定量數(shù)據(jù)分析熒光定量PCR技術(shù) 常見(jiàn)問(wèn)題與解答

1、 螺旋課堂第一課熒光定量 PCR 技術(shù) PCR 技術(shù)的發(fā)明極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)的發(fā)展，而且迅速被推廣和應(yīng)用到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，可以說(shuō)它是目前核酸分子水平的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究中使用最廣泛的一項(xiàng)技術(shù)。 常規(guī) PCR 中，在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后，我們一般通過(guò)凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性的分析，無(wú)法對(duì) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，也無(wú)法對(duì)起始模板 準(zhǔn)確定量，而很多情況下，我們所感興趣的是起始模板量，如轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物中插入某種外源基因的拷貝數(shù)或者病人中某種病毒 DNA/RNA 的精確 copy 數(shù)等，如此，熒光定量 PCR 技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生。 本文將分為三大部分向大家介紹，首先是理論篇：首先了解熒光定量

2、PCR 的理論知識(shí)，如熒光定量 PCR 技術(shù)的原理、方法等；隨后為實(shí)踐篇：如實(shí)驗(yàn)的操作流程、注意事項(xiàng)、方法選擇、結(jié)果分析與處理等；第三部分為問(wèn)題分析與解答篇：熒光定量 PCR 過(guò)程中有哪些常見(jiàn)問(wèn)題，我們?nèi)绾伪苊夂徒鉀Q。 理論篇第一章 一、熒光定量PCR 技術(shù)發(fā)展史 方法和封閉式檢測(cè)方式對(duì)PCR Higuchi 1993 年，日本 等人首次采用動(dòng)態(tài) 技術(shù)的概念。當(dāng)時(shí)他使PCR 目的核酸數(shù)量進(jìn)行定量分析，首次提出了熒光定量 UV 用了 EB （溴乙錠）作為熒光標(biāo)記染料，采用一臺(tái)經(jīng)過(guò)改良的熱循環(huán)儀，用反應(yīng)中的數(shù) PCR 射線照射樣品然后通過(guò)CCD 相機(jī)檢測(cè)產(chǎn)生的熒光值，利用了但學(xué)函數(shù)關(guān)系，再結(jié)合加入

3、標(biāo)準(zhǔn)品的方法，達(dá)到了對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量的目的， 產(chǎn)物PCR 由于這種方法由于有著在實(shí)驗(yàn)儀器資金上巨大的耗費(fèi)，一些非特異的 同樣能被檢測(cè)到并包含在被測(cè)的熒光信號(hào)值總量之中而導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確等因素， 最終使這種實(shí)驗(yàn)技術(shù)在當(dāng)時(shí)沒(méi)能成為主流的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。年又推出了首臺(tái)熒光技術(shù)，1996 公司成功研制了1995 年美國(guó) PE TaqMan PCR 定量 檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)循環(huán)的熒光強(qiáng)度，并使用 Ct 值進(jìn)行分析， 才很快得到大家的接受，并廣為應(yīng)用。PCR 熒光定量 技術(shù)不斷完善，取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。由于其具 近年來(lái)，熒光定量PCR 有操作簡(jiǎn)單、快速方便、靈敏度高、重復(fù)性好、污染率低等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛

4、應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、藥物研發(fā)、臨床診斷、轉(zhuǎn)基因研究、基因檢測(cè)等各個(gè)領(lǐng)域研究當(dāng) 中。 二、熒光定量 PCR 概述 、熒光定量PCR 概念1反應(yīng)體系中加入熒光基r PCRPCReal-time ），是指在 技術(shù)（PCR所謂定量 進(jìn)程，最后通過(guò)特定數(shù)學(xué)原理對(duì)未知團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR 1（圖模板進(jìn)行定量分析的方法 ）。 反應(yīng)原理 熒光定量1 圖 PCR 熒光基團(tuán) 值Ct 熒光檢測(cè)元件 2、熒光定量 PCR 與普通 PCR 的主要區(qū)別 常規(guī) PCR 中，PCR 產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳，然后進(jìn)行成像分析，常規(guī) PCR 只能通過(guò)終點(diǎn)法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，而不能進(jìn)行定量分析（圖 2）；熒光定量

5、 PCR 中，PCR 反應(yīng)體系中加入了熒光分子，通過(guò)熒光信號(hào)的變化來(lái)反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的變化，使 PCR 產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)成為可能。相對(duì)常規(guī) PCR 而言，熒光定量 PCR 的主要優(yōu)點(diǎn)使準(zhǔn)確地確定初始模版拷貝數(shù)和較高的檢測(cè)靈敏度；熒光定量 PCR 不僅可用于定性，如判斷一段序列的有無(wú)，也可用于定量，如確定起始模版的拷貝數(shù)； 圖 2 終點(diǎn)法定量 PCR 的缺陷 理論上 PCR 是一個(gè)指數(shù)增長(zhǎng)的過(guò)程，但是實(shí)際的 PCR 擴(kuò)增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是 S 形曲線。這是因?yàn)殡S著 PCR 循環(huán)的增多，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大，Taq 酶、dNTP、引物，甚至 DNA 模板等各種 PCR 要素逐漸不敷需求， PCR

6、 的效率越來(lái)越低，產(chǎn)物增長(zhǎng)的速度就逐漸減緩。當(dāng)所有的 Taq 酶都被飽和以后，PCR 就進(jìn)入了平臺(tái)期。由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用，不同的 PCR 反應(yīng)體系進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)機(jī)和平臺(tái)期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以， 即使是 96 次 PCR 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各種條件基本一致，所得結(jié)果有很大差異（圖 2）。 常規(guī) PCR 的定量方法，測(cè)定的都是 PCR 的終產(chǎn)物，而不是起始 DNA 拷貝數(shù)。由于 PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系（圖 2），所以不能根據(jù)最終 PCR 產(chǎn)物的量直接計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。雖然加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量

7、方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。 而從圖 2 也可以看出，雖然相同模版在同一臺(tái) PCR 儀上進(jìn)行 96 次擴(kuò)增， 終點(diǎn)處檢測(cè)產(chǎn)物量不恒定，但 96 次 PCR 擴(kuò)增曲線都有一個(gè)共同的拐點(diǎn)，即熒光定量 PCR 中 Ct 值的重現(xiàn)性，恒定的 Ct 值為熒光定量 PCR 的分析提供了理 論依據(jù)。 前面我們對(duì)熒光定量 PCR 的歷史、熒光定量 PCR 概念和與常規(guī) PCR 區(qū)別有了大致的了解，但你可能心中存在許多疑惑：什么是擴(kuò)增曲線？什么是 Ct 值？ 它們有什么特點(diǎn)？我們?nèi)绾蝸?lái)判定熒光定量 PCR 反應(yīng)中的 Ct 值，原理是什么？。 為了使大家更好的理解、掌握熒光定量 PCR 技術(shù)，在介紹熒

8、光定量 PCR 檢測(cè)方法、動(dòng)力學(xué)原理和數(shù)據(jù)分析方法前，有必要先介紹幾個(gè)最基本的概念。 3、熒光定量 PCR 的幾個(gè)基本概念 3.1 擴(kuò)增曲線 描PCR 原理，我將用樣品擴(kuò)增曲線來(lái)進(jìn)行說(shuō)明。為了更好的理解熒光定量 的擴(kuò)增曲線實(shí)際上并不是一條標(biāo)準(zhǔn)的PCR PCR 動(dòng)態(tài)進(jìn)程的曲線即擴(kuò)增曲線。述 軸，YPCR 循環(huán)數(shù)軸表示）。圖 3 中，X 3S 指數(shù)曲線，而是呈 型曲線（圖 ，與反應(yīng)管中擴(kuò)增產(chǎn)物的量有比例關(guān)系。表示擴(kuò)增反應(yīng)的熒光值 擴(kuò)增曲線示意圖熒光定量 PCR 圖 3 熒光閾值 擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒PCR 3 從圖 可以很直觀的看出，熒光定量 ，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段（對(duì)數(shù)期）和平臺(tái)期。在基

9、光背景信號(hào)階段（基線期）線期，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，我們無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在的終產(chǎn)物量與起始模板量之間平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。PCR 拷貝數(shù)。只有 DNA 產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始 沒(méi)有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR 產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR 我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。 3.2 熒光閾值 （圖 3），我們一般把熒光在介紹熒光閾值之前，先了解一下熒光本底信號(hào)，即樣本的熒光，基線期）15 個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline PCR 的前背景值和陰性對(duì)照的熒光值，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋。熒

10、光閾值在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任 是 倍15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 3 意位置上，熒光域值的缺省設(shè)置是 實(shí)驗(yàn)時(shí)，經(jīng)常采用手動(dòng)設(shè)置，手動(dòng)設(shè)PCR 。我們?cè)谧鰺晒舛?（機(jī)器自動(dòng)設(shè)置）置的原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn) ）。入指數(shù)期的最初階段，真正的信號(hào)是熒光信號(hào)超過(guò)域值（圖 4 4 手工調(diào)整熒光閾值示意圖圖 Ct 值3.3 ，threshold，t 代表Ct 了解了熒光閾值的概念后，值就很好理解了。C 代表Cycle擴(kuò)增過(guò)程中，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)PCR Ct 值就是在熒光 所謂 所示，黑

11、色的線顯示的是熒光閾值，當(dāng)信號(hào)超過(guò)黑3 圖 所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。如我們 Ct 值是可以變化的，色線時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為 Ct 值。從這也可以了解到 值來(lái)計(jì) Ct 實(shí)驗(yàn)時(shí)帶有一定的人為因素。而熒光定量PCR 后面的數(shù)據(jù)處理要用到儀的自 PCR 算，所以有關(guān)熒光閾值的設(shè)置就顯得尤為重要。一般說(shuō)來(lái)，新手按熒光值即達(dá) Ct 動(dòng)設(shè)置為好，而如果你非常有經(jīng)驗(yàn)，一般會(huì)手動(dòng)設(shè)置熒光閾值。因?yàn)槠鹗嫉綗晒忾撝邓?jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù)，所以它就與模版的拷貝數(shù)存在著線性關(guān)系， 值范CT Ct 值也就越小，反之亦然。正常的 拷貝數(shù)越多，經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù)就越少， 之間，過(guò)大和過(guò)小都將影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精度。圍在 18-30 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)

12、物雖然不恒定，但 次PCR 前面也提到過(guò)，同一模板經(jīng)過(guò) 96 值極具重現(xiàn)性。根據(jù)這個(gè)特點(diǎn)，我們可以利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct 值，就可以根Ct PCR 實(shí)驗(yàn)中得到未知樣品的 Ct 值做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要在同一次 據(jù)曲線算出該未知樣品的起始拷貝數(shù)。 Ct 值算出拷貝數(shù)的數(shù)學(xué)原理是怎樣的： 接下來(lái)我們就來(lái)看看通過(guò) PCR） 擴(kuò)增原理首先我們來(lái)回顧一下PCR（圖5，從原理圖中我們也可以很清 n 2次方增長(zhǎng)的方式擴(kuò)增，即：楚的知道理想的PCR反應(yīng)是以n 2X=X0反應(yīng)體系PCR 反應(yīng)體系是一個(gè)有限的體系，也就是我們加入到 但由于 PCR 的擴(kuò)PCR Buffer 等，只有在對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)，中的物質(zhì)

13、是有限的，例如酶、引物、擴(kuò) PCR 增效率才等于 1，大部分時(shí)候擴(kuò)增效率小于一，有時(shí)甚至等于零。因此 增的真正情況是：n (1+Ex)X=X0 次循環(huán)后的產(chǎn)物量 n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)；X：第 n 其中 ：擴(kuò)增效率X：初始模板量；Ex0 Ct個(gè)循環(huán)，此時(shí)的產(chǎn)物量為在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為 (1+Ex)Ct =M X=X0Ct, ：熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值線設(shè)定以后其中XCt 它是一個(gè)常數(shù)，我們?cè)O(shè)為M，我們對(duì)該方程式做簡(jiǎn)單對(duì)方程式兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得 logM=logX0 (1+Ex)Ct 的數(shù)學(xué)運(yùn)算后得到：= - log(1+Ex) *Ct+ log M log

14、 X0反應(yīng)中的某一個(gè)循環(huán)中PCR 為常數(shù)， M Ex 為常變數(shù)，也就是說(shuō) Ex 在 其中 是一個(gè)常數(shù)，但不同的循環(huán)數(shù)中，Ex 的數(shù)值會(huì)發(fā)生變化。因此從上式可以推出：值就可計(jì)Log 濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即 Ct 算出樣品中所含的模板量。 原理圖圖 5 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線3.4 在絕對(duì)定量中，未知樣本的量如基因拷貝數(shù)可通過(guò)梯度稀釋的已知量的標(biāo)準(zhǔn)品值推算出。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們可以將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋個(gè) Ct 的6 （5 實(shí)驗(yàn)中PCR ，將未知樣品和梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品在同一熒光稀釋梯度） 值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以推算出進(jìn)行反應(yīng)，將稀釋標(biāo)準(zhǔn)品得到的 Ct ）

15、。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作不需要人工操作，由儀器自動(dòng)完成。未知樣品的量（圖 6PCR ，如果理論上，一系列稀釋樣品的擴(kuò)增曲線之間有均勻的間距（圖 6 左） 反應(yīng)呈理想的方式擴(kuò)增，產(chǎn)物在每一循環(huán)都加倍，熒光曲線之間的間距則符合等2 nn 1010 值差。例如：倍稀釋的樣本，2，可式“ 稀釋倍數(shù)”，n為 2 樣本間Ct 。 3.32 ， Ct 得 n值差3.32 標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖 PCR 圖 6 熒光定量 3.5 擴(kuò)增效率 PCR 實(shí)驗(yàn)，在絕對(duì)定量中，我們將已知模板稀釋成一系列濃度梯度進(jìn)行熒光 ）或值做成標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用遞減的直線關(guān)系等式和相關(guān)系數(shù)（r利用拷貝數(shù)和 Ct 可信度來(lái)計(jì)算擴(kuò)增效率。 -1/斜率。10

16、 ） E 擴(kuò)增效率與標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率相關(guān)，計(jì)算方程為：擴(kuò)增效率（理論上，在每個(gè)指數(shù)擴(kuò)增循環(huán)中，PCR產(chǎn)物的量加倍，即PCR產(chǎn)物 2 倍增加，反-1/斜率，標(biāo)準(zhǔn)曲線得斜率就為-3.32，斜，就可得2 210應(yīng)效率為 2，擴(kuò)增效率就為 率得絕對(duì)值與熒光曲線間距相同。 如果將擴(kuò)增效率用百分率來(lái)表示，即：E%=(E-1)100%，對(duì)于理想的 PCR 反應(yīng)，E=2，即：擴(kuò)增效率 E%=(2-1)100%=100% 如果 E1.92，帶入方程(1.92-1)100%=92%，表示每個(gè)循環(huán)的終點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)增加 1.92 倍，或每次循環(huán)有 92的模板被擴(kuò)增。 一般說(shuō)來(lái)，擴(kuò)增效率接近 100是優(yōu)化的重復(fù)性

17、好實(shí)驗(yàn)的最好標(biāo)志，實(shí)際操作時(shí)，反應(yīng)的擴(kuò)增效率應(yīng)該在 90105之間，如果擴(kuò)增效率低，可能的原因是引物設(shè)計(jì)不當(dāng)，或者反應(yīng)條件未優(yōu)化；擴(kuò)增效率大于 100時(shí)，可能的原因是系列稀釋樣品加樣錯(cuò)誤，或者有非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，如引物二聚體產(chǎn)生。用上述方法確定擴(kuò)增效率時(shí)，反應(yīng)體系中的抑制劑的出現(xiàn)也可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率明顯增加，原因是高濃度模板樣本中抑制劑的濃度低，導(dǎo)致反應(yīng)的 Ct 值延遲出現(xiàn)，而低濃度模板樣本中抑制劑濃度高，反應(yīng)的 Ct 值延遲程度小，導(dǎo)致斜率的絕對(duì)值以及計(jì)算所得的擴(kuò)增效率會(huì)增加。如果擴(kuò)增效率小于 90或大于 105，建議重新設(shè)計(jì)引物或探針。 三、熒光定量 PCR 的方法 熒光定量 PCR 所使用

18、的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。而熒光定量 PCR 的方法相應(yīng)的可分為特異類和非特異類兩類，特異性檢測(cè)方法是在PCR 反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來(lái)檢測(cè)產(chǎn)物；而非特異性檢測(cè)方法是在在 PCR 反應(yīng)體系中，加入過(guò)量熒光染料，熒光染料特異性地?fù)饺?DNA 雙鏈后，發(fