1細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

1、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 周立軍,參考書目,細(xì)胞培養(yǎng)，世界圖書出版公司，1996年 培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) ，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2004年,本次課內(nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識(shí),一、緒論 培養(yǎng)法的種類、培養(yǎng)法的發(fā)展、細(xì)胞培養(yǎng)的常用術(shù)語、培養(yǎng)細(xì)胞的作用及意義、培養(yǎng)法的應(yīng)用 二、培養(yǎng)細(xì)胞的特征 培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式和類型、 培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)和生長增殖過程、 細(xì)胞培養(yǎng)的條件及影響因素,一、緒論,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是選用各種細(xì)胞的最佳生存條件對活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)。 即：從活體中取出小塊組織分離出細(xì)胞，在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使之能繼續(xù)生存、生長、增殖的一種方法。 涉及有細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)與分子生

2、物學(xué)、動(dòng)物學(xué)與植物學(xué)、病原學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、生物工程學(xué)甚至光學(xué)、物理學(xué)等等學(xué)科。因其涉及面很廣所以已經(jīng)滲透到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域,細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture,組織培養(yǎng)的概念,組織培養(yǎng)（tissue culture）： 其本意是指從體內(nèi)取出組織和細(xì)胞，模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存和生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法,器官培養(yǎng)（Organ culture）： 指的是應(yīng)用和組織培養(yǎng)相似的條件，培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個(gè)器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法，以上三個(gè)層次的培養(yǎng)，又可統(tǒng)稱之為體外培養(yǎng)（in vitro,培養(yǎng)法的種類,體外培養(yǎng) 細(xì)胞培

3、養(yǎng) 組織培養(yǎng) 器官培養(yǎng),體 外 培 養(yǎng) 種 類,細(xì)胞培養(yǎng)可分為群體培養(yǎng)和克隆培養(yǎng)兩種。 群體培養(yǎng)（mass culture）：即將大量細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中，讓其貼壁或懸浮生長，形成均勻的單層細(xì)胞或單細(xì)胞懸液。 克隆培養(yǎng)（clone culture）：即將少數(shù)細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶中，貼壁后彼此間隔距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過繁殖每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)集落，稱為克隆,群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右,原代培養(yǎng)第4天，成纖維樣細(xì)胞散布于培養(yǎng)瓶底，個(gè)別集落形成，細(xì)胞圍繞中心漩渦狀排列100,原代培養(yǎng)第7天，多個(gè)集落形成并融合100,培養(yǎng)法的發(fā)展,組織培養(yǎng)法的發(fā)展經(jīng)歷近百年。 德國人Roux（1885）用溫生理鹽水體外培養(yǎng)雞胚組織并存

4、活數(shù)月被認(rèn)為是組織培養(yǎng)的萌芽試驗(yàn)。 1903年Jolly用蓋片懸滴培養(yǎng)法，培養(yǎng)蠑螈白細(xì)胞生活一個(gè)月，提示組織或細(xì)胞離體后，在人工培養(yǎng)條件下，仍能生存,發(fā)展簡史,培養(yǎng)法的發(fā)展,關(guān)于神經(jīng)軸突的結(jié)構(gòu)和形成有爭議。 哈里森（生理學(xué)家）首先解剖了蛙胚的原始脊髓節(jié)段在淋巴液中進(jìn)行培養(yǎng)。 在顯微鏡下觀察到從神經(jīng)芽細(xì)胞延伸出神經(jīng)軸突的狀況。 建立起一套合理的無菌培養(yǎng)技術(shù) 哈里森懸滴培養(yǎng)法,發(fā)展簡史,哈里森懸滴培養(yǎng)法,將蛙胚原始脊髓節(jié)段，移到事先滴有從成體蛙淋巴囊吸取的新鮮淋巴的蓋玻片上， 淋巴很快凝固，使組織小塊固定在一定的位置上。 然后將蓋玻片倒置于一塊中央凹陷的厚載玻片上，蓋玻片的周緣用蠟封固。 蛙胚神經(jīng)

5、組織存活了數(shù)周體外培養(yǎng)組織和細(xì)胞的基本模式系統(tǒng),發(fā)展簡史,卡氏瓶的發(fā)明,Carrel用反復(fù)傳代的方法使細(xì)胞系存活34年。他采用的無菌技術(shù)，以及后來設(shè)計(jì)的培養(yǎng)瓶（卡氏瓶，Carrel flask）等都是對組織培養(yǎng)的重要貢獻(xiàn)。特別是他的連續(xù)培養(yǎng)，為后來的傳代培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ),發(fā)展簡史,組織培養(yǎng)發(fā)展示意圖,1923年，Carrel設(shè)計(jì)了卡式瓶培養(yǎng)法，擴(kuò)大了組織的生存空間。 1924年Maximow的雙蓋片培養(yǎng)法，使之更易于傳代和減少污染,發(fā)展簡史,1957年Dulbecco 等采用胰蛋白酶消化處理和應(yīng)用液體培養(yǎng)基的方法，獲得了的單層細(xì)胞培養(yǎng)，單層培養(yǎng)成了組織培養(yǎng)普遍應(yīng)用的技術(shù)。促進(jìn)了細(xì)胞系(cell

6、line)的建立。 近年各種條件已商品化系列化，應(yīng)用冷凍技術(shù)，各國建立細(xì)胞庫,發(fā)展簡史,我國組織培養(yǎng)的發(fā)展,20世紀(jì)30年代傳入我國。 20世紀(jì)50年代起步。 20世紀(jì)70年代，成為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究中應(yīng)用的手段,組織培養(yǎng)常用術(shù)語,原代培養(yǎng)（primary culture）：從直接取自生物體細(xì)胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。 傳代培養(yǎng)（passage culture）：將細(xì)胞以一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代培養(yǎng)。 注：傳代（passage，subculture,原代培養(yǎng),胎兒細(xì)胞培養(yǎng)比成人容易；成體組織中成纖維細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞比較容易，上皮細(xì)胞培養(yǎng)難。 細(xì)胞間的分離酶：胰蛋白酶、膠原酶、

7、 單一種類細(xì)胞的分離培養(yǎng)：根據(jù)培養(yǎng)條件培養(yǎng)基、細(xì)胞接著面的條件、接著速度、離心法等,術(shù)語,細(xì)胞系（cell line）：原代培養(yǎng)經(jīng)首次傳代成功后即成細(xì)胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系所組成。 細(xì)胞株（cell strain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的特殊性質(zhì)或標(biāo)志，并能穩(wěn)定保持這些特性的培養(yǎng)物。 克?。╟lone）：指單個(gè)細(xì)胞通過有絲分裂所產(chǎn)生的遺傳性狀相同的細(xì)胞群體,術(shù)語,有分化特性的細(xì)胞系和細(xì)胞株,對細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的評價(jià),優(yōu)點(diǎn)： 1、活細(xì)胞： 能長時(shí)間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)； 2、可控制： 選擇對象：均一性、重復(fù)性（類型、性質(zhì)、階段）

8、； 調(diào)節(jié)條件：各種因素（物理、化學(xué)、生物等因素）； 利用方法：研究技術(shù)、記錄方法； 3、應(yīng)用廣： 領(lǐng)域多：醫(yī)學(xué)研究、生物技術(shù)、基因工程等 對象廣：各種動(dòng)物（低等動(dòng)物-高等動(dòng)物-人類） 一種動(dòng)物（不同年齡、不同組織） 正?；虍惓＃[瘤） 4、較經(jīng)濟(jì)： 可提供大量、同時(shí)、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實(shí)驗(yàn)對象,缺點(diǎn)： 1、培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)發(fā)生改變； 2、對人員、設(shè)備等要求較高。 與體內(nèi)主要不同 相對孤立、相對單一、缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響。 主要表現(xiàn) 失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)、分化減弱、細(xì)胞趨向單一化。 提示 要正確認(rèn)識(shí)體外培養(yǎng)細(xì)胞是一種特定條件下生長的細(xì)胞群體,對細(xì)胞培

9、養(yǎng)技術(shù)的評價(jià),細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究、觀察內(nèi)容,細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)：例如能量的代謝、DNA轉(zhuǎn)錄、凋亡及蛋白合成等。 細(xì)胞內(nèi)部與細(xì)胞外界之間的作用：如細(xì)胞對外界刺激的反應(yīng)、藥物對細(xì)胞的作用、細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌等。 細(xì)胞間的相互作用：如形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞間的粘著作用、接觸抑制、密度抑制等。 細(xì)胞內(nèi)的流動(dòng)：如信號(hào)傳導(dǎo)、鈣離子的流動(dòng)、RNA的移動(dòng)、激素受體復(fù)合物的易位等。 遺傳學(xué)：如遺傳分析、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化等,細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用領(lǐng)域,一）、在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用 （二）、在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用 （三）、在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用 （四）、在遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用 （五）、在藥理學(xué)研究中的應(yīng)用 （六）、在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用 （七）、在腫瘤

