Taqman探針熒光聚合酶鏈式反應(yīng)實時同步鑒定動物源性食品中豬肉、雞肉源性成分

1、Taqman探針熒光聚合酶鏈式反應(yīng)實時同步鑒定動物源性食品中豬肉、雞肉源性成分 摘 要：目的：建立一種能實時同步檢測動物源性食品中豬肉源性和雞肉源性成分的Taqman探針雙重熒光聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法，應(yīng)用于動物源性食品的成分摻假快速檢驗。方法：分別依據(jù)豬和雞的種間保守基因（Cytb）序列設(shè)計、合成特異性引物及不同熒光標記（FAM、HEX）的Taqman探針，建立可同步檢測動物源性食品中的豬源性和雞源性成分的Taqman探針雙重熒光PCR方法。結(jié)果：所建立的Taqman探針雙重熒光PCR檢測方法特異性強，僅對豬、雞成分有擴增；靈敏度高，

2、最低檢測到豬源、雞源DNA的含量分別為0.02、0.10 ng；抗干擾性強，當DNA混樣中豬源、雞源性成分含量在2%以上水平時，所建立的混合檢測體系均能對DNA混樣給出正確判斷。結(jié)論：所建立的混合檢測體系具有高特異性、高靈敏度，能夠適用于動物源性食品中豬肉、雞肉成分的同時快速檢測。 關(guān)鍵詞：雙重熒光聚合酶鏈式反應(yīng)；動物源性食品；豬源性成分；雞源性成分 A Dual Fluorescent Real-Time Polymerase Chain Reaction Method for Concurrently Detecting Pork-Derived and Chicken-Derived I

3、ngredients in Animal-Origin Foods JIN Ping， JIE Li， LU Jun， CHEN Ying， DING Hongliu* （Suzhou Quality Supervision and Inspection Center， Suzhou 215128， China） Abstract： Objective： To establish a dual fluorescent real-time polymerase chain reaction （PCR） assay for the simultaneous detection of pork-de

4、rived and chicken-derived ingredients which enables rapid detection of adulteration in animal-origin foods. Methods： With this aim， specific primers and TaqMan probes were designed according to the interspecific conservative sequences. Results： The dual fluorescence PCR method had good specificity a

5、nd could only amplify pork-derived ingredients and chicken-derived ingredients. The method had high sensitivity and could detect as low as 0.02 ng of porcine DNA and 0.10 ng of chicken DNA. It had strong anti-interference ability and could correctly detect more than 2% pork-derived and chicken-deriv

6、ed ingredients spiked in mixed DNA samples with other species. Conclusion： The dual fluorescent real-time PCR provides a specific and sensitive method for the detection of pork and chicken-derived ingredients in animal-origin foods. Key words： dual fluorescent real-time polymerase chain reaction （RT

7、-PCR）； animal-origin product； pork-derived ingredients； chicken-derived ingredients DOI：10.15922/ki.rlyj.2016.09.004 中圖分類號：TS207.3 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2016）09-0017-06 引文格式： 金萍， 結(jié)莉， 陸俊， 等. Taqman探針熒光聚合酶鏈式反應(yīng)實時同步鑒定動物源性食品中豬肉、雞肉源性成分J. 肉類研究， 2016， 30（9）： 17-22. DOI：10.15922/ki.rlyj.2016.09.004.

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9、/ki.rlyj.2016.09.004. http：/ 牛肉享有“肉中驕子”之美稱，是中國人的第二大肉類食品。牛肉不僅味道鮮美、消化吸收率高，同時具有高蛋白、低脂肪、富含多種氨基酸以及礦物質(zhì)等特點，受大眾喜愛。牛肉的相對高價促使一些不法分子制作假牛肉，如2013年內(nèi)蒙古包頭公安破獲的一起制售假劣食品案，涉案公司經(jīng)過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，采用鴨等原材料生產(chǎn)假冒的牛肉干、羊肉干，在15 個省市自治區(qū)進行銷售，涉案價值600多萬1。2011年人民網(wǎng)報導(dǎo)江蘇無錫的犯罪分子利用硼砂和豬血等物品將豬肉偽裝成牛肉出售；2013年西安通報了一起“9.10”特大制販假牛肉案，共

10、查處17 t假牛肉，這些假牛肉其實均為豬肉2。食品摻假是指向食物中非法混進外觀、物理性狀或物種形態(tài)相似的物質(zhì)，混入后的物質(zhì)在外觀上很難鑒別6。隨著目前食品檢測技術(shù)不斷完善和更新，食品摻假的手段也越來越隱蔽，主要手段可總結(jié)為“注”、“混”、“改”、“充”、“提”3。肉類摻假主要采用“混”，即以一些低價肉（如豬肉、雞肉）代替/部分替代高價肉（如牛肉、羊肉），再在高價肉中加入各種調(diào)料、香精基料等化學品進行遮掩。由于替代成分與被替代成分均同屬肉類，兩者在感官、理化特性等方面極其相似，另外肉類制品大都經(jīng)過高壓、煮沸、腌制等加工程序，使得食品本身復(fù)雜多變。因此這類型的食品摻假鑒定變得非常困難，也成為食品質(zhì)

11、量安全保障方面的技術(shù)瓶頸之一4。 熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法具備特異性高、樣本需求低（少量受檢樣品即可檢測）、耗時短、操作過程簡單，同時具有無污染（閉管操作）、無毒性、高通量、多重擴增、可定量分析的優(yōu)點。因此，對于實時摻假食品的監(jiān)督和管理，應(yīng)用以DNA為靶分子的實時熒光PCR技術(shù)是未來發(fā)展方向之一15。通過前期對江蘇蘇州地區(qū)32 家生產(chǎn)單位共計90 份樣品的摻假鑒定5，發(fā)現(xiàn)目前不法分子主要是用豬肉以及雞肉制作假牛肉、假羊肉，因此本研究目的在于建立一種能同時檢測動物源性食品中豬源性和雞源性成分的雙重熒光PCR方法，其中涉及2 個擴增體

12、系：豬源特異性擴增體系、雞源特異性擴增體系。2 個體系的探針用不同的熒光基團標記，在同一反應(yīng)管內(nèi)同時進行鑒定，節(jié)省檢測中試劑的損耗以及時間。 1 材料與方法 1.1 材料與試劑 Taqman反應(yīng)預(yù)混液（ABI Taqman Universal PCR master mix） 英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；天根血液/組織DNA提取試劑盒、焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）處理水 蘇州阿爾法科技有限公司；引物、Taqman熒光探針 生工（上海）生物工程股份有限公司合成；無水乙醇 美國Thermo-Fisher公司。 1.2 儀器與設(shè)備 臺式高速冷凍離心機 美國The

13、rmo-Fisher公司；核酸蛋白測定儀（酶標儀） 美國Bio-Tek公司；7500型實時熒光PCR儀 美國ABI公司；旋渦振蕩器 德國IKA公司；槽恒溫水浴鍋 韓國Daihan Scientific公司。 1.3 方法 1.3.1 基因組DNA模板制備 使用一次性組織研磨棒、剪刀、鑷子等器具對樣品進行均質(zhì)處理，保證樣品的均勻性；不同的樣品分開處理，器具使用前后均用酒精棉球擦凈，避免不同樣品間的交叉污染。按照血液/組織DNA提取試劑盒說明書的步驟提取樣品DNA。采用微量核酸蛋白測定儀測定模板DNA的濃度以及純度，OD260 nm/OD280 nm比值均在1.72.0之間的動物組織DNA純度達到

14、要求，對模板DNA進行分裝，冷凍備用。 1.3.2 引物、探針的設(shè)計、合成及有效性驗證 在Genbank數(shù)據(jù)庫（http：//）中搜索，得到豬、雞線粒體細胞色素b基因（Cytb）序列，利用引物探針設(shè)計軟件（Primer Express 3.0），依據(jù)熒光PCR擴增中引物探針設(shè)計的相應(yīng)原則，獲得豬、雞成分特異性的引物和探針。同時將設(shè)計得到的引物、探針在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，確定其理論特異性。 引物、探針序列： 豬上游引物：5-GAAAAATCATCGTTGTACTTCAACTACA-3； 豬下游引物：5-GGTCAATGAATGCGTTGTT

15、GAT-3； 豬探針：5-FAM-CAAACATCCGAAAATCACAC CCACTAAT-TAMRA-3。 雞上游引物：5-CATCTCATCCGACTCTGACAAAATT-3； 雞下游引物：5-GGGAGAATAGGGCTAGTGTTAGGAA-3； 雞探針：5-HEX-TCAAAGACATTCTGGGCTTAACTCTC ATACTCACC-TAMRA-3。 1.3.3 雙重實時熒光PCR檢測 擴增反應(yīng)體系的體積為50 L：Taqman PCR master mix 25 L；10 mol/L的上游引物1 L；10 mol/L的下游引物1 L；10 mol/L的熒光標記探針1 L；模

16、板DNA（0.00150ng/L）2 L；其余不足用DEPC處理滅菌雙蒸水補齊。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：50 ，2 min；95 ，10 min；95 ，15 s；60 ，1 min；40 個循環(huán)，于實時熒光PCR儀上進行。 1.3.4 特異性實驗 按照血液/組織DNA提取試劑盒的說明書步驟分別提取純牛、羊、豬、雞、鴨、魚的DNA，按照1.3.3節(jié)所描述的體系進行實時熒光PCR擴增反應(yīng)，實時PCR擴增結(jié)束，通過觀察各體系對不同模板DNA的擴增曲線及臨界循環(huán)值（Ct值）來判定所設(shè)計的雙重熒光體系的特異性。 1.3.5 靈敏度實驗 按照1.3.1節(jié)的方法提取純豬、雞DNA，用DEPC處理滅菌雙蒸水進行稀釋，

17、以0.00150 ng/L的豬、雞核酸質(zhì)量濃度，按照1.3.3節(jié)中所描述的體系分別進行實時熒光PCR反應(yīng)，根據(jù)兩體系的Ct值及擴增曲線確定所建立的豬-雞雙重熒光PCR體系中豬源、雞源的檢測靈敏度。 1.3.6 混合樣品檢測能力驗證 為進一步檢測所建立的Taqman探針雙重熒光PCR檢測體系的抗干擾性以及其特異性檢測能力，確定該體系對混合樣品的檢測低限，所以決定從DNA核酸水平進行實驗確認。取牛、羊、豬和雞的純DNA模板，分別按表12所示制備各混合DNA樣品，進行Taqman探針雙重實時熒光PCR，以確定該體系用于混合樣品檢測的檢出限。 2 結(jié)果與分析 2.1 Taqman探針雙重實時熒光PCR

18、特異性實驗檢測結(jié)果 圖1為雙重體系中豬源體系的特異性檢測結(jié)果，該體系采用FAM熒光標記探針進行檢測。豬源體系僅對豬源成分產(chǎn)生擴增，與其他肉源（牛、羊、鴨、魚、雞）成分無交叉，陰性樣品（牛、羊、鴨、魚、雞）的Ct值限制在32 個循環(huán)以后，豬源檢測體系具有較好的特異性。圖2為雙重體系中雞源體系特異性的檢測結(jié)果，該體系采用HEX熒光標記探針進行檢測。雞源體系僅對雞源成分產(chǎn)生擴增，與其他成分（牛、羊、鴨、魚、豬）無交叉，陰性樣品（牛、羊、鴨、魚、豬）的Ct值限制在32 個循環(huán)以后，雞源檢測體系具有較好的特異性。 從實驗結(jié)果中可以看出，所建立的Taqman探針雙重實時熒光PCR體系對豬、雞成分產(chǎn)生有效擴

19、增，而對陰性樣品無明顯擴增且Ct值均限制在32 個循環(huán)以后，因此該雙重體系對豬、雞成分具有特異性，同時Ct值32.0視為不含有目標成分。 2.2 靈敏度實驗檢測結(jié)果 取純豬、雞肉提取DNA，采用微量核酸蛋白測定儀測定獲得模板DNA的濃度，用滅菌雙蒸水進行10 倍倍比稀釋。取各稀釋度的核酸2 L作為模板，進行豬-雞Taqman探針雙重熒光PCR檢測。豬源性DNA模板質(zhì)量濃度依次為10、1、0.1、0.01、0.001 ng/L，雞源性DNA模板質(zhì)量濃度依次為50、5、0.5、0.05、0.005 ng/L。 豬源檢測中DNA模板質(zhì)量濃度10、1、0.1、0.01、 0.001 ng/L的Ct值分

