動(dòng)物克隆2019年3月二輪復(fù)習(xí)ppt課件

1、第三節(jié) 動(dòng)物的克隆,動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)和 克隆形成,1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),一）動(dòng)物細(xì)胞、組織培養(yǎng),將動(dòng)物體內(nèi)的一部分組織取出,分散成單個(gè)細(xì)胞,放在適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng),細(xì)胞得以生存并保持生命活動(dòng)現(xiàn)象,生長(zhǎng)、分裂乃至接觸抑制和有規(guī)律的衰老、死亡等,一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)和克隆形成,機(jī)械消化或胰酶消化,1）定義,正常細(xì)胞,癌細(xì)胞,接觸抑制,2）動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程,取動(dòng)物胚胎 或幼齡動(dòng)物 器官和組織,剪碎組織,胰蛋白酶處理,細(xì)胞培養(yǎng),單個(gè)細(xì)胞,2、為什么要用胰蛋白酶對(duì)取出的動(dòng)物組織進(jìn)行處理,可以使動(dòng)物組織細(xì)胞間的膠原纖維和細(xì)胞外的其他成分酶解，獲得單個(gè)細(xì)胞,思考,1、為什么選用動(dòng)物胚胎或幼齡個(gè)體的器官或組織做動(dòng)物細(xì)

2、胞培養(yǎng)材料,因?yàn)檫@些組織或器官上的細(xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng),3、為什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞,成塊組織不利培養(yǎng)，分散了做成細(xì)胞懸浮液利于培養(yǎng),原代培養(yǎng),傳代培養(yǎng),從機(jī)體取出后立即進(jìn)行的細(xì)胞、組織培養(yǎng),原代培養(yǎng)細(xì)胞分成若干份，接種到若干份培養(yǎng)基中，使其繼續(xù)生長(zhǎng)，增殖,生長(zhǎng)暈 是指組織塊接種進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)56天后，把培養(yǎng)瓶置于倒置相差顯微鏡下觀察，可見到有細(xì)胞從組織塊周邊生長(zhǎng)，呈放射狀排列,從動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物組織切片中取小片樣品,轉(zhuǎn)入特殊培養(yǎng)液 原代培養(yǎng),分裝到多個(gè)卡氏瓶中 傳代培養(yǎng),單個(gè)細(xì)胞懸浮液,細(xì)胞系,機(jī)械消化或胰酶消化 （胰蛋白酶,培養(yǎng)過(guò)程,動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的膠原纖

3、維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來(lái)形成具有一定彈性和韌性的組織和器官,原代培養(yǎng)物,二氧化碳培養(yǎng)箱 通過(guò)在培養(yǎng)箱內(nèi)模擬形成一個(gè)類似細(xì)胞或組織在生物體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，如恒定的pH值（7.2-7.4）、穩(wěn)定的溫度（37C）、較高的相對(duì)濕度（95%）、穩(wěn)定的CO2水平（5%），來(lái)對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行體外培養(yǎng)的一種裝置,如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)？為什么要傳代培養(yǎng),細(xì)胞懸浮液,為什么,1.離體動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特性,1）貼壁生長(zhǎng)： 懸浮液中分散的細(xì)胞緊貼培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁才能生長(zhǎng)。 （2）接觸抑制： 當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞就會(huì)停止分裂。 （3）正常的生命活動(dòng)： 生長(zhǎng)、分裂、有規(guī)律的衰老、死亡等現(xiàn)象，但不分化,2

4、.傳代培養(yǎng)的原因,如果不進(jìn)行傳代培養(yǎng)，就會(huì)因細(xì)胞密度過(guò)大和代謝消耗引起營(yíng)養(yǎng)枯竭，不能正常生長(zhǎng),細(xì)胞系、細(xì)胞株,原代培養(yǎng)物,細(xì)胞系 原代培養(yǎng)物在首次 傳代時(shí)就成為細(xì)胞系,連續(xù) 細(xì)胞系,有限 細(xì)胞系,細(xì)胞系,有關(guān)概念,2）連續(xù)細(xì)胞系,1）有限細(xì)胞系,連續(xù)細(xì)胞株,有限細(xì)胞株,細(xì)胞株,可連續(xù)傳代的細(xì)胞,不能連續(xù)培養(yǎng)下去的細(xì)胞系,能連續(xù)培養(yǎng)下去的細(xì)胞系,大多數(shù)具有異倍體核型，有的是惡性細(xì)胞系，具有異體致瘤性，有的獲得不死性（保留接觸抑制，不致癌,例：二倍體細(xì)胞,通過(guò)一定的選擇或純化方法，從原代培養(yǎng)或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)的細(xì)胞,具有恒定的染色體組型、同工酶類型、病毒敏感性和生化特性,3）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