10、學(xué)研究中的應(yīng)用 （八）、在器官移植中的應(yīng)用,病毒檢驗(yàn)方法,病毒學(xué),檢測病毒,雜交瘤技術(shù)Hybridomas,免疫學(xué),單克隆抗體制備,免疫學(xué),在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用,1、 體外培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 2、 DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù) 3、基因診斷和基因治療,器官移植組織工程,種子細(xì)胞（干細(xì)胞） 支架材料,組織工程,二、培養(yǎng)細(xì)胞的基本特征,培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式和類型 培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)和生長增殖過程 細(xì)胞培養(yǎng)的條件及影響因素,一）培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式和類型,粘附型細(xì)胞：附著在某一固相支持物表面才 能生長的細(xì)胞。 如：成纖維細(xì)胞、心肌與平滑肌細(xì)胞、表皮細(xì)胞、骨與軟骨細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞 懸浮型細(xì)胞：不必附著于固相支持物表面，而

11、 在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。 如：血、脾及骨髓培養(yǎng)的細(xì)胞及某些癌細(xì)胞,粘附型（貼壁型）細(xì)胞,粘附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式 細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式存在差異 體內(nèi)：粘附是全方位，外形具有復(fù)雜的立體特征。 體外：細(xì)胞只有一個(gè)附著平面，外形一般與體內(nèi)時(shí) 明顯不同,粘附型細(xì)胞,成纖維型細(xì)胞,上皮型細(xì)胞,游走型細(xì)胞,多形型細(xì)胞,成纖維型細(xì)胞,來源：中胚層間充質(zhì)組織起源的細(xì)胞，如：成纖維細(xì)胞、心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞。 形態(tài)：類似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出23個(gè)長短不等的突起，中央有卵圓形核。 生長特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀生長

12、,上皮型細(xì)胞,來源：起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞，如：皮膚及其衍生物、消化道、乳腺、肺泡、上皮性腫瘤等。 形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，呈扁平、不規(guī)則、多角形，中有圓形核。 生長特點(diǎn)：細(xì)胞緊密相連成單層膜 相靠緊密相連成薄層鋪石狀,培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不穩(wěn)定，可因各種因素而發(fā)生改變，如pH、細(xì)胞密度、污染等因素。 HeLa細(xì)胞： 血清 高血清成纖維樣細(xì)胞 低血清上皮樣細(xì)胞 pH 標(biāo)準(zhǔn)pH上皮樣細(xì)胞 太酸或太堿成纖維樣細(xì)胞 細(xì)胞密度 低密度成纖維樣細(xì)胞 高密度上皮樣細(xì)胞 轉(zhuǎn)化與否 未轉(zhuǎn)化成纖維樣細(xì)胞 轉(zhuǎn)化后上皮樣細(xì)胞,粘附型細(xì)胞,懸浮型細(xì)胞,概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生

13、長。 來源：取自血液、脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞腫瘤細(xì)胞為主。 特點(diǎn)：在懸浮中生長良好，細(xì)胞圓形，呈單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán),優(yōu)點(diǎn)： 生存空間大，提供數(shù)量大 傳代方便(不需消化) 易于收獲 可獲得穩(wěn)定狀態(tài) 缺點(diǎn)： 觀察不方便 很多細(xì)胞不能懸浮生長(尤以正常細(xì)胞,懸浮型細(xì)胞,培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn),粘附并伸展 是大多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞的基本生長特點(diǎn)。細(xì)胞在接種后很快便可見到細(xì)胞伸出偽足附著，與支持物形成一些接觸點(diǎn)，接著細(xì)胞逐漸呈扁平或放射狀伸展，逐漸形成上皮型或成纖維型或其他類型生長。 密度依賴性 細(xì)胞接種密度過高或過低都會(huì)影響細(xì)胞的生長、增殖。當(dāng)細(xì)胞粘附生長、融合成單層時(shí)，細(xì)胞變得較為擁擠，而扁平形狀的程度減少，

