HXY第二章基因工程的載體和工具酶

1、第二章 基因工程的載體,載體,在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子叫載體（vector,基因工程對(duì)載體 的要求,1）在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制。 復(fù)制子：載體上有特殊的復(fù)制起點(diǎn)，使其能夠攜帶外源基因在宿主細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制繁殖 （2）有利于檢測(cè)篩選的標(biāo)記。 （3）有一段多克隆位點(diǎn)。 便于外源DNA插入載體而不影響載體的復(fù)制。 （4）分子量小，拷貝數(shù)多。 （5）容易從宿主細(xì)胞中分離純化,載體的種類,按照來(lái)源分為,按照功能分為,質(zhì)粒（plasmid） 單鏈DNA噬菌體M13 噬菌體的衍生物 柯斯質(zhì)粒（cosmid） 動(dòng)物病毒（virus,克隆載體: 克隆一個(gè)基因或DNA片斷 表達(dá)載

2、體: 用于一個(gè)基因編碼的蛋白表達(dá) 整合載體: 把一個(gè)基因插入到染色體組中,載體的分類,說(shuō)明： 1.穿梭載體（shuttle vector） 指能在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子，因而可以運(yùn)載目的基因穿梭往返兩種生物之間，如：YEP,DIDB219 2.YAC Yeast Artificial Chromsome 由酵母基因和pBR322質(zhì)粒衍生物構(gòu)成，對(duì)克隆大的真核基因十分有用，在HGP中發(fā)揮主要作用。 3.BAC 細(xì)菌人工染色體,第一節(jié) 質(zhì)粒載體,質(zhì)粒（plasmid）：指細(xì)菌等生物細(xì)胞內(nèi)一類獨(dú)立于染色體外而能自我復(fù)制的遺傳物質(zhì),1）分子小,一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性,1200 kb,2）編碼

3、基因少,23個(gè)中等大小的蛋白質(zhì),3）環(huán)形狀,雙鏈環(huán)狀DNA,酵母的“殺傷質(zhì)粒”是RNA,如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細(xì)菌一些額外的特性（非必須,4）質(zhì)粒的空間構(gòu)型,共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA,呈超螺旋（SC）（super coil,Covalent close circular DNA,線形DNA （ linear ，lDNA,一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口,開環(huán)DNA（ open circular， ocDNA,5）質(zhì)粒空間構(gòu)型與電泳速率,同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同,scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢,SC,OC,L,L,OC,SC,二、質(zhì)粒的類型,在大腸桿

4、菌中的質(zhì)粒，可以分為,接合型質(zhì)粒,非接合型質(zhì)粒,能自我轉(zhuǎn)移,不能自我轉(zhuǎn)移,除了帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因,如：F質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或F因子,甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中,又叫自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒,1. 接合型質(zhì)粒,不符合基因工程的安全要求,大腸桿菌接合（conjunction,2. 非接合型質(zhì)粒,雖然帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，因此不能從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞,1）R質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒,帶有一種或數(shù)種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（resistance,符合基因工

5、程的安全要求,帶有控制大腸桿菌素（colicin）合成的基因,2）Col質(zhì)粒,大腸桿菌素對(duì)不帶Col質(zhì)粒的大腸桿菌有毒,Col質(zhì)粒或R質(zhì)粒如果帶有轉(zhuǎn)移基因，也可以成為接合型質(zhì)粒,三、質(zhì)粒的復(fù)制類型,1. 嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringent plasmid,拷貝數(shù)少，只有13份拷貝,2. 松弛型質(zhì)粒（relaxed plasmid,拷貝數(shù)多，有20份以上的拷貝,接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型,非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型,天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建,目前實(shí)驗(yàn)室使用的大

6、腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu)建的,pSC101 9 kb 拷貝數(shù) 5 四環(huán)素抗性標(biāo)記基因 Tcr,ColE1 6.5 kb 拷貝數(shù) 20 - 30 大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因 E1,RSF2124 ColE1衍生質(zhì)粒 氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因 Apr,1. 天然質(zhì)粒的局限性,四、質(zhì)粒的構(gòu)建,ColE1,1） 具有復(fù)制起點(diǎn)（ori,2. 質(zhì)粒載體必須具備的基本條件,2）具有抗菌素抗性基因,3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn),是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性基因,用來(lái)插入外源DNA片斷。且插入后不影響復(fù)制功能,4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù),A typical plasmid ve

7、ctor. It contains a polylinker which can recognize several different restriction enzymes, an ampicillin-resistance gene (ampr) for selective amplification, and a replication origin (ORI) for proliferation in the host cell,常用抗菌素的抗性工作原理,i）氨芐青霉素（Ampicillin，Amp,青霉素的衍生物,通過(guò)干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的末端反應(yīng)，殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌,a）抑菌原理,b）

8、細(xì)菌抗性原理,Ampr基因編碼-內(nèi)酰胺酶，特異地切割氨芐青霉素的-內(nèi)酰胺環(huán),ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml,通過(guò)與50S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌,b）細(xì)菌抗性原理,Cmlr 編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，特異地使氯霉素乙酰化而失活,a）抑菌原理,a）殺菌原理,iii）卡那霉素（kanamycin，Kan,通過(guò)與70S核糖體結(jié)合，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯(cuò)讀。殺死細(xì)菌,b）細(xì)菌抗性原理,Kanr 編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對(duì)卡那霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用,iv）鏈霉素（Streptomycin，Str,a）殺菌原理,通過(guò)與30S核糖體亞基結(jié)合