5、的條件,1.無(wú)菌無(wú)毒的環(huán)境 2.營(yíng)養(yǎng) 3.溫度和pH 4.氣體環(huán)境,植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較,細(xì)胞的全能性,細(xì)胞增殖,固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基,蔗糖 植物激素,葡萄糖 動(dòng)物血清,植物體,細(xì)胞株、細(xì)胞系,快速繁殖、 培育無(wú)病毒植株,獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白,7.1951年，海拉細(xì)胞系的建成,6.1950年，人工培養(yǎng)液“199”研制成功,1.1885年，雞神經(jīng)板在生理鹽水中培養(yǎng)成活,2.1903年，皮膚及白細(xì)胞在腹水及血清中存活一個(gè)月，且觀察到細(xì)胞分裂,3.1907年，蛙胚神經(jīng)管在蛙淋巴液中懸浮培養(yǎng)，成功看到神經(jīng)末端的阿米巴運(yùn)動(dòng),4.1912年，雞胚浸出液對(duì)雞胚心臟組織塊進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)

6、,5.1943年，獲得長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞系（可連續(xù)傳代）和細(xì)胞克隆,組織培養(yǎng)”一詞產(chǎn)生,真正的組織培養(yǎng)開始； 創(chuàng)立了懸浮培養(yǎng)法,成功進(jìn)行了傳代培養(yǎng)； 發(fā)明了卡氏瓶,標(biāo)志著組織培養(yǎng)工作進(jìn)入全新階段,二）動(dòng)物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)：體外培養(yǎng)分散后的單個(gè)細(xì)胞，使其得以生存，并保持生命活動(dòng)現(xiàn)象。像體內(nèi)一樣呈現(xiàn)一定的組織特性,動(dòng)物組織培養(yǎng)：體外培養(yǎng)動(dòng)物組織，使其維持生活狀態(tài)或生長(zhǎng)特性。可以伴隨組織分化，但最終成為細(xì)胞培養(yǎng),動(dòng)物器官培養(yǎng)： 體外培養(yǎng)動(dòng)物器官原基、部分或整個(gè)器官，使之得以保存、生長(zhǎng)。保持器官的結(jié)構(gòu)、功能及分化能力,組織培養(yǎng),第43頁(yè),三）克隆培養(yǎng)法,把一個(gè)單細(xì)胞從群體中分離出來(lái)單獨(dú)培養(yǎng)，

7、使之繁衍成一個(gè)新的細(xì)胞群體的技術(shù),1.定義,未經(jīng)克隆的異質(zhì)性細(xì)胞系,純系,克隆,經(jīng)克隆以后的細(xì)胞的后裔細(xì)胞群，來(lái)源于一個(gè)共同的祖細(xì)胞,2.產(chǎn)物,遺傳性狀均一、表現(xiàn)的性狀相似,3.細(xì)胞克隆的基本要求,必須保證所建成的克隆來(lái)源于單個(gè)細(xì)胞,4.適合于克隆的細(xì)胞： 對(duì)環(huán)境有較大適應(yīng)范圍和具有較強(qiáng)獨(dú)立生存能力的細(xì)胞,5.提高細(xì)胞克隆形成率的措施,選擇適宜的培養(yǎng)基 添加血清 （胎牛血清） (能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和貼附) 以滋養(yǎng)細(xì)胞支持生長(zhǎng)（經(jīng)射線照射的小鼠成纖維細(xì)胞） 激素刺激（胰島素等） 使用CO2培養(yǎng)箱，調(diào)節(jié)PH,群體細(xì)胞 單細(xì)胞 無(wú)限細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化或腫瘤細(xì)胞 原代細(xì)胞、有限細(xì)胞系,6.細(xì)胞克隆的主要

8、用途： 從普通細(xì)胞系中分離出缺乏特殊基因的突變細(xì)胞系。 用于研究細(xì)胞的遺傳規(guī)律和生理特性,動(dòng)物的細(xì)胞融合技術(shù)及其應(yīng)用,動(dòng)物細(xì)胞融合的方法有哪些？ 雜交瘤細(xì)胞的特點(diǎn)是什么,第一次篩選,篩選的目的：獲得雜交瘤細(xì)胞,篩選的方法： 1、用選擇性培養(yǎng)基來(lái)完成，即HAT培養(yǎng)基,淋巴細(xì)胞： 不能生長(zhǎng)，DNA的主要合成途徑被A阻斷。 骨髓瘤細(xì)胞： 不能生長(zhǎng)，HGPRT缺乏，DNA合成的旁路途經(jīng)受阻,雜交瘤細(xì)胞： 可長(zhǎng)期生長(zhǎng)繁殖。兩者途徑互補(bǔ)，完成DNA合成,2、通過(guò)抗體檢驗(yàn)，篩選出產(chǎn)生抗體的陽(yáng)性細(xì)胞,第二次篩選,篩選的目的： 篩選只針對(duì)某一種特定的抗原決定簇產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞，即得到由一個(gè)細(xì)胞分裂而成的一個(gè)

