2015高級(jí)生物化學(xué)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)試題答案

1、高級(jí)動(dòng)物生化試題問(wèn)答題：1. 簡(jiǎn)述非編碼RNA（non-coding RNA）的種類、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其主要功能。非編碼RNA的種類結(jié)構(gòu)和功能1 tRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transferRNA，tRNA）結(jié)構(gòu)特征之一是含有較多的修飾成分，核酸中大部分修飾成分是在tRNA中發(fā)現(xiàn)的。修飾成分在tRNA分子中的分布是有規(guī)律的，但其功能不清楚。5末端具有G（大部分）或C。3末端都以ACC的順序終結(jié)。有一個(gè)富有鳥(niǎo)嘌呤的環(huán)。有一個(gè)反密碼子環(huán)，在這一環(huán)的頂端有三個(gè)暴露的堿基，稱為反密碼子（anticodon）.反密碼子可以與mRNA鏈上互補(bǔ)的密碼子配對(duì)。有一個(gè)胸腺嘧啶環(huán)。tRNA具有三葉草型二級(jí)結(jié)構(gòu)以及“L”型三級(jí)

2、結(jié)構(gòu)，tRNA的不同種類及數(shù)量可對(duì)蛋白質(zhì)合成效率進(jìn)行調(diào)節(jié)。tRNA負(fù)責(zé)特異性讀取mRNA中包含的遺傳信息，并將信息轉(zhuǎn)化成相應(yīng)氨基酸后連接到多肽鏈中。tRNA為每個(gè)密碼子翻譯成氨基酸提供了結(jié)合體，同時(shí)還準(zhǔn)確地將所需氨基酸運(yùn)送到核糖體上。鑒于tRNA在蛋白質(zhì)合成中的關(guān)鍵作用，又把tRNA稱作第二遺傳密碼。tRNA還具有其他一些特異功能，例如，在沒(méi)有核糖體或其他核酸分子參與下，攜帶氨基酸轉(zhuǎn)移至專一的受體分子，以合成細(xì)胞膜或細(xì)胞壁組分；作為反轉(zhuǎn)錄酶引物參與DNA合成；作為某些酶的抑制劑等。有的氨酰-tRNA還能調(diào)節(jié)氨基酸的生物合成。2 rRNA核糖體RNA（ribosomalRNA,rRNA）核糖體R

3、NA是細(xì)胞中最為豐富的RNA，在活躍分裂的細(xì)菌細(xì)胞中占80%以上。他們是核糖體的組分，并直接參與核糖體中蛋白質(zhì)的合成。核糖體是rRNA提供了一個(gè)核糖體內(nèi)部的“腳手架”，蛋白質(zhì)可附著在上面。這種解釋很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白質(zhì)合成中的主動(dòng)作用。較后續(xù)的研究表明，rRNA并非僅僅起到物理支架作用，多種多樣的rRNA可起到識(shí)別、選擇tRNA以及催化肽鍵形成等多種主動(dòng)作用。例如：核糖體的功能就是,按照mRNA的指令將氨基酸合成多肽鏈。而這主要依靠核糖體識(shí)別tRNA并催化肽鍵形成而實(shí)現(xiàn)。可以說(shuō)核糖體是一個(gè)大的核酶(ribozyme)。而核糖體的催化功能主要是由rRNA來(lái)完成的,蛋白質(zhì)并沒(méi)有直

4、接參與。3 tmRNAtmRNA主要包括12個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)和4個(gè)“假結(jié)”結(jié)構(gòu)，同時(shí)還包括一個(gè)可譯框架序列的單鏈RNA結(jié)構(gòu)。tmRNA中H1由5端和3端兩個(gè)末端形成，與tRNA的氨基酸受體臂相似。H1和H2的5部分之間有一個(gè)由10-13nt形成的環(huán)，類似tRNA中的二氫尿嘧啶環(huán)，稱為“D”環(huán)。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之間分別形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之間則由一段包含編碼標(biāo)記肽ORF的單鏈RNA連接。H12由5個(gè)堿基對(duì)和7nt形成的環(huán)組成，類似tRNA中的TC臂和TC環(huán)，稱為“T”環(huán)。tmRNA結(jié)構(gòu)按照功能進(jìn)行劃分可分為tRNA類似域（TLD）和mRNA類