9、，導(dǎo)致mRNA錯(cuò)譯。殺死細(xì)菌,b）細(xì)菌抗性原理,Strr 編碼一種氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)鏈霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體30S亞基結(jié)合作用,v）四環(huán)素（Tetracycline，Tet,b）細(xì)菌抗性原理,a）抑菌原理,通過(guò)與30S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌,Tetr 編碼特異性蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，組止四環(huán)素通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進(jìn)入受體菌后，受體菌才能生長(zhǎng),不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長(zhǎng),抗菌素篩選原理,活,死,抗性基因,抗菌素,遺傳標(biāo)記,使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因,

10、人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體的類型,1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體,ColE1、pMB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點(diǎn),而且在沒(méi)有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復(fù)制，達(dá)到每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)10003000個(gè),適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物,2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體,但有特殊用途,由pSC101派生來(lái)的載體特點(diǎn)是分子量小，拷貝數(shù)低,當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過(guò)多時(shí)會(huì)嚴(yán)重地影響寄主菌的正常代謝活動(dòng)，導(dǎo)致寄主菌死亡時(shí)，就需要低拷貝的載體,pLG338、pLG339、pHSG415等,不適合大量擴(kuò)增DNA用,3）失控的質(zhì)粒載體,這是一類溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒,溫度低（低于37

11、oC），拷貝數(shù)很少； 溫度增加（40 oC）時(shí)，拷貝數(shù)會(huì)很快增加到1000個(gè)以上,如pBEU1、pBEU2,runaway plasmid vectors,1979年B. E. Uhlin等構(gòu)建,4） 插入失活型質(zhì)粒載體,載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個(gè)選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部,如pDF41、pDF42、pBR329,抗菌素抗性,外源DNA,無(wú)抗菌素抗性,5）正選擇的質(zhì)粒載體,如pUR2、pTR262等,只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng),直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞,目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體,Direct selection vectors,6） 表達(dá)型質(zhì)粒載體,主要用來(lái)使外

12、源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物,如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄翻譯信號(hào)控制之下,注意啟動(dòng)子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確,復(fù)制起始點(diǎn)ORI、 選擇標(biāo)記、 多克隆位點(diǎn)MCS,2）大腸桿菌操縱子元件,阻遏基因 I 操縱基因O 啟動(dòng)基因P 核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD） 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū),1）普通載體元件,表達(dá)載體的結(jié)構(gòu),重要的質(zhì)粒載體,pBR322 pUC18/19,pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因,1. pBR322,1）元件來(lái)源,F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工構(gòu)建載體,復(fù)制起點(diǎn) ori,pMB1系列（來(lái)源于ColE1）的高拷貝型復(fù)制

13、起點(diǎn),Ampr基因,Tetr基因,pSC101的Tetr 基因,2）長(zhǎng)度,4363bp,3）選擇標(biāo)記,氨芐青霉素和四環(huán)素抗性,4）克隆位點(diǎn),其中9個(gè)會(huì)導(dǎo)致Tetr基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）； 3個(gè)會(huì)導(dǎo)致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I,24個(gè)克隆位點(diǎn),5）pBR322的優(yōu)點(diǎn),雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記,插入失活，分兩次先后選擇,沒(méi)有獲得載體的寄主細(xì)胞 在Amp或Tet中都死亡,獲得載體的寄主細(xì)胞 在Amp或Tet其中之一中死亡,外源基因BamH I,Amp中存活,但在Tet中死亡,外源基因Pst I,Tet中存活,但在Amp中死亡,氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可

14、達(dá)10003000copy,安全,失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過(guò)接合轉(zhuǎn)移,高拷貝數(shù),分子小，克隆能力大,載體越小越好。 10kb的DNA在純化過(guò)程中容易斷裂,保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mob）的作用位點(diǎn),6）pBR322的缺點(diǎn),能夠被ColK質(zhì)粒編碼的mob蛋白識(shí)別，如果再有F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移,刪除mob識(shí)別位點(diǎn),如質(zhì)粒pBR327、pAT153等,pAT153,從pBR322上切去HaeII片斷，既除去了mob識(shí)別位點(diǎn)，又增加質(zhì)粒的拷貝數(shù),7）PBR322的改進(jìn),pBR325,在pBR322位點(diǎn)上接入一段來(lái)自噬菌體PICm的HaeII酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因

15、cmlr）。 cmlr上也帶一個(gè)EcoRI位點(diǎn),使EcoRI 也成為插入失活型位點(diǎn),改造EcoR I 位點(diǎn),2. pUC系列,University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成,pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19,復(fù)制起點(diǎn),pBR322的 ori,但其上失去了克隆位點(diǎn),Ampr 基因,1）元件來(lái)源,lacZ的啟動(dòng)子,大腸桿菌,lacZ基因,大腸桿菌lacZ的-肽鏈序列， 是LacZ 的氨基端片斷,pBR322的Ampr基因,2）長(zhǎng)度,約2.7kb,3）克隆位點(diǎn),10個(gè)連

16、續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于lacZ基因的5端,pUC18/19,Ampicillin 抗性和 lacZ的肽互補(bǔ)（藍(lán)白斑）相結(jié)合,4）選擇標(biāo)記,藍(lán)白斑選擇原理,Xgal,5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside,半乳糖苷酶能把無(wú)色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個(gè)深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍(lán),Xgal,半乳糖,5-溴-4-氯靛藍(lán),半乳糖苷酶,-半乳糖苷酶Xgal顯色反應(yīng),lacZ的肽互補(bǔ),1）-肽（ lacZ,半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸,lacZ只有在4聚體的狀態(tài)下才有功能,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-

