipoprotein, HDL),（三）結(jié),構(gòu),特,征,CM,VLDL,LDL,HDL,甘油三脂,膽固醇,蛋白質(zhì)

13、,帶電量（,Q,）,pH8.6,為例,顆粒大?。?mm,）,密度,電泳速度,形態(tài),多,多,少,少,大,低,慢,規(guī)則,不規(guī)則,少,少,多,多,小,高,快,?,pH,8.6,pI,，各種脂蛋白均帶負(fù)電，電泳時(shí)由,負(fù)極到正極；,VLDL,為圓形，受阻力小，,LDL,形態(tài),不規(guī)則，受阻力大，所以,VLDL,跑在前。,加,樣,槽,前, ,CM LDL VLDL HDL,+,臨床應(yīng)用：高脂蛋白血癥的分型,CM ,前, ,正常,型,a,型,b,型,型,型,型,六、操,作,溶,膠,準(zhǔn)備膠槽,凝膠冷卻至,50,C,，加,EB,至終濃度,0.5,g/ml,鋪,膠,凝膠凝固后取出梳子,加緩沖液,準(zhǔn)備樣品,點(diǎn),樣,電

14、,泳,注意觀察溴酚藍(lán)染液的遷移,瓊脂糖凝膠中,DNA,的觀察,溴化乙錠（,EB,）,DNA,：紫外光下,紅色熒光,紫外燈下觀察電泳結(jié)果,照,相,瓊,脂糖凝,膠電,泳是常用的用于分離、,鑒,定,DNA,、,RNA,分子混合物的方法，,這種電,泳方法以,瓊,脂凝,膠,作,為,支持物，利用,DNA,分子在泳,動(dòng)時(shí),的,電,荷效,應(yīng),和分子,篩,效,應(yīng),，,達(dá),到分離混合物的目的。,DNA,分子在高于其等,電,點(diǎn)的溶液中,帶負(fù)電,，在,電場(chǎng),中向,陽(yáng)極,移,動(dòng),。在一定的,電場(chǎng),強(qiáng)度下，,DNA,分子的,遷,移速度取,決,于分子,篩,效,應(yīng),，即分,子本身的大小和,構(gòu),型是主要的影,響,因素。,DNA

15、,分子的,遷,移速度,與,其相,對(duì),分子量成,反比。不同,構(gòu),型的,DNA,分子的,遷,移速度不同。如,環(huán),形,DNA,分子,樣,品，其中有三,種構(gòu),型的分子：共價(jià),閉,合,環(huán)狀,的超螺旋分子（,cccDNA,）、,開(kāi)環(huán),分子,(ocDNA),、和,線,形,D,NA,分子,(IDNA),。,這,三,種,不同,構(gòu),型分子,進(jìn),行,電,泳,時(shí),的,遷,移速度大小,順,序,為,:cccDNA,IDNA,ocDNA,當(dāng),用低,濃,度的,熒,光嵌入染料,溴,化乙,啶,(Ethidium bromide, EB),染色，在紫,外光下至少可以,檢,出,1-10ng,的,DNA,條帶,，,從,而可以確定,DN

16、A,片段在凝,膠,中的位置。,此外，,還,可以,從電,泳后的凝,膠,中回收特定的,DNA,條帶,，用于以后的克隆操作。,實(shí)驗(yàn)原理,一、,實(shí)驗(yàn),目的,掌握,瓊,脂糖凝,膠電,泳分離,DNA,的原理和方法,DNA,分子在,堿,性,緩,沖液中,帶負(fù)電,荷,，在外加,電場(chǎng),作用下,向正,極,泳,動(dòng),。,DNA,分子在,瓊,脂糖凝,膠,中泳,動(dòng)時(shí),，有,電,荷效,應(yīng)與,分子,篩,效,應(yīng),。不同,DNA,的分子量大小及,構(gòu),型不同，,電,泳,時(shí),的泳,動(dòng),率就不同，,從,而分出不同的,區(qū)帶,。,二、,實(shí)驗(yàn),原理,瓊,脂糖,是一,種,天然聚合,長(zhǎng)鏈狀,分子，可以形成具有,剛,性的,濾,孔，凝,膠,孔,徑,的大小,決,定于,瓊,脂糖的,濃,度,。,瓊,脂糖凝,膠電,泳法分離,DNA,，主要是利用分子,篩,效,應(yīng),，,遷,移速度,與,分子量的,對(duì)數(shù)值,成反比,關(guān),系。因而就可依,據(jù),DNA,分子的大小使其分離。,該過(guò),程可以通,過(guò),把,分子量,標(biāo),準(zhǔn),參,照物,和,樣,品一起,進(jìn),行,電,泳而得到,檢測(cè),。,溴,化乙,錠,（,EB,）,為,扁平,狀,分子