9、細(xì)胞群并且能產(chǎn)生所需抗體,篩選的方法： （1）分離單個(gè)細(xì)胞置入多孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔中培養(yǎng)。 （2）檢測(cè)每孔細(xì)胞是否產(chǎn)生所注射抗原部位專一的抗體,選出產(chǎn)生特定抗體的陽(yáng)性細(xì)胞再克隆,動(dòng)物的克隆繁殖,一、動(dòng)物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度,1、動(dòng)物的受精卵，卵裂球含有2-8個(gè)細(xì)胞時(shí)，每個(gè)細(xì)胞具有全能性,2、隨著胚胎發(fā)育的繼續(xù)，有的細(xì)胞只具有分化出各種組織細(xì)胞的潛能，這樣的細(xì)胞叫多能干細(xì)胞,3、有的細(xì)胞只能分化為一種細(xì)胞，叫單能干細(xì)胞,受精卵,胚胎干細(xì)胞,多能干細(xì)胞,單能干細(xì)胞,體細(xì)胞,2.低等動(dòng)物細(xì)胞：全能性一般容易體現(xiàn),1.高等動(dòng)物細(xì)胞,3.癌細(xì)胞：仍能逆轉(zhuǎn)為正常細(xì)胞,無(wú)論分化還是癌變，變化的都是表現(xiàn)型，基因

10、組成的完整性可以保留,一、動(dòng)物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度,為什么動(dòng)物細(xì)胞很難表現(xiàn)出全能性,二、動(dòng)物難以克隆的根本原因,基因的選擇性表達(dá)（差異表達(dá)），使得細(xì)胞中合成了專一的蛋白質(zhì)，即動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了分化。 分化的細(xì)胞，其基因組中的基因不同時(shí)進(jìn)行活動(dòng),動(dòng)物基因組,一類基因：維持生存，各種細(xì)胞中都處于活動(dòng)狀態(tài),一類基因：隨著組織器官和發(fā)育階段不同而選擇性表達(dá),三、核移植和動(dòng)物的克隆繁殖,1.核移植： 利用一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核（供體核）,來(lái)取代另一細(xì)胞中的細(xì)胞核，形成一個(gè)重建的“合子”（重組細(xì)胞），使發(fā)育成一個(gè)新的個(gè)體,胚胎細(xì)胞克?。菏褂玫墓w核來(lái)自胚胎,體細(xì)胞克?。菏褂玫墓w核來(lái)自體細(xì)胞,1952年，羅伯特

11、.布里格斯： 豹蛙 囊胚細(xì)胞核+去核的卵母細(xì)胞 發(fā)育成個(gè)體,1978年，童第周： 黑斑蛙成體紅細(xì)胞核去核的卵細(xì)胞中發(fā)育成蝌蚪,2.動(dòng)物克隆繁殖,胚胎細(xì)胞核移植成功率遠(yuǎn)高于成體細(xì)胞核移植,克隆羊培育過(guò)程,另一頭綿羊的子宮,體細(xì)胞核移植技術(shù)實(shí)例2,體細(xì)胞克隆羊成功的分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)理,1.核移植前對(duì)乳腺細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)限制性培養(yǎng)（調(diào)節(jié)牛血清濃度）和電脈沖細(xì)胞融合技術(shù)(胚激活），有利于核的變化和細(xì)胞融合后基因表達(dá)分子開關(guān)啟動(dòng)。 2.重組卵細(xì)胞最初分裂時(shí)，轉(zhuǎn)錄并未開始。 3.重組卵細(xì)胞的供體核DNA丟失了來(lái)源于乳腺細(xì)胞的阻止核基因表達(dá)的調(diào)節(jié)蛋白。 4.開始第三次分裂時(shí)，原乳腺細(xì)胞的調(diào)節(jié)蛋白全部被卵細(xì)胞質(zhì)中的蛋白因子替換了，核DNA被重新編排，胚細(xì)胞開始表達(dá)自己的基因,體細(xì)胞克隆羊的培育成功，證明了什么？ 高度分化細(xì)胞經(jīng)一定技術(shù)處理，也可回復(fù)到類似受精卵時(shí)期的功能。 在胚胎和個(gè)體發(fā)育中，細(xì)胞質(zhì)具有調(diào)控細(xì)胞核（包括異源的細(xì)胞核