17、41aa,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,4聚體,2）受體菌：lacZ突變（lacZM15,受體菌基因組的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），只編碼C端序列，不能形成活性酶，因而不能分解Xgal,受體菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a,pUC質(zhì)粒載體上的lacZ 編碼肽與這個(gè)缺失突變的-半乳糖苷酶“互補(bǔ)”，使它能形成4聚體。又能分解Xgal。產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì),C端大部分,N端的11-41aa,pUC lacZ,受體菌lacZ,3）載體lacZ與互補(bǔ),4）互補(bǔ)的插入失活,pUC載體上

18、LacZ的5端有一段多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)，本身雖不干擾LacZ的合成，但插入外源基因就會(huì)阻止LacZ的合成。不能互補(bǔ),lacZ,5,3,肽移碼突變,lacZ,5,3,肽,不互補(bǔ),互補(bǔ),MCS,外源DNA,IPTG的誘導(dǎo)作用,IPTG ( Isopropyl -D-1-Thiogalactopyranoside )是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)lac操縱子的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的lacZ 的C端部分和載體的lacZ肽都表達(dá)。從而互補(bǔ),但載體MCS上插入外源DNA后，仍然不能產(chǎn)生肽,IPTG,通過(guò)看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入,MCS無(wú)插入時(shí)，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑。 MCS有插入時(shí)，不

19、互補(bǔ)，白菌斑,IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果,5）pUC系列載體的優(yōu)點(diǎn),更小的分子量,如pUC18為2682bp，pUC8為2750bp,選擇方便,X-gal顯色、抗菌素雙重直接選擇,克隆便利,具有多克隆位點(diǎn)（MCS），使有兩個(gè)不同粘性末端的外源DNA方便地插入,測(cè)序方便,pUC的MCS與M13噬菌體載體的MCS完全相同，便于把外源DNA轉(zhuǎn)移到M13載體上測(cè)序,M13mp18的多克隆位點(diǎn),六、其它質(zhì)粒載體,1. pGEM-3Z,由pUC派生而來(lái),與pUC的主要區(qū)別是在MCS的兩側(cè)分別加了一個(gè)噬菌體啟動(dòng)子T7和SP6,T7啟動(dòng)子,SP6啟動(dòng)子,MCS,lacZ,Ampr,ori,可被T7和SP6的RNA聚合

20、酶識(shí)別轉(zhuǎn)錄,如果加入純化的T7或SP6 RNA聚合酶，在試管里就可以轉(zhuǎn)錄mRNA,外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄,MCS與pUC18的完全一樣,2. pGEM-4Z,與pGEM-3Z相同，只是T7啟動(dòng)子和SP6啟動(dòng)子的位置互換,1）pGEM-3Z的特點(diǎn),3. 穿梭質(zhì)粒載體,1）穿梭質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu),人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體,shuttle plasmid vectors,Yeast復(fù)制起點(diǎn),E.coli復(fù)制起點(diǎn),E.coli選擇標(biāo)記,Yeast選擇標(biāo)記,MCS,大腸桿菌枯草桿菌穿梭載體 大腸桿菌釀酒酵母穿梭載體 大腸桿菌動(dòng)物細(xì)胞穿梭載

21、體,2）常用的穿梭質(zhì)粒載體,3）穿梭載體的優(yōu)點(diǎn),也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá),可以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之間來(lái)回轉(zhuǎn)移基因,克隆、構(gòu)建,表達(dá),E.coli,Animal cell,利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá),七、質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性,1. 質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個(gè)條件,1）每個(gè)世代、每個(gè)質(zhì)粒至少要復(fù)制一次,2）在細(xì)胞分裂時(shí)，復(fù)制過(guò)的質(zhì)粒必須分 配到兩個(gè)子細(xì)胞中,有主動(dòng)分配和隨機(jī)分配兩種假說(shuō),1）主動(dòng)分配,天然質(zhì)粒,2. 質(zhì)粒分配方式,具有一個(gè)控制質(zhì)?？截惙峙涞墓δ軈^(qū)（Par），能以主動(dòng)分配的方式確保質(zhì)粒能正確分配到兩個(gè)子細(xì)胞中,人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體缺失了pa

22、r區(qū)，只能以隨機(jī)分配方式分到子細(xì)胞中,人工質(zhì)粒,一般情況下也能保證質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳,2）隨機(jī)分配,但在一定條件下會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象,在寄主菌細(xì)胞分裂的過(guò)程中，有一個(gè)細(xì)胞沒(méi)有獲得質(zhì)?？截?，并最終繁殖成無(wú)質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體,3. 分離的不穩(wěn)定性,segregation instability,4. 結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性,structural instability,寄主基因組的IS序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒間的同源重組等都會(huì)使質(zhì)粒發(fā)生插入或缺失,IS,dimer,重組,1）新陳代謝負(fù)荷,5. 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素,使寄主細(xì)胞生長(zhǎng)減緩,質(zhì)粒載體使寄主的世代時(shí)間延長(zhǎng)約15,復(fù)制負(fù)荷,減緩的程度與質(zhì)粒的分子量成正

