臨床基因診斷進展_陳鳴

1、臨床分子生物學診斷進展,陳鳴 教授 主任醫(yī)師 第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院檢驗科,OUTLINE,測序技術 乙肝病毒耐藥突變檢測 預測某些疾病的遺傳風險程度 腫瘤化療藥物敏感試驗,生物芯片技術 固相芯片 液相芯片,基因組和分子檢測： 生物芯片技術,DNA 芯片,cDNA芯片,Oligo芯片,信息 生物芯片,多肽芯片,生物 芯片,微流體芯片,功能 生物芯片,芯片實驗室,組織芯片,蛋白芯片,抗體芯片,蛋白質(zhì)芯片,SAGE/CAGE,epigenetics芯片,質(zhì)粒microarray,微株array,基因組 genetics,轉(zhuǎn)錄組 mRNA,Introduction,Sc

2、ience”: Foder提出基因芯片概念 1991 第一張基因芯片：美國Affymetrix公司 1992 第一張以玻璃為載體的基因芯片： Stanford大學PBrown實驗室，1995 “Science”: Schena 基因表達譜的研究，1995 第一張實用型基因芯片：Affymetrix 1996 中國科學界第一次專項討論：第80次“香山科學會議”上， 1997年9月 1998年度自然科學領域十大進展之一 美國正式啟動基因芯片計劃：1998 “生物芯片技術”正式列入國家“863”計劃 ：1999,Sample DNA,Each spot contains known DNA,Bioc

3、hip,Complementary DNA hybridize,Signal appears,Biochip Based on Hybridization,7,我國殘疾人口有8296萬，其中耳聾殘疾人群占2004萬，占24%，累及2.6億家庭人口,耳聾人群,2006年第二次全國殘疾人抽樣調(diào)查數(shù)據(jù),8,耳 聾 的 致 病 因 素,9,中國人群遺傳性耳聾的特點,遺傳性耳聾突變位點具有明顯的種族差異 中國人群大部分遺傳性耳聾由4個基因的突變所引起：GJB2、 GJB3、 SLC26A4（PDS）、mtDNA 12s rRNA等 中國人群的耳聾突變熱點： GJB2：35 del G，176 del 1

4、6，235 del G，299 del AT SLC26A4（PDS）：IVS7-2 AG，2168 AG GJB3：538CT 線粒體：12S rRNA：1555 AG，1494 CT,10,基因型與臨床表型的對應關系,線粒體基因 C1494T、A1555G突變： 氨基糖甙類藥物敏感性耳聾 GJB2基因： 先天性重度以上感音神經(jīng)性耳聾 PDS基因： 大前庭導水管綜合征（EVAS）一種內(nèi)耳畸形，先天或后天重度以上感音神經(jīng)性耳聾 GJB3： 后天高頻感音神經(jīng)性耳聾,11,遺傳性耳聾的遺傳特點,父母均為健康攜帶者,12,耳聾基因檢測的價值,盡量避免兩個同一基因純合突變的聾人結(jié)婚,針對聾人群體,13

5、,耳聾基因檢測的價值,基因檢測可指導聾人的婚配，避免婚后再生聾兒,針對聾人群體,14,現(xiàn)有位點可覆蓋中國人群中 98%GJB2, 80%PDS, 90%藥物性耳聾患者,遺傳性耳聾檢測試劑盒包括的基因位點,晶芯遺傳性耳聾基因檢測試劑盒,標本采集 3管EDTA抗凝的紫頭管（最好空腹,16,遺傳性耳聾檢測芯片的檢測結(jié)果,235 雜合,1555均質(zhì),IVS 雜合,2168和IVS復合雜合,2168 純合,Wild Type,Control,可對四個基因9個位點的基因型進行準確檢測，報告野生、雜合突變或純合突變等三種結(jié)果,QC BC PC,PC NC QC,35W IC35 538W,35M ICG3

6、538M,176W 1494W PC,176M 1494M BC,235W 1555W 2168W,235M 1555M 2168M,299W ICmt IVSW,299M IC21 IVSM,ICG2 BC ICIVS,檢測意義,GJB2基因 先天性耳聾基因：當GJB2基因發(fā)生突變時，患者出生即表現(xiàn)出耳聾癥狀 檢測意義：為耳聾患者確診病因；指導生育有聾兒的家庭再次生育；篩查有耳聾家族史的家庭成員的基因突變情況；等,線粒體12s rRNA基因 藥毒性耳聾致病基因：當該基因發(fā)生突變時，患者聽力正常，但當使用氨基糖甙類藥物時，就會導致重度耳聾的發(fā)生 檢測意義：通過檢測此基因，可以明確被檢者該基因突