5、似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”環(huán)和“T”環(huán)，MDL則包括ORF和H5，這兩部分分別具有類似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一類普遍存在于各種細(xì)菌及細(xì)胞器（如葉綠體，線粒體）中的穩(wěn)定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的雙重功能，它在一種特殊的翻譯模式反式翻譯模式中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，它與基因的表達(dá)調(diào)控以及細(xì)胞周期的調(diào)控等生命過(guò)程密切相關(guān)，是細(xì)菌體內(nèi)蛋白質(zhì)合成中起“質(zhì)量控制”的重要分子之一。識(shí)別翻譯或讀碼有誤的核糖體，也識(shí)別那些延遲停轉(zhuǎn)的核糖體，介導(dǎo)這些有問(wèn)題的核糖體的崩解。4 核仁小RNA(snoRNA)絕大多數(shù)snoRNA可歸為兩類boxC/Dsno

6、RNA和boxH/ACAsnoRNA，均具有保守的特征二級(jí)結(jié)構(gòu)，boxC/DsnoRNA類能形成“發(fā)夾-鉸鏈-發(fā)夾-尾部”狀二級(jí)結(jié)構(gòu)。boxC/DsnoRNA其分子兩端的boxC,boxD以及末端配對(duì)序列能形成保守的“莖-內(nèi)環(huán)-莖”狀二級(jí)結(jié)構(gòu)，稱為“K-turn”結(jié)構(gòu)。大多數(shù)boxC/DsnoRNA和boxH/ACAsnoRNA分別具有指導(dǎo)rRNA，snRNA或tRNA前體中特定核苷2-O-核糖甲基化修飾與假尿嘧啶化修飾的功能；少部分snoRNA參與rRNA前體的加工剪切，與rRNA的正確折疊和組裝相關(guān)。5 微RNA（microRNAs；miRNA，小分子RNA）它是一類長(zhǎng)度為2125nt的單

7、鏈RNA分子片段，有一個(gè)很有趣的共同特點(diǎn)，就是它的序列存在于莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的莖上。這種莖環(huán)結(jié)構(gòu)通常是由70多個(gè)核苷酸組成的不完全的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，上面有一些凸起和環(huán)狀結(jié)構(gòu)。莖部形成雙鏈RNA，但不是嚴(yán)格互補(bǔ)，可存在錯(cuò)配和GU擺動(dòng)配對(duì)。據(jù)其作用模式的不同可以分為三類：第一類如lin4，與mRNA不完全互補(bǔ)，當(dāng)miRNA與靶mRNA不完全配對(duì)結(jié)合時(shí)，主要影響其翻譯過(guò)程而對(duì)mRNA的穩(wěn)定性無(wú)影響。第二類如miR39和miR171，與其靶mRNA完全互補(bǔ)，當(dāng)其與mRNA完全配對(duì)結(jié)合后，分裂切割靶mRNA。第三類作用模式如let7，當(dāng)其與靶RNA完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，直接靶向切割mRNA，而不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)起調(diào)節(jié)基因表

8、達(dá)的作用。6 小干擾RNA（SmallinterferingRNA；siRNA）siRNA是長(zhǎng)度20到25個(gè)核苷酸的雙股RNA，在生物學(xué)上有許多不同的用途。目前已知siRNA主要參與RNA干擾（RNAi）現(xiàn)象，以帶有專一性的方式調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。此外，也參與一些與RNAi相關(guān)的反應(yīng)途徑，例如抗病毒機(jī)制或是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。其生理意義在于，生物的抗御機(jī)制，調(diào)控細(xì)胞分化與胚胎發(fā)育，維持基因組的穩(wěn)定以及RNA水平上的調(diào)控機(jī)制。7 snRNA（小核RNA）： 它是真核生物轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程中RNA剪接體（spilceosome）的主要成分，參與mRNA前體的加工過(guò)程。另外，還有端體酶RNA(telomera

9、seRNA)，它與染色體末端的復(fù)制有關(guān)；以及反義RNA(antisenseRNA)，它參與基因表達(dá)的調(diào)控。還參與RNA剪接和RNA修飾。8 eRNAeRNA從內(nèi)含子或DNA非編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄的RNA分子，精細(xì)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。9 SNPRNA信號(hào)識(shí)別顆粒RNA，細(xì)胞質(zhì)中與含信號(hào)肽mRNA識(shí)別，決定分泌的RNA功能分子，它是一種核糖核酸蛋白復(fù)合體。能夠識(shí)別并結(jié)合剛從游離核糖體上合成出來(lái)的信號(hào)肽，暫時(shí)中止新生肽的合成，又能與其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的受體(即?？康鞍踪|(zhì))結(jié)合而將新生肽轉(zhuǎn)移入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，防止蛋白水解酶對(duì)其損害另外，還有端體酶RNA(telomeraseRNA)，它與染色體末端的復(fù)制有關(guān)；以及反義

10、RNA(antisenseRNA)，它參與基因表達(dá)的調(diào)控。還參與RNA剪接和RNA修飾。10 gRNA又稱引導(dǎo)RNA真核生物中參與RNA編輯的具有與mRNA互補(bǔ)序列的RNA,具有3寡聚U的尾巴,中間有一段與被編輯mRNA精確互補(bǔ)的序列,5端是一個(gè)錨定序列,它同非編輯的mRNA序列互補(bǔ)。在編輯時(shí),形成一個(gè)編輯體(editosome),以gRNAs內(nèi)部的序列作為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄物的校正,同時(shí)產(chǎn)生編輯的mRNA。gRNA3端的oligo(U)尾可作為被添加的U的供體。11 piRNA piRNA主要存在于哺乳動(dòng)物的生殖細(xì)胞和干細(xì)胞中，通過(guò)與Piwi亞家族蛋白結(jié)合形成piRNA復(fù)合物（piRC）來(lái)調(diào)控基因

11、沉默途徑。對(duì)Piwi亞家族蛋白的遺傳分析以及piRNA積累的時(shí)間特性研究發(fā)現(xiàn)，piRC在配子發(fā)生過(guò)程中起著十分重要的作用。還能維持生殖系和干細(xì)胞功能和調(diào)節(jié)翻譯和mRNA的穩(wěn)定性。12 atRNA（反義RNA）是指與mRNA互補(bǔ)的RNA分子,由于核糖體不能翻譯雙鏈的RNA，所以反義RNA與mRNA特異性的互補(bǔ)結(jié)合,即抑制了該mRNA的翻譯。通過(guò)反義RNA控制mRNA的翻譯是原核生物基因表達(dá)調(diào)控的一種方式，反義RNA也參與了和P22噬菌體的溶菌/溶源狀態(tài)的控制。2. 請(qǐng)以發(fā)育生物學(xué)（developmental biology）、表觀遺傳學(xué)(epigenetics)、體細(xì)胞重編程技術(shù)(somatic

12、 cell reprogramming)、體細(xì)胞克隆(somatic cell cloning)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)或誘導(dǎo)干細(xì)胞(iPS)、干細(xì)胞(stem cell)為關(guān)鍵詞，閱讀至少一篇2010年以后的外文文獻(xiàn)，闡述相關(guān)方面研究進(jìn)展，或有關(guān)技術(shù)在動(dòng)物生殖細(xì)胞（卵母細(xì)胞、精子）發(fā)生、卵泡發(fā)育、早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的應(yīng)用研究（不少于2000字，并附上所閱讀文獻(xiàn)全文）。注意不能抄襲有關(guān)中文文獻(xiàn)。動(dòng)物生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)試題1、 試述分子雜交技術(shù)（核酸和蛋白質(zhì)）的種類、適用范圍及特點(diǎn)。核酸分子雜交技術(shù)是利用DNA變性與復(fù)性的原理，在某種理化因素作用下DNA雙鏈分子解鏈變性后，在DNA復(fù)性重新形成

13、雙螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)，把不同的DNA單鏈分子或者DNA與RNA的混合物放在同一溶液中，只要在DNA或RNA單鏈分子之間存在一定的堿基互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系，就可以在DNA之間或DNA與RNA之間形成雜化的雙鏈。蛋白質(zhì)分子雜交是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。面重點(diǎn)介紹三種常用的分子雜交技術(shù)。（1） Southern雜交-DNA和DNA分子之間的雜交southern雜交主要用來(lái)研究DNA分子中某一基因位置、某一專一序列在待檢樣品中存在與否及兩種核酸分子之間的相似性。1、用于對(duì)基因組中特定基因的定位及檢測(cè)。2、用于從基因文庫(kù)中找到所需要的基因。（2） Northern雜交DNA和RNA分子之間的雜交。目前主要

14、用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異性mRNA的表達(dá)水平或比較不同組織或細(xì)胞中同一基因的表達(dá)情況，如在基囚工程中是檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA的方法。如果RNA分子在大小和含量上與正常情況不同，可以考慮是否有調(diào)控區(qū)的突變或剪接部分的突變。（3） western雜交蛋白質(zhì)分子(抗原一抗體)之間的雜交?？捎糜跈z測(cè)樣品中特異蛋白質(zhì)是否存在、細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的半定量分析以及蛋白質(zhì)分子的相互作用研究等。如檢測(cè)目的基因在受細(xì)胞中有沒(méi)有翻譯出相應(yīng)的蛋白質(zhì)，檢測(cè)病人血液中是否有某種抗體從而檢測(cè)是否感染過(guò)某種抗原，單克隆抗體技術(shù)中用于篩選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞等。2. 簡(jiǎn)述核酸和蛋白質(zhì)濃度分析方法。（1）

15、紫外分光光度法紫外分光光度法基于DNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸收，DNA/RNA在260nm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。因此，可以用260nm波長(zhǎng)進(jìn)行分光測(cè)定核酸濃度，OD值為1相當(dāng)于大約50g/ml雙鏈DNA，單鏈DNA濃度約為33g/ml，RNA約為40g/ml，寡核苷酸約為35g/ml。如用1cm光徑，用H2O稀釋DNA/RNA樣品n倍并以H2O為空白對(duì)照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度：DNA（mg/ml）=50OD260讀數(shù)稀釋倍數(shù)/1000RNA（mg/ml）=40OD260讀數(shù)稀釋倍數(shù)/1

16、000。A280nm是蛋白和酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估：純DNA的A260/A280比值為1.8，純RNA為2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳香族）或分類物質(zhì)的污染，需要純化樣品。比值=1.5相當(dāng)于50%蛋白質(zhì)/DNA溶液。A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估：純DNA和RNA的A260/A230比值為2.5。若比值小于2.0標(biāo)明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機(jī)溶劑污染，需要純化樣品。A320nm或A340nm為檢測(cè)溶液樣品的濁度，該值應(yīng)該接近0.0。假如不足，標(biāo)明溶液中有懸浮物，需要純化樣品。（2）定糖定磷法定糖定磷法是

17、通過(guò)測(cè)定核酸中戊糖和無(wú)機(jī)磷含量實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸含量的測(cè)定。該法無(wú)需特殊儀器，只需要將地衣酚、二苯胺及鉬酸銨等與核酸樣品反應(yīng)，再通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定光吸收值即可定量核酸。但此法準(zhǔn)確度差、靈敏度低、干擾物多、操作繁瑣，在現(xiàn)今的研究中已較少采用。比如二苯胺法是利用脫氧核糖核酸中的脫氧核糖在酸性環(huán)境中變成羥基酮基戊醛與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在595nm處有最大的吸收，在每毫升含DNA20-400微克范圍內(nèi)，光密度與DNA的濃度成正比，在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)的靈敏度。除DNA外，脫氧木糖、阿拉伯糖也有同樣的反應(yīng)。少采用。比如二苯胺法是利用脫氧核糖核酸中的脫氧核糖在酸性環(huán)境中變成羥基酮基