23、比,轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷,丟失質(zhì)粒的細(xì)胞反而會(huì)成為優(yōu)勢(shì)群體,每個(gè)菌體中所擁有的質(zhì)?？截悢?shù)不完全相同，稱差度,2）質(zhì)粒載體的拷貝數(shù),低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定,差度（variance,是產(chǎn)生無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞的重要原因,高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，擁有少量拷貝數(shù)的菌體多，發(fā)生丟失的可能性大,野生型E.coli中，質(zhì)粒在寄主的重組酶作用下會(huì)發(fā)生重組形成二聚體質(zhì)粒,3）寄主菌的重組體系,二聚體災(zāi)難（dimer catastrophe,含有大分子量插入片斷的質(zhì)粒載體普遍能形成質(zhì)粒寡聚體,二聚體質(zhì)粒的復(fù)制速度是單體的二倍！導(dǎo)致質(zhì)粒失控,第二節(jié) 噬菌體載體,噬菌體是一類細(xì)菌病毒（Bacteriophage,一、噬菌

24、體的一般特性,結(jié)構(gòu)： 蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著DNA（雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀等,T4 Bacteriophage,single linear DNA (about 182,000 bp,T2 Genomic DNA,噬菌體的一般生物特性 可脫離寄主細(xì)胞生存，但不能進(jìn)行復(fù)制。 除了對(duì)寄主的依賴性，還具備其它的功能： 1、保護(hù)自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的破壞； 2、將其核苷酸分子注入到被感染的細(xì)菌細(xì)胞； 3、將被感染的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成制造噬菌體的體系，從而長(zhǎng)生出大量的子代噬菌體顆粒； 4、使感染的細(xì)菌細(xì)胞釋放出子代的噬菌體顆粒,噬菌體的結(jié)構(gòu)和其核酸類型： 結(jié)構(gòu)：無(wú)尾部結(jié)構(gòu)的二十面體

25、型、 具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、 線狀體型 核酸類型：最常見的是雙鏈線性DNA、 雙鏈環(huán)形DNA、 單鏈環(huán)形DNA、 單鏈線形DNA、 單鏈RNA,分為兩種,1. 溶菌周期,二、噬菌體的生活周期,感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體,烈性噬菌體（virulent phage,2. 溶原周期,感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌的染色體DNA中。形成這一過(guò)程稱為溶源化（lysogenization,整合到細(xì)菌染色體的噬菌體DNA稱為原噬菌體，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制,溫和噬菌體（temperate phage,原噬菌體（prop

26、hage,溫和噬菌體：既能進(jìn)入溶菌生命周期又能進(jìn)入溶 源生命周期。 溶源性細(xì)菌：具有一種完整的噬菌體基因組的細(xì)菌 溶源化： 用溫和噬菌體感染細(xì)菌培養(yǎng)物使之形成溶 源性細(xì)菌的過(guò)程 整合： 噬菌體的DNA是被包容在寄主細(xì)胞染色體 DNA中 原噬菌體：在溶源細(xì)菌內(nèi)存在的整合的或非整合的 噬菌體 超感染免疫性：溶源性細(xì)菌不能夠被頭一次感染并 使之溶源化的同種噬菌體再感染,溶源周期的主要特征： 噬菌體特征： 1、噬菌體的DNA分子注入細(xì)菌細(xì)胞 2、經(jīng)過(guò)短暫的轉(zhuǎn)錄之后，需要合成一種整合酶，于是轉(zhuǎn)錄活性便被一種阻遏物所關(guān)閉 3、噬菌體的DNA分子插入到細(xì)菌染色體基因組DNA上，變成原噬菌體 4、細(xì)菌繼續(xù)生長(zhǎng)

27、、增殖，噬菌體的基因作為細(xì)菌染色體的一部分進(jìn)行復(fù)制,三、單鏈?zhǔn)删w載體,M13、f1、fd 噬菌體,單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體,M13 噬菌體,2）復(fù)制型（RF）是雙鏈環(huán)狀DNA,1. 單鏈DNA噬菌體的特點(diǎn),3）RF DNA和ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài) 大腸桿菌。并產(chǎn)生噬菌斑,5）可產(chǎn)生大量的含有外源DNA插入片 斷的單鏈分子，便于作探針或測(cè)序,1）+DNA。（ssDNA,4）不存在包裝限制,2. M13 噬菌體,RF dsDNA在寄主細(xì)胞內(nèi)以高拷貝形式存在,成熟的噬菌體里只包裝有 + DNA，也容易提取,M13噬菌體只感染雄性大腸桿菌。 但M13 DNA可以轉(zhuǎn)染雌性大腸桿菌,6407

28、 bp,2）DNA長(zhǎng)度,3）DNA提純,1）寄主,4）M13的生活周期,雖然不導(dǎo)致溶菌，但使菌斑混濁（細(xì)菌生長(zhǎng)變慢，約為正常的1/23/4,M13通過(guò)雄性細(xì)菌的F性須注入其+DNA,DNA合成DNA，形成RF dsDNA,DNA轉(zhuǎn)錄mRNA、合成+DNA、翻譯形成噬菌體蛋白,組裝成新的噬菌體M13，擠出寄主細(xì)胞,DNA,DNA,mRNA,M13外殼蛋白,組裝成子代M13,DNA,注入大腸桿菌,復(fù)制,轉(zhuǎn)錄,翻譯,DNA,指導(dǎo)合成,DNA,200個(gè) RF DNA,每個(gè)細(xì)胞可以放出約1000個(gè)M13顆粒,3. M13載體的構(gòu)建,M13基因組中只有基因II與基因IV之間存在一段507bp的基因間隔區(qū),

29、1）克隆區(qū)域的選定,基因間隔區(qū)（inter genic region, IG區(qū),IG區(qū)內(nèi)只有一個(gè) BsuI 切點(diǎn),其余9個(gè)BsuI限制性位點(diǎn)分布在其它部位,酶切位點(diǎn),M13,J. Messing證明，IG區(qū)存在M13的復(fù)制起點(diǎn)，但可以插入外源DNA而不影響M13噬菌體的活力,在IG區(qū)內(nèi)插入一個(gè)大腸桿菌的LacZ（-肽序列)。 利用-肽序列中的三個(gè)單一酶切位點(diǎn)（Bgl II、Ava II 和 Pvu I,2）加入酶切位點(diǎn),在IG區(qū)內(nèi)加入單一內(nèi)切酶位點(diǎn),第一個(gè)M13載體：M13mp1,M13 RF,BsuI不完全消化,各種長(zhǎng)度的線性片斷,其中應(yīng)有只在IG上切開的線性全長(zhǎng)M13,E.coli lac

30、基因的HindII片斷(lacI、lacP、lacO、lacZ,連接,M13mp1,JM101宿主,只有在IG區(qū)插入lacZ才能存活并在Xgal上出現(xiàn)互補(bǔ)的藍(lán)噬菌斑,3）M13載體系列,加上常用的酶切位點(diǎn),M13載體系列的命名,M13mpn n代表系列數(shù)字,對(duì)M13mp1的改進(jìn),B. Gronenborn和J. Messing1978年把LacZ 5端的第13個(gè)核苷酸G突變成A，產(chǎn)生了一個(gè)EcoR I切點(diǎn),M13mp2,5ATGACCATGATTACGGATTCA,Me,用N-甲基-N-亞硝基脲 把G甲基化,5ATGACCATGATTACGGATTCA,轉(zhuǎn)染E.coli。mG與T配對(duì)，復(fù)制兩次

31、后,5ATGACCATGATTACGAATTCA,EcoRI切點(diǎn),用EcoRI切,M13mp1,M13mp2,選擇能切開的 線性分子,再環(huán)化,M13mp1,對(duì)M13mp2的進(jìn)一步改進(jìn),在M13mp2的LacZ的5端加上一段人工合成的多克隆位點(diǎn)（MCS,M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19,對(duì)應(yīng)有相同MCS的pUC系列載體,pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19,成為M13mp系列載體,與pUC18相同,M13mp18的多克隆位點(diǎn),4. M13系列載體的優(yōu)點(diǎn),1）有MCS，便于克隆不同的酶切

32、片段,2） Xgal顯色反應(yīng)，可供直接選擇,3）無(wú)包裝限制，克隆能力大,4）可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈,子代M13噬菌體中包含的是單連+DNA,MCS,編碼鏈,非編碼鏈,外源DNA,不同的酶切,不同的酶切,插入,M13 vector,M13 RF,外源DNA,轉(zhuǎn)染E. coli,成熟的子代M13中,Phage M13 replication in the host cell,Nicked by gene 2 protein,ss-Rolling circle replication, then cut and ligate,Coated with gene 5 protein,Gene

33、 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phage released from the cell,插入外源DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降,實(shí)際克隆能力小于1500bp,雖無(wú)包裝限制，并非無(wú)限包裝,5. M13載體的缺點(diǎn),6. 噬菌粒載體（phagemid vectors,由質(zhì)粒載體與單鏈?zhǔn)删w載體的復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合而成的新型載體系列,MCS,噬菌體ori,質(zhì)粒ori,Ampr,lacZ,lacI,約3000bp（比M13小,克隆能力大,能插入10kb的外源DNA,兩種復(fù)制形式,分子量小,1）噬菌粒載體的特點(diǎn),既具有質(zhì)粒的復(fù)制起

34、點(diǎn)，又具有噬菌體的復(fù)制起點(diǎn),既能在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式雙鏈復(fù)制，又能在噬菌體內(nèi)進(jìn)行單鏈復(fù)制,2）常見的噬菌粒載體,輔助噬菌體用來(lái)復(fù)制和包裝噬菌粒載體,3）pUC118/pUC119,構(gòu)成,1）M13的基因間隔區(qū)（IG,2）pUC18/pUC19質(zhì)粒載體,帶有M13復(fù)制起點(diǎn),質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn) Ampr lacZ MCS,MCS,pUC18/pUC19 ori,Ampr,lacZ,lacI,M13 ori,3.2kb,pUC118/119,pUC118/119的復(fù)制模式,兩種不同的復(fù)制模式,1）雙鏈質(zhì)粒復(fù)制模式,受pUC本身的復(fù)制起點(diǎn)（來(lái)源于ColE1）的控制,每個(gè)細(xì)胞能達(dá)到500個(gè)拷貝,來(lái)源于M1

35、3的復(fù)制起點(diǎn)被輔助噬菌體的基因II產(chǎn)物控制,2）單鏈滾環(huán)噬菌體復(fù)制模式,外殼蛋白,復(fù)制蛋白,輔助M13,包裝,當(dāng)寄主細(xì)胞被輔助噬菌體M13感染后,噬菌粒載體的包裝,1）輔助噬菌體,自身的復(fù)制起點(diǎn)發(fā)生了突變，復(fù)制效率低下，但感染細(xì)菌后能表達(dá)出外殼蛋白和復(fù)制蛋白，幫助噬菌粒載體復(fù)制,如M13K07等,2）包裝,輔助噬菌體,外殼蛋白和 復(fù)制蛋白,噬菌粒載體,ssDNA,噬菌體,4）pBluescript 噬菌粒載體（pBS,Stratagene公司發(fā)展的一類噬菌粒載體,由pUC質(zhì)粒載體、f1噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)和T3、T7噬菌體的啟動(dòng)子組成,特點(diǎn),組成,MCS兩側(cè)分別加上T3和T7噬菌體的啟動(dòng)子。加入適