20、別為19.6、23.8、26.4、30.1、 32.0，其中0.01 ng/L的DNA模板質(zhì)量濃度的Ct值 30.132.0，其中0.05 ng/L的DNA模板質(zhì)量濃度的Ct值30.432.0，是該體系能檢出雞源性成分的最低限。因此在保證特異性的前提下，該豬-雞Taqman探針雙重熒光PCR體系最低檢測到豬、雞源DNA的含量分別為0.02、0.10 ng。 2.3 Taqman探針雙重熒光PCR混合樣品檢測能力驗證 由表3可知，模擬混合樣品中所有含有2%10%豬DNA的混合樣都獲得了成功擴增，Ct值在31.0724.83；其中含有2%10%雞DNA的混合樣也都獲得了成功擴增，Ct值在29.28

21、25.49。結(jié)果顯示，當DNA混樣中豬、雞含量在2%以上水平時，所建立的混合檢測體系均能對DNA混樣給出正確判斷，DNA混樣的豬、雞成分檢測下限為水平2%，證實所設(shè)計引物探針體系具有較好的抗干擾能力及較高的靈敏性。 3 討 論 本研究所建立的雙重熒光PCR，特異性強，僅對豬、雞成分有擴增，Ct值限制在32。該方法靈敏度高，最低檢測到豬、雞源DNA的含量分別為0.02、0.10 ng；抗干擾性強，當DNA混樣中豬、雞含量在2%以上水平時，所建立的混合檢測體系均能對DNA混樣給出正確判斷，適用于動物源性產(chǎn)品中豬、雞源性成分的鑒別檢測，可為食品安全和飼料監(jiān)管提供有效依據(jù)。 與食品標簽的食品成分不相符

22、合的食品摻假會誤導(dǎo)消費者，對消費者造成各種影響，甚至危害其身體健康，也影響社會的公平競爭和健康發(fā)展。當消費者選購食品時，通過觀察食品標簽就可以知道這種食品的成分，可以根據(jù)自己的需要做出合理的判斷、選擇。食物過敏者通?？梢员苊夂^敏成分的食物，關(guān)注健康膳食的人會傾向選擇雞、鴨、鵝等脂肪含量低的家禽肉類代替牛、羊、豬等脂肪含量高的畜肉類，患有某些疾病的患者也需要遵循醫(yī)囑忌食或少食某些種類的食物，各種宗教信仰人士會不吃某些特殊的肉類，如牛肉或豬肉，而素食者會禁食任何含肉的食品。食品摻假嚴重的甚至會威脅到人的生命，如安徽阜陽“大頭娃娃事件”中的涉案乳粉，以植物淀粉代替乳粉原料摻假，不僅造成嬰兒嚴重營養(yǎng)

23、不良，而且導(dǎo)致許多嬰兒死亡7。因此保證食品標簽的真實性對于消費者非常重要，而食品摻假的鑒定及檢測技術(shù)是保障食品標簽真實性的關(guān)鍵。 我國新出臺的食品安全法（2015版）明文規(guī)定：禁止生產(chǎn)經(jīng)營摻假摻雜食品。隨著食品質(zhì)量安全監(jiān)管部門檢測技術(shù)的不斷完善和更新，食品摻假的手段也在不斷提高。如牛乳摻假從最初摻水、尿、淀粉、三聚氰胺到最近的皮革水解蛋白，又如從向肉制品中注水到用豬肉、雞肉、鴨肉通過浸泡、加香精等方式偽裝成牛肉、羊肉。這種用同類物質(zhì)部分摻假的方法由于其隱蔽性、復(fù)雜性，而檢測技術(shù)、監(jiān)管體系又相對薄弱，導(dǎo)致被較多使用。Chen等8用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorb

24、ent assay，ELISA）方法從902 種食品中分別檢測到了15.9%的生肉類食品及22.9%的熟肉類食品中含有未標明的動物肉類成分。Ayaz等9在2006年對100 種肉類食品進行調(diào)查研究，研究發(fā)現(xiàn)，有22.0%含有標簽上未標明的肉源成分，它們中大部分是用禽肉代替牛肉進行摻假。為了維護市場的公平競爭，需要加強食品標簽管理及行之有效的食品成分檢測方法，建立快速、高效、定量的新的檢測體系是食品監(jiān)管的當務(wù)之急。 目前從物理技術(shù)、化學技術(shù)、免疫學技術(shù)、電泳技術(shù)以及DNA技術(shù)等方面均有對食品成分摻假鑒別的研究。物理技術(shù)可以針對肉類結(jié)構(gòu)的不同關(guān)鍵信息進行檢測，通過對檢測結(jié)果的比對，對肉類的品種和品