14、與培養(yǎng)基的接觸面減少，同時(shí)，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物逐漸消耗，細(xì)胞分裂減弱，增殖減慢,二、培養(yǎng)細(xì)胞的生長增殖過程,單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞周期（cell cycle） 細(xì)胞系的生長過程 培養(yǎng)細(xì)胞傳代的生存期,單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞周期（cell cycle,生長增殖過程,組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期,原代培養(yǎng)期 傳 代 期 衰 退 期,原代培養(yǎng)期,又稱初代培養(yǎng)期 （primary culture），從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)14周。 此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛；細(xì)胞形態(tài)相似。 細(xì)胞群是異質(zhì)的，也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng),傳代培養(yǎng)期 初代培養(yǎng)期一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系ce

15、ll line。 此期為三期中最長，可維持二倍體核型（二倍 體細(xì)胞系）。 當(dāng)傳代3050代后，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以致 完全停止。 衰退期 細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài) 輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡,體外培養(yǎng)細(xì)胞一代增殖生長過程,第3代BMSCs的分裂指數(shù)曲線,接觸抑制（contact inhibition）：貼壁生長的體外正常細(xì)胞一旦匯合、相互接觸后便停止了分裂增殖，不再進(jìn)入S期，也不會(huì)出現(xiàn)交叉重疊生長。 惡性細(xì)胞無接觸抑制現(xiàn)象，所以可將其作為區(qū)別正常細(xì)胞與癌細(xì)胞的標(biāo)志之一。 密度抑制（density inhibition）：培養(yǎng)液營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物

16、的影響，發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止,培養(yǎng)細(xì)胞生長過程中的特點(diǎn),傳代細(xì)胞可連續(xù)傳710代，細(xì)胞形狀基本相同，但隨著傳代次數(shù)增多，細(xì)胞逐漸呈老化現(xiàn)象，表現(xiàn)為:細(xì)胞增殖速度明顯減慢，胞漿中出現(xiàn)空泡及顆粒樣物質(zhì)，細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)楸馄?，失去貼壁能力，從培養(yǎng)瓶底脫落,三、細(xì)胞培養(yǎng)的條件,水高度純化 糖葡萄糖 氨基酸12種 維生素 無機(jī)離子和微量元素 促生長因子,各種培養(yǎng)基,血 清,血清的種類 血清的主要成分及主要作用 血清的使用與儲(chǔ)存 影響血清的各種因素 細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn),1、血清的種類 胎牛血清：剖腹產(chǎn)的胎牛 牛血清 新生牛血清：出生24h之內(nèi)的新生牛 小牛血清：出生1030d的小

17、牛 （人血清、馬血清、羊血清） 2、血清的主要成分及主要作用 血清是由血漿去除纖維蛋白而形成，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機(jī)物等，這些物質(zhì)對促進(jìn)細(xì)胞生長活性是達(dá)到生理平衡的,血清的主要作用,提供基本營養(yǎng)物質(zhì) 提供貼壁和擴(kuò)展因子（FN、LN） 提供激素及各種生長因子 （FGF、EGF、PDGF) 提供結(jié)合蛋白（中和代謝產(chǎn)物及蛋白分解酶等細(xì)胞障礙因素） 對培養(yǎng)中的細(xì)胞提供某些保護(hù)作用注意點(diǎn)： 血清型號(hào)、種類不同，所含營養(yǎng)因素有差別，不可忽視； 在需要觀察細(xì)胞某種特性時(shí)，血清使問題變復(fù)雜，要除去,血清的使用與儲(chǔ)存,使用前的處理 56滅活30min 去除補(bǔ)體成分

18、（趨勢：大部分細(xì)胞培養(yǎng)不需滅活； 需要滅活的：巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞等） 儲(chǔ)存條件 滅活后分裝成小包裝（10mL、20mL、50mL），20 儲(chǔ)存；使用前4 融化。 使用濃度 一般為520，最常用的是10,影響血清的各種因素,年齡：較老動(dòng)物的血清對細(xì)胞生長有抑制作用 血型：AB型血清比A型和O型血清對細(xì)胞生長有利 血色素 膽紅質(zhì) 脂肪酸 血清在培養(yǎng)液中的濃度并非越高越好,細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn),使用血清有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)。 如：血清可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長，同時(shí)會(huì)抑制表皮角質(zhì)細(xì)胞的生長。 血清中含有一些物質(zhì)對細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒性作用。 如：多胺氧化酶 每批血清之間都有