36、當(dāng)?shù)氖删wRNA聚合酶，就可以定向體外轉(zhuǎn)錄,1）定向體外轉(zhuǎn)錄,2）兩種復(fù)制模式,既能以質(zhì)粒的形式復(fù)制，又能以噬菌體的形式復(fù)制包裝,3）選擇方便,有Ampr和lacZ，可以進(jìn)行Amp抗性選擇和Xgal-IPTG藍(lán)白斑選擇,4）插入方便,18個(gè)單一酶切位點(diǎn)的MCS,SK：表示lacZ的轉(zhuǎn)錄方向是沿MCS上的 SacI KpnI,（f1+）：?jiǎn)捂湉?fù)制起始方向背離 lacZ，能回收l(shuí)acZ 的編碼鏈（,pBluescript SK（+/-）/pBluescript KS（+/,KS：反向（ KpnI SacI ，MCS相反,（f1-）：能回收l(shuí)acZ的非編碼鏈（,1）pBluescript SK/KS

37、（+/-）區(qū)分,常用的 pBluescript 載體,pBS SK,pBS KS,5）PCR產(chǎn)物克隆載體 T 載體,pCR系列載體,Invitrogen公司開發(fā)的線性噬菌粒載體,結(jié)構(gòu),pUC的質(zhì)粒部分、fi噬菌體ori、Kanr和Ampr抗性,MCS的中部已經(jīng)切開，各有一個(gè)3端突出的T,特點(diǎn),PCR產(chǎn)物往往在3端突出一個(gè)A，所以能與這個(gè)載體直接連接,pCR2.1,pCR2.1的MCS,克隆的PCR產(chǎn)物能被兩側(cè)的EcoRI切下來(lái)回收,pCR2.1-topo,pCR1000,Promega 公司的T載體系列,pGEM-T vector,pTarget vector,G418抗性,可在真核生物表達(dá),

38、外顯子捕捉,T vector的克隆過(guò)程簡(jiǎn)便,A,A,T,T,T vector,PCR product,T4 DNA ligase,A,A,7. 噬菌體展示載體（ Phage display vector,1）噬菌體展示（Phage display,將外源蛋白（多肽、酶、抗體、DNA結(jié)合蛋白）結(jié)合到噬菌體的外殼蛋白上形成融合蛋白，表達(dá)于噬菌體的外表面,G. P. Smith1985年發(fā)明,絲狀噬菌體（M13、f1等）外殼顆粒的一端，有3-5個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)（g3p），在識(shí)別和吸附大腸桿菌的過(guò)程中起作用,M13,2）噬菌體展示載體的構(gòu)建,把外源DNA片斷插入基因的序列前端，并保持兩者的閱讀框正確

39、，表達(dá)出融合蛋白,啟動(dòng)子,外源DNA,M13基因,ori,M13 display vector,外源多肽,四、雙鏈?zhǔn)删w載體載體,1）長(zhǎng)度為48502 bp； （2）雙鏈線性DNA； （3）但在兩端有cos位點(diǎn)，可以環(huán)化,DNA兩端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點(diǎn),1. DNA分子的特點(diǎn),cos位點(diǎn)（cohensive-end site,phage,48.5 kb in length Linear or circular genome (cos ends,溶菌階段 (復(fù)制和釋放,溶源階段 (整合到寄主染色體上,DNA進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)后，可形成雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制型（RF

40、DNA,噬菌體和其DNA,DNA上有至少61個(gè)基因，有一半是必須的，與自身的活動(dòng)有關(guān)，成簇排列。 其他約1/3是非必須基因（位于尾部合成至阻遏之間的區(qū)段,2. 噬菌體的基因組特點(diǎn),A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2,cI cro cII O P Q S R,att int xis gam red cIII N,COS,COS,頭部基因 尾部基因 功能不明區(qū),溶源化 重組 早期控制 阻遏 DNA合成 溶菌,生長(zhǎng)非必須區(qū)段,cI基因：溶源過(guò)程控制基因,噬菌體的基因組結(jié)構(gòu),DNA,Protein coat,cos,cos,Nonessential region,

41、Long (left) arm,short (right) arm,Exogenous DNA (20-23 kb,phage,12bp,genome(48502bp,噬菌體感染細(xì)菌的早期：雙鏈進(jìn)行型復(fù)制,3. DNA的復(fù)制 模型,1） 型復(fù)制,2）滾環(huán)復(fù)制,感染的晚期：?jiǎn)?dòng)滾環(huán)復(fù)制機(jī)制,形成多聯(lián)體DAN分子,這種多聯(lián)體分子必須在cos位點(diǎn)被切斷成單體分子才能被包裝起來(lái),1）構(gòu)建原理,4. 噬菌體載體的構(gòu)建,2）構(gòu)建過(guò)程,在這個(gè)非必須區(qū)內(nèi)制造限制酶切點(diǎn) 引進(jìn)某些突變表型，作為選擇標(biāo)記 突變某些基因，使它成為安全載體 刪除DNA必須區(qū)段上常用的限制酶切點(diǎn),噬菌體DNA上本身有5個(gè) EcoR I

42、和7 個(gè)Hind III切點(diǎn),刪除噬菌體的非必需區(qū)，留出插入空間,3）人工構(gòu)建的噬菌體載體有兩種類型,插入型載體（insertion vectors,如 gt10、gt11、BV2、NM540、NM1590、NM607,1）免疫功能失活型,插入位點(diǎn)位于載體合成活性阻遏物區(qū)域（cI基因）內(nèi),EcoR I,gt10,插入導(dǎo)致載體不能合成阻遏物，載體DNA不能進(jìn)入溶源期，受體菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。 沒(méi)有外源DNA插入的載體感染受體菌形成混濁噬菌斑,選擇標(biāo)記,如NM1149載體的兩個(gè)克隆位點(diǎn)（EcoR I 和Hind III）都是位于cI基因內(nèi)部,2）-半乳糖苷酶失活型載體,在基因組中引入了L

43、acZ序列。（其上含有一個(gè)EcoR I 克隆位點(diǎn),感染LacZ突變的大腸桿菌，經(jīng)IPTG的誘導(dǎo)，利用Xgal的顯色反應(yīng)作選擇標(biāo)記,EcoR I,Charon16A,選擇標(biāo)記,替換型載體（substitution vectors,兩個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)以反向重復(fù)形式分別位于DNA的非必須區(qū)兩端,用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下來(lái)，與用同樣酶切成的外源DNA片斷置換,可置換區(qū),MCS,MCS,如： EMBL4、Charon40等,1） EMBL4,EMBL4的可置換片斷內(nèi)部還有Sal I酶切位點(diǎn),以便于進(jìn)一步消化中間片斷，防止自我連接,左臂,可置換區(qū),右臂,EcoR I BamH I Sal I,Sal

44、I BamH I EcoR I,Sal I Sal I,EMBL4,2）Charon40,Charon40的可置換片斷是由DNA短片重復(fù)構(gòu)成，片斷之間有Hae I 切點(diǎn),在克隆的時(shí)候，可以用Hae I 酶進(jìn)一步將可置換片斷切成小片斷，以防止重新與載體連接,左臂,可置換區(qū),右臂,MCS,MCS,Charon40,Hae I,可取代片斷中如果包含LacZ，可用Xgal顯色作篩選標(biāo)記,4）載體的篩選標(biāo)記,插入型載體,根據(jù)插入所引起的表型突變,置換型載體,Viruses that can infect bacteria. 48.5 kb in length Linear or circular gen

45、ome (cos ends,phage,Lytic phase (Replicate and release,Lysogenic phase (integrate into host genome,載體克隆策略,置換型載體,DNA象質(zhì)粒載體那樣直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌時(shí)效率遠(yuǎn)比質(zhì)粒低,5. 載體的體外包裝,在試管中與噬菌體的頭部和尾部蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染細(xì)菌，把重組DNA注入受體菌中,必須利用噬菌體外殼的作用,1）體外包裝,的D基因的產(chǎn)物也是頭部蛋白，但主要與 DNA 進(jìn)入頭部和頭部的成熟有關(guān)（只占20,2）體外包裝過(guò)程,噬菌體外殼蛋白的合成,E 基因,的E 基因編碼頭部蛋白的主要成分

46、（占頭部總蛋白的70,D基因,外源的重組DNA載體被誘發(fā)與內(nèi)源性原DNA發(fā)生重組,3）體外包裝存在的問(wèn)題,包裝錯(cuò)誤,既能包裝用于生產(chǎn)頭部蛋白的內(nèi)源性原DNA，也能包裝重組的DNA載體,重組,體外包裝的容量限制,必須在正常野生型容量的75%105% （3651kb）之間,既不能超過(guò)正常野生型容量的105%； 又不能低于正常野生型容量的75,野生型DNA的必須區(qū)是28kb，所以載體的最大克隆容量是23kb。（實(shí)際上為15kb,比一般的質(zhì)粒載體的容量大的多,4）DNA載體的優(yōu)點(diǎn),用在真核生物基因組文庫(kù)的建立,Sau3A,BamHI,噬菌體感染細(xì)菌形成的噬菌斑,1978年J. Collins和B. H

47、ohn等人發(fā)展出cosmid vector（cos site-carrying plasmid,DNA,46kb,1）大小,2）組成,6. cosmid載體（粘粒,cos序列和控制包裝的的序列,pBR322,質(zhì)粒的復(fù)制子 抗藥性基因 幾個(gè)限制性酶的單一位點(diǎn),Cloning by using cosmid vectors. (a) In addition to ampr, ORI, and polylinker as in the plasmid vector, the cosmid vector also contains a COS site. (b) After cosmid vector

48、s are cleaved with restriction enzyme, they are ligated with DNA fragments. The subsequent assembly and transformation steps are the same as cloning with l phages,具有噬菌體的特性,3）cosmid vector的特點(diǎn),克隆外源DNA后可以體外包裝成噬菌體顆粒,在寄主細(xì)胞內(nèi)形成環(huán)化DNA（但不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌,具有質(zhì)粒載體的特性,大多帶有pMB1或ColE1的復(fù)制子，能象質(zhì)粒一樣復(fù)制,有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位點(diǎn),

49、方便的選擇,高容量的克隆能力,45kb （最少不能低于30kb,51kb-5kb=45kb,4）部分cosmid vector,應(yīng)用cosmid載體在大腸桿菌中克隆大片端的真核基因組DNA技術(shù)，叫“柯斯克隆”（cosmid cloning,5）cosmid cloning,理論依據(jù),cos位點(diǎn),噬菌體的生命周期中，會(huì)產(chǎn)生數(shù)百個(gè)DNA通過(guò)cos位點(diǎn)連接的“多聯(lián)體”分子,多聯(lián)體”復(fù)制,包裝識(shí)別,在包裝的時(shí)候， 噬菌體具有位點(diǎn)特異的末端酶（terminase）體系（Ter體系），識(shí)別cos位點(diǎn)，把多聯(lián)體切成單個(gè)DNA長(zhǎng)度,兩個(gè)cos位點(diǎn)之間，必須保持3845kb的DNA，Ter體系才能識(shí)別,Ter體