18、戊醛與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在595nm處有最大的吸收，在每毫升含DNA20-400微克范圍內(nèi)，光密度與DNA的濃度成正比，在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)的靈敏度。除DNA外，脫氧木糖、阿拉伯糖也有同樣的反應(yīng)。1、DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取8支試管，編號(hào)，以一定的梯度依次加入不同濃度的DNA溶液和二苯胺試劑試劑。加畢，搖勻，于60恒溫水浴中保溫1小時(shí)，（或于沸水中煮沸15分鐘，冷卻測(cè)0.D595nm值）。以光密度為縱坐標(biāo)，DNA含量（ug/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品的測(cè)定取2支試管，各加0.2-0.5毫升的待測(cè)液（內(nèi)含DNA應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線可測(cè)范圍之內(nèi)）加蒸餾水稀釋至2毫

19、升，再加4毫升二苯胺試劑，搖勻，其操作步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作相同。根據(jù)測(cè)得的光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)該光密度DNA的含量，按下式計(jì)算出樣品中DNA的百分含量。DNA含量/毫升待測(cè)液=標(biāo)準(zhǔn)曲線查得值稀釋倍數(shù)注意事項(xiàng)。1、二茉胺法測(cè)定DNA含量靈敏度不高，待測(cè)樣品中DNA含量低于50mg/L即難以測(cè)定。乙醛可增加二苯胺法測(cè)定DNA的發(fā)色量，又可減少脫氧木糖和阿拉伯糖的干擾，能顯著提高測(cè)定的靈敏度。2、樣品中含有少量RNA并不影響測(cè)定，但因蛋白質(zhì)、多種糖類及其衍生物、芳香醛、羥基醛等能與二苯胺反應(yīng)形成有色化合物，故能干擾DNA定理。（3）酶催化法基于酶催化的核酸定值方法是一種相對(duì)核酸定量法。其原

20、理是染料能同時(shí)與酶和核酸結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)酶的催化活性即可實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的定量。此法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要通過(guò)核酸擴(kuò)增，操作方便，使用的儀器簡(jiǎn)單。但該法實(shí)驗(yàn)中，酶的催化活性受多方面影響，難以達(dá)到最佳狀態(tài)，會(huì)使定量結(jié)果出現(xiàn)偏差。（3）熒光染料法熒光染料法是通過(guò)檢測(cè)熒光試劑與DNA結(jié)合后的熒光強(qiáng)度變化而實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的定量。某些熒光探針試劑本身熒光強(qiáng)度不大，但與DNA結(jié)合后熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)，如：溴化乙錠在水溶液中的熒光量子產(chǎn)率很低，但它與DNA結(jié)合后，產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，激發(fā)波長(zhǎng)顯著紅移；又如Hoechst33258是一種雙苯并咪唑熒光染料，可高度特異地與雙鏈DNA非嵌入性結(jié)合，結(jié)合后其熒光率由0.01增至0.6。熒光

21、染料法適用于樣品中DNA或RNA含量較低或含有較多雜質(zhì)的樣品，絕對(duì)靈敏度很高.如利用Hoechst33258可測(cè)定納克級(jí)水平的DNA。PicoGreen及SYBRGreen的檢測(cè)靈敏度較EB和Hoechst33258更高，PicoGreen可檢測(cè)低至0.25-0.5ng的DNA樣品。前已有許多商品化核酸定量熒光染料，如Invitrogen公司用于測(cè)定雙鏈DNA的PicoGreen、用于測(cè)定單鏈DNA的OliGreen及用于測(cè)定RNA含量的RiboGreen等。含這些染料的核酸定量試劑盒被認(rèn)為是目前對(duì)微量核酸定量較準(zhǔn)確的方法。與紫外分光光度法相比，熒光染料法的應(yīng)用尚不廣泛它存在以下缺陷：（1）某