7、變情況，指導患者用藥 ；明確患者家庭中該疾病的遺傳性,19,GJB3基因 后天性耳聾基因：當GJB3基因發(fā)生突變時，患者青少年時期聽力正常，當發(fā)育至青壯年期間（2030歲）時，聽力逐漸下降，直至發(fā)生重度耳聾 檢測意義：通過檢測此基因，可以為聽力下降的患者明確病因；指導生育有聾病患者的家庭再次生育；篩查有耳聾家族史的家庭成員的基因突變情況,SLC26A4（PDS）基因 大前庭導水管綜合征致病基因：當PDS基因發(fā)生突變時，患者出生時耳蝸發(fā)生畸變，但不發(fā)生耳聾癥狀，當患者患感冒、頭部受打擊時，聽力逐漸下降，直至發(fā)生重度耳聾 檢測意義：通過檢測此基因，可以為聽力下降的患者明確病因；指導患者生活習慣，指

8、導生育有聾病患者的家庭再次生育；篩查有耳聾家族史的家庭成員的基因突變情況,實例介紹1,22,樣本由杭州惠耳聽力提供,實例介紹2,23,樣本由中國聾康中心提供,實例介紹3,24,父親：野生型； 聾兒,母親：野生型； 聾兒,孩子： 野生型； 聽力正常,樣本由大坪醫(yī)院提供,Luminex 200TM多功能流式點陣儀,液態(tài)芯片是基于Luminex200TM（美國Luminex公司）的是一個多功能生物芯片平臺，既能檢測蛋白、又能檢測核酸的高通量技術平臺 通常用于免疫分析、核酸分析、受體和配體分析等臨床檢測和科學研究 LuminexTM有機地整合了編碼微球、激光技術、應用流體學、最新的高速數(shù)字信號和計算機

9、運用法則，具有很高的檢測特異性和靈敏度,Luminex200TM,Luminex xMAP Technology - 1,http:/,Luminex xMAP Technology - 2,Luminex xMAP Technology - 2,42,6,33,18,52,58,16,HPV DNA分型檢測液芯操作配套設備,30-40min,2.5hr,15min,采樣刷、細胞保存液、冰箱,離心機（10000rpm）、TIP頭（大、中、?。P管、水浴鍋、金屬加熱器、移液器（1000l、200l）、手套、口罩,PCR儀（非熒光）、TIP頭（大、中、?。?、PCR管、PCR實驗室,流式熒光儀（

10、 Luminex200TM）、電腦,PCR儀（非熒光）、TIP頭（大、中、小）、PCR管,液芯HPV DNA分型產(chǎn)品三大優(yōu)勢,激光分析，數(shù)字結(jié)果 無需洗滌，減少污染 液相雜交，重復性好,液相雜交，效率高、重復性好,固態(tài)芯片產(chǎn)品：膜條式反向雜交，基質(zhì)不均一，溫控困難，重復性差,液芯產(chǎn)品：液相雜交，反應徹底，溫控嚴格，重復性好,Solid-Phase Kinetics,Solution-Phase Kinetics,已獲SFDA藥證的項目,HPV分型（高危、低危型，同時檢測26種壓型） 腫瘤標志物（13種） 自身免疫性疾病的診斷標記物,OUTLINE,測序技術 乙肝病毒耐藥突變檢測 預測某些疾病的

11、遺傳風險程度 腫瘤化療藥物敏感試驗,生物芯片技術 固相芯片 液相芯片,人類基因組計劃The Human Genome Project,1985: 提出對整個人類基因組DNA測序 1990: 國際合作項目，歷時13年 花費： $3 Billion,人類基因組計劃The Human Genome Project,人類基因組計劃The Human Genome Project,Now we run our products on gel,雙脫氧熒光測序方法,vs,電泳和數(shù)據(jù)的產(chǎn)生,全自動測序方法 Automated Sequencing,測序技術的飛躍,2003年，“HGP”獲得首張人類全基因組圖譜