50、系,包裝限制,用特定的核酸內(nèi)切酶消化真核生物DNA,6）cosmid克隆的一般過(guò)程,用同樣的內(nèi)切酶消化cosmid載體,產(chǎn)物中將有一定比例的分子是兩端各有一個(gè)cos位點(diǎn)、長(zhǎng)度40kb左右的真核DNA與載體的連接物,連接,切割合適長(zhǎng)度的雜種DNA連接物，并包裝入噬菌體頭部,注入到細(xì)菌體內(nèi)的雜種DNA分子環(huán)化，并按質(zhì)粒的方式復(fù)制,感染大腸桿菌,Ter體系識(shí)別并切割,C) Packaging and infect,Formation of a cosmid clone,大質(zhì)粒,載體片斷自我連接,外源DNA片斷自我連接,多個(gè)本來(lái)不在一起的外源DNA片斷連接起來(lái)同時(shí)插入載體,7）cosmid載體克隆的缺

51、點(diǎn),用堿性磷酸酶除去線性質(zhì)粒片斷5端的磷酸，可防止載體自體連接,克服載體自體連接的改良方案,第三節(jié) 大分子DNA克隆載體,A.W.Murray 1983年形成基礎(chǔ)理論, D.T.Burke等1987年變?yōu)楝F(xiàn)實(shí),一、酵母人工染色體,1. YAC的特點(diǎn),1）只能在酵母細(xì)胞中擴(kuò)增,yeast artificial chromosome, YAC,2）克隆容量大，為230kb-1700kb,3）構(gòu)建原理：按染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)建,1）DNA復(fù)制起始點(diǎn)（ori,2. 染色體復(fù)制和遺傳的三個(gè)基本組件,TEL,TEL,CEN,ORI,2）著絲粒（centromere，cen,3）兩個(gè)端粒（telomeres，tel

52、,Leu,ARS,CEN,Leu- Yeast,后代死,Leu- Yeast,80%后代死,Leu- Yeast,后代活,Leu- Yeast,后代死,Leu- Yeast,后代活,Tel,Tel,1）著絲粒區(qū)（CEN,A A GTCACGTG,T TGTTTCTGNTTTCCGAAA,3. YAC的組成結(jié)構(gòu),酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列,78-86bp,I,II,III,由三個(gè)區(qū)組成,酵母第3、4、6、11號(hào)染色體的著絲粒區(qū)序列,酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重復(fù)序列,3）復(fù)制起點(diǎn)（ORI,約100bp的自主復(fù)制序列（ARS,2）端粒（TEL,人是TTAGGG重復(fù)序列; 四膜蟲是 GGG

53、TTG重復(fù)序列,真核生物中只有酵母菌有ARS,位于 SUP4 基因內(nèi)部,4）克隆位點(diǎn),插入失活選擇,SUP4酶失活的酵母菌落呈紅色； 不失活的菌落是白色,TRP1、URA3（分別位于兩臂,細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn) ori和抗生素標(biāo)記Ampr,5）在酵母中的標(biāo)記基因,6）在細(xì)菌中操作,4. YAC克隆外源DNA,URA3,TRP1,CEN4,Cloning by the yeast artificial chromosome (YAC) vector,Essential components of YAC vectors 1 Centromers (CEN), telomeres (TEL) and au

54、tonomous replicating sequence (ARS) for proliferation in the host cell. 2 ampr for selective amplification and markers such as TRP1 and URA3 for identifying cells containing the YAC vector. 3 Recognition sites of restriction enzymes (e.g., EcoRI and BamHI,1）宿主酵母菌,只有同時(shí)得到Y(jié)AC的兩個(gè)臂，才能在基本培養(yǎng)基（不加TRP和URA）上生長(zhǎng)

55、,2）選擇方式,5. YAC轉(zhuǎn)化過(guò)程,trp- 和 ura,cen,ura3,trp1,1）存在插入子的穩(wěn)定性問(wèn)題,6. YAC的缺點(diǎn),2）同一酵母細(xì)胞內(nèi)多個(gè)YAC引起交換,3）轉(zhuǎn)化效率低,4）難以制備純的YAC-DNA,H. Shizuya等1992年在大腸桿菌F因子的基礎(chǔ)上構(gòu)建的,2）克隆容量可達(dá)300kb,二、細(xì)菌人工染色體（BAC,1. F質(zhì)粒的特點(diǎn),每細(xì)胞只有一個(gè)拷貝，不會(huì)重組,4）便于提純,像提取質(zhì)粒一樣直接提純,1）單拷貝復(fù)制,3）比較穩(wěn)定,1）OriS和repE控制質(zhì)粒的單向復(fù)制。 （2）parA和parB維持低水平質(zhì)粒拷貝數(shù)。 （3）CosN是噬菌體末端酶專一性切割位點(diǎn)。 （4）loxP是P1 Cre蛋白作用位點(diǎn)。 （5）HindIII和BamHI是插入位點(diǎn)。 （6）兩側(cè)的NotI可用于切下外源DNA。 （7）氯霉素抗性基因CMR,2. BAC的組成結(jié)構(gòu),第四節(jié) 病毒載體,一、反轉(zhuǎn)錄