22、些熒光染料（如EB等）具有極強(qiáng)的毒性和致誘變性；（2）熒光分析對(duì)環(huán)境因素極為敏感，易受溫度、光度、酸度、溶解氧及污染物等干擾；（3）該法需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，操作較復(fù)雜；（4）需專業(yè)的定量試劑盒，價(jià)格昂貴；（5）精確定量需依賴已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而目前缺乏經(jīng)過(guò)精確定值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，且少數(shù)現(xiàn)今采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（DNA）的定量方法為紫外分光光度法，這就產(chǎn)生潛在的偏差并使測(cè)量結(jié)果無(wú)法溯源到國(guó)際單位制。在水溶液中的熒光量子產(chǎn)率很低，但它與DNA結(jié)合后，產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，激發(fā)波長(zhǎng)顯著紅移；又如Hoechst33258是一種雙苯并咪唑熒光染料，可高度特異地與雙鏈DNA非嵌入性結(jié)合，結(jié)合后其熒光率由0.01增至0.6。熒

23、光染料法適用于樣品中DNA或RNA含量較低或含有較多雜質(zhì)的樣品，絕對(duì)靈敏度很高.如利用Hoechst33258可測(cè)定納克級(jí)水平的DNA。PicoGreen及SYBRGreen的檢測(cè)靈敏度較EB和Hoechst33258更高，PicoGreen可檢測(cè)低至0.25-0.5ng的DNA樣品。目前已有許多商品化核酸定量熒光染料，如Invitrogen公司用于測(cè)定雙鏈DNA的PicoGreen、用于測(cè)定單鏈DNA的OliGreen及用于測(cè)定RNA含量的RiboGreen等。含這些染料的核酸定量試劑盒被認(rèn)為是目前對(duì)微量核酸定量較準(zhǔn)確的方法。與紫外分光光度法相比，熒光染料法的應(yīng)用尚不廣泛它存在以下缺陷：（1

24、）某些熒光染料（如EB等）具有極強(qiáng)的毒性和致誘變性；（2）熒光分析對(duì)環(huán)境因素極為敏感，易受溫度、光度、酸度、溶解氧及污染物等干擾；（3）該法需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，操作較復(fù)雜；（4）需專業(yè)的定量試劑盒，價(jià)格昂貴；（5）精確定量需依賴已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而目前缺乏經(jīng)過(guò)精確定值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，且少數(shù)現(xiàn)今采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（DNA）的定量方法為紫外分光光度法，這就產(chǎn)生潛在的偏差并使測(cè)量結(jié)果無(wú)法溯源到國(guó)際單位制。（4）雜交定量法雜交定量法主要包括：Southern雜交、Northern雜交、基因芯片、支鏈信號(hào)放大技術(shù)及Rnase保護(hù)技術(shù)。Southern雜交特異性強(qiáng)，但操作復(fù)雜，靈敏度低。與Southern雜交類似的是

25、用于檢測(cè)RNA的Northern雜交技術(shù)，可用于基因表達(dá)量的比較研究。生物芯片是一種高通量的雜交定量技術(shù)。該技術(shù)以核酸雜交為基礎(chǔ)，將短的寡核苷酸或cDNA序列高密度地固定在固相支持物的表面，然后加入已標(biāo)記的目的序列進(jìn)行雜交，之后檢測(cè)熒光信號(hào)。由于熒光信號(hào)的強(qiáng)度與目標(biāo)分子的數(shù)目成比例，從而實(shí)現(xiàn)核酸定量檢測(cè)。支鏈信號(hào)放大技術(shù)采用了一種人工合成的、結(jié)構(gòu)如同樹(shù)枝的DNA信號(hào)放大探針?lè)种ф淒NA，其優(yōu)點(diǎn)是：（1）只需將釋放的核酸變性，樣品處理簡(jiǎn)單；（2）不經(jīng)過(guò)指數(shù)增長(zhǎng)的擴(kuò)增過(guò)程，避免了擴(kuò)增產(chǎn)物污染及PCR抑制因素的影響；（3）可高通量檢測(cè)病原體。但該方法成本較高，且當(dāng)放大倍數(shù)低時(shí)，敏感性較差，檢測(cè)范圍窄