19、差別，其成分不能保持一致。 取材過程中有可能帶入支原體、病毒，對培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生影響,影響細(xì)胞生長的因素,溫度 滲透壓 氣體環(huán)境和pH 無毒和有毒 輻射線和超聲波 細(xì)胞接種密度 容器轉(zhuǎn)動(dòng)速度和懸浮攪動(dòng)速度,溫 度,一般哺乳類及禽類細(xì)胞體外培養(yǎng)的適宜溫度3738，溫度過高或過低都會(huì)影響到細(xì)胞的生長,溫度對細(xì)胞生長的影響,低 溫,在低溫下，細(xì)胞的代謝活力及核分裂降低。 溫度不低于0 時(shí)，雖影響細(xì)胞代謝，但并無傷害作用；再把細(xì)胞置于2535 時(shí)，細(xì)胞仍能生存和生長，但速度減慢。 若溫度過低，在降到冰點(diǎn)以下時(shí)，細(xì)胞因胞外水和胞質(zhì)結(jié)冰而受損死亡。 若向培養(yǎng)液中加入甘油或二甲基亞砜等，封入凍存管，置于液氮中，

20、細(xì)胞可耐受70 以下溫度，能長期儲(chǔ)存，解凍后細(xì)胞復(fù)蘇，仍能繼續(xù)生長增殖，生物性狀不受影響,高 溫,細(xì)胞在40數(shù)小時(shí)后，再置回37 培養(yǎng)，細(xì)胞仍能繼續(xù)生長；但如果在40 下暴露時(shí)間太長，對細(xì)胞生長不利，甚至變圓脫離瓶底。 細(xì)胞在3940 培養(yǎng)1h，能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)，但不能忍受溫度再升高2 ，持續(xù)數(shù)小時(shí)，即在4142 中培養(yǎng)1h，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，溫度至43 以上時(shí)細(xì)胞多數(shù)被殺死。 高溫主要引起酶的滅活、類脂質(zhì)破壞、核分裂的破壞，產(chǎn)生凝固酶使細(xì)胞發(fā)生凝固，另外使蛋白質(zhì)變性,氣體環(huán)境和pH,氧（O2） 參加細(xì)胞的三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量以供給細(xì)胞生長、增殖和合成各種所需成分。 采用開放式培養(yǎng)時(shí)

21、（碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)或培養(yǎng)板培養(yǎng)），一般要把細(xì)胞置于95空氣加5二氧化碳的混合氣體環(huán)境中,二氧化碳（CO2,CO2既是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，又是細(xì)胞生長所必需的成分，并與維持培養(yǎng)液的pH有關(guān)。 大多數(shù)細(xì)胞適于在pH 7.27.4條件下生長，低于pH 6.8或高于pH 7.6對細(xì)胞有害，甚至造成細(xì)胞退化或死亡。 細(xì)胞對堿性不如對酸性的變化耐受，偏酸的條件比偏堿的環(huán)境對細(xì)胞生長有利。 隨細(xì)胞數(shù)量的增多、代謝加強(qiáng)，釋放CO2增多，使pH 降低。為了維持培養(yǎng)基恒定的pH ，多在培養(yǎng)基中加入磷酸鹽等緩沖劑。 羥乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes）：對細(xì)胞無毒性，也不起緩沖作用，主要作用是防止pH迅速變動(dòng)，在開瓶通氣培養(yǎng)或活細(xì)胞觀察時(shí)能維持較恒定的pH值,無污染及無毒,直接或間接接觸的器皿、材料 污染：細(xì)菌等微生物、細(xì)胞間、有害物質(zhì),本章小結(jié),培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式和類型 培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)和生長增殖過程 細(xì)胞培養(yǎng)的條件及影響因素,細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè) 置、設(shè)備和準(zhǔn)備工作,一、細(xì)胞培養(yǎng)的必備設(shè)施,無菌實(shí)驗(yàn)室 超凈工作臺(tái) 恒溫培養(yǎng)箱 其他設(shè)備 （電熱干燥箱、冰箱、