12、，花費了30億美元和13年的時間 Craig Venter開發(fā)出一種快速追蹤測序方法，并于2007年9月完成Venter自身全基因組的測定工作，花費了大約1億美元,Bad boy of Science,測序技術的飛躍,2008.4.17Nature雜志上， 454測序新技術：美國454 Life Sciences公司，花了150萬美元，4個月 Illumina genome analyzer Applied Biosystems SOLiD sequencer,454 sequencing： Emulsion PCR (emPCR,Mix DNA Library & capture beads

13、 (limited dilution,Create “Water-in-oil” emulsion,PCR Reagents,Emulsion Oil,Perform emulsion PCR,Adapter carrying library DNA,A,B,Micro-reactors,Adapter complement,Load beads into PicoTiter Plate,Load Enzyme Beads,2021/1/9,50,測序技術的飛躍,Helicos公司開發(fā)的HeliScope Sequencer “單分子測序” 不需要PCR擴增 成本最低 目標：10萬美元，3個工

14、作日左右 一個重要的里程碑 在聯(lián)系個人化基因組和個人化治療方面 破解生命密碼并找到缺陷基因 對于各種遺傳疾病、癌癥、肥胖等具有難以估量的意義,測序技術在臨床上的應用,肝炎病毒變異、分型的檢測（HBV ） 預測某些疾病的遺傳風險程度（乳腺癌、結(jié)腸癌） 個體化用藥指導 （腫瘤化療用藥指導,肝炎病毒變異、分型的檢測（HBV,核苷類藥物,干擾素,耐藥突變點檢測,LAM,ADV,ETV,C基因區(qū)變異,與肝臟疾病的嚴重程度有關 與抗病毒治療的效應 與肝癌栓塞治療的效應,HBV基因分型,可在耐藥臨床表現(xiàn)發(fā)生前14個月檢測出突變株 適時調(diào)整用藥方案,了解病毒在體內(nèi)存在的狀態(tài) 判斷肝癌發(fā)生的風險率,存在著天然耐

15、藥株,HBV DNA 陽性,乳腺癌( breast cancer,發(fā)生于乳腺導管上皮細胞的惡性腫瘤 是女性常見的腫瘤之一,約占全身惡性腫瘤的7 % - 10% 全世界每年新發(fā)乳腺癌約150 萬例,死亡約57 萬例,Genetics,BRCA-1 BRCA-2 P53, Rb-1 Her-2/neu, c-erB2, c-myc,BRCA1、BRCA2基因突變與乳腺癌,通過對有乳腺癌家族史婦女的BRCA1和BRCA2基因突變的檢測顯示,此類人群中約有10%為BRCA1和BRCA2基因突變的攜帶者。BRCA1和BRCA2基因突變的攜帶者到70歲時,發(fā)生乳腺癌的風險累計達到80%-85% ,一生中發(fā)

16、生乳腺癌的風險可高達90% BRCA1和BRCA2基因突變的檢測是對于有乳腺癌家族史人群進行乳腺癌篩查和早期診斷的有效方法,What can YOU do,1.一側(cè)乳腺癌 2.乳腺腫塊 3.有家族史 4.腫瘤標記物,每個人是不同的 大多數(shù)病人的治療方案是相同的 醫(yī)藥費: 數(shù)以萬計的錢花在沒有療效的藥物治療 死亡/病重: 2.2 億嚴重的病例和超過100萬的死亡例數(shù),最大的挑戰(zhàn): 藥物個體反應的差異,相同藥物，相同藥效,相同臨床表現(xiàn) 相同實驗室檢查結(jié)果 相同疾病 (,相同藥物,不同的療效,不同的遺傳背景,可能的原因: 藥物-藥物的相互作用. 藥物代謝 藥物靶點的易感性 Or,SNP,SNP,SNP: 單核苷酸多態(tài)性 （Single Nucleotide Polymorphisms,每個個體 99.9% 相同的序列 0.1% 不同的序列,決定了對疾病的易感性和對藥物的敏感度,人群 A,人群 B,藥物對大部分病人有效,藥物對大部分 病人無效,使用該藥物,選擇另外的藥物,SNP 和藥物療效評價,藥物對大部分 病人毒性增加,降低用藥劑量,國際成熟的腫瘤靶向用藥的分子檢測,腫瘤分子分型檢測的四大方面,非小細胞性肺癌：易瑞沙、特羅凱 EGFR基因型