26、，不適用于RNA的低濃度檢測(cè)。RNase保護(hù)技術(shù)由Zinn于1983年首次提出，此法的靈敏度高于Northern雜交，但成本比較高、放射性同位素有致癌作用，且所轉(zhuǎn)錄成的RNA易降解，增加了實(shí)驗(yàn)誤差。蛋白質(zhì)濃度分析方法一、蛋白濃度的直接測(cè)定（UV法）這種方法是在280nm波長(zhǎng)，直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程非常簡(jiǎn)單，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō)，速度快，操作簡(jiǎn)單；但是容易受到平行

27、物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。二紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量：大多數(shù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）殘基，使蛋白質(zhì)在280nm的紫外光區(qū)產(chǎn)生最大吸收，并且這一波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收值與蛋白質(zhì)濃度的成正比，利用這一特性可定量測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。紫外吸收法可測(cè)定0.1-0.5mg/ml的蛋白質(zhì)溶液，此操作簡(jiǎn)便，測(cè)定迅速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定。因此，此法在蛋白質(zhì)的制備中廣泛應(yīng)用。三雙縮脲法（Biuret法）雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為

28、雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍為110mg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。四BCA方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量BCA檢測(cè)法是Lowry測(cè)定法的一種改進(jìn)方法。與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡(jiǎn)單，試劑更加穩(wěn)定，幾乎沒(méi)有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度更高（微量檢測(cè)可達(dá)到0.5g/ml），應(yīng)用更加靈活。蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物，同時(shí)將Cu2+還原成Cu+。二喹

29、啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結(jié)合生成深紫色的化合物，這種穩(wěn)定的化合物在562nm處具有強(qiáng)吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。五凱氏定氮法：凱氏定氮法用于測(cè)定有機(jī)物的含氮量,若蛋白質(zhì)的含氮量已知時(shí)，則可用此法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與濃硫酸共熱時(shí)，其中的碳、氫兩元素被氧化成二氧化碳和水，而氮?jiǎng)t轉(zhuǎn)變成氨，并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨。此過(guò)程通常稱為“消化”。但是，這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)液的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。消化完成后，在凱氏定氮儀中加入濃堿，

30、可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借助水蒸汽蒸餾法，將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量、一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中氫離子結(jié)合，使溶液中的氫離子濃度降低，指示劑顏色改變，然后用標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)鹽酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來(lái)的氫離子濃度為止。根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的量可計(jì)算出待測(cè)物中的總氮量。蛋白質(zhì)的含氮量為16%，即1克蛋白質(zhì)中的氮相當(dāng)于6.25克蛋白質(zhì)，用凱氏定氮法測(cè)出的含氮量乘以6.25,即得樣品中蛋白質(zhì)的含量。3. 預(yù)對(duì)某個(gè)基因的表達(dá)（RNA和蛋白質(zhì)水平）進(jìn)行定性和定量分析，試述可采用的技術(shù)路線和主要實(shí)驗(yàn)方法。答：通過(guò)mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)： Northern blot、real time PC

31、R、原位雜交等。通過(guò)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)：（1）定量檢測(cè)分析：western bloting（2）蛋白質(zhì)功能分析：免疫熒光技術(shù)、酵母雙雜交、ChIP、熒光共振能量轉(zhuǎn)移等。可采用的技術(shù)路線和主要實(shí)驗(yàn)方法有：（1） mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)Northern Blot:是一種基于RNA-DNA雜交原理建立的一種RNA分析技術(shù)。將RNA變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用雜交反應(yīng)來(lái)鑒定其中特定mRNA分子的含量及其大小。基本步驟：完整mRNA的分離根據(jù)RNA的大小通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA進(jìn)行分離將RNA轉(zhuǎn)移到固相支持物（尼龍膜）上，在轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，要保持RNA在凝膠中的相對(duì)分布將RNA固定在支持物上（UV交聯(lián)）固相RNA與探針?lè)肿樱―NA或RNA）雜交除去非特異性結(jié)合到固相支持物上的探針?lè)肿訉?duì)特異性結(jié)合的探針?lè)肿拥膱D像進(jìn)行檢測(cè)、捕獲和分析。real time PCR又稱實(shí)時(shí)定量熒光PCR，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行總量分析或通