25、質(zhì)進行鑒定，特別適合用來評估肉的品質(zhì)。樊玉霞10通過可見-近紅外光譜對豬肉肉糜中粗脂肪、肌內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)、水分和14 種脂肪酸進行了研究，結(jié)合化學計量學方法對豬肉肉糜品質(zhì)進行研究。化學方法有氣相色譜（gas chromatography，GC）、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）等，GC、GC-MS通過檢測甘油三酯C2位置上的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比值或某些特定脂肪酸的含量來進行檢測鑒別。然而，由于肉制品中脂肪含量的變

26、化范圍很寬，因此脂肪分析只能應(yīng)用于動物來源的脂肪粗略檢測。HPLC11-12以及免疫學方法中的ELISA法13、蛋白質(zhì)等電聚焦方法14等對物種特有的蛋白質(zhì)或抗原決定簇進行辨別，可有效鑒定未加工生食物原料，但對混合樣品或者用香精、香料等處理后的樣品則無法準確分析出其中的物種，并且蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性差，經(jīng)過加工處理可能會改變其結(jié)構(gòu)，從而破壞物種辨別依據(jù)特有的蛋白質(zhì)或抗原決定簇，因此不適于加工熟肉制品；而且不同種屬之間蛋白質(zhì)也存在一定的種屬交叉反應(yīng)，尤其是近緣物種間的交叉反應(yīng)更為嚴重（例如綿羊和山羊），因此也不適于近緣物種的鑒別檢測15-16。大量以DNA為檢測對象的方法已經(jīng)用于食品成分造假檢測及種類鑒

27、定，如PCR17-18、限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）19-20、隨機擴增多態(tài)性DNA標記（random ampli?ed polymorphic DNA，RAPD）21、基因芯片技術(shù)22?；贒NA的種源鑒定檢測方法目前最受歡迎，源于DNA分子能耐受食品加工過程中的高溫高壓等極端條件而保持相對穩(wěn)定，并被有效擴增23。目前，實時探針熒光PCR技術(shù)運用熒光探針，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個過程，具備特異性高、樣本需求低（少量受檢樣品即可檢測）、耗時短、操作過程簡單同時具有無污染（閉管操作）、無毒性、高通量、多重擴

28、增、可定量分析的優(yōu)點24。因此，熒光PCR技術(shù)體系應(yīng)用于食品摻假的監(jiān)督和管理將是未來發(fā)展趨勢。目前國內(nèi)外已有關(guān)于利用實時熒光PCR技術(shù)進行肉種來源鑒定的文獻報道25-27，但涉及雙重熒光PCR的研究相對較少。 該實驗的目的在于建立一種熒光PCR方法，同時檢測動物源性食品中豬源性和雞源性成分，該研究的關(guān)鍵在于物種特異基因的正確選擇，測試選定的細胞色素b基因位于線粒體，線粒體DNA是遺傳檢測特定序列的理想目標，主要原因在于：1）含量高28：在所有的組織細胞中均存在大量的線粒體，可以獲得大量的線粒體DNA，即使是由于劇烈的加工條件而使得DNA嚴重破碎的情況下也能獲?。?）特異性高29：線粒體DNA在

29、不同物種間具有高度的特異性；3）研究成熟：國內(nèi)外成分鑒定的研究中選擇Cytb的較多，技術(shù)比較成熟30-34；4）獲取途徑便捷：在Genbank上，已經(jīng)有很豐富的動物Cytb基因序列登錄上傳，這些在一定程度上給實驗的實施提供了簡便前提條件。 參考文獻： 1 史競男， 鄒偉. 公安部公布肉制品犯罪典型案例N. 中國食品安全報， 2013-05-04（03）. 2 王海鵬. 17.5 噸假牛肉全是用豬肉做的N. 西安晚報， 2013-9-12（08）. 3 馬志英. 常見的食品摻假方式有哪些J. 生命與災(zāi)害， 2013（3）： 26-29. 4 WOOLFE M， PRIMROSE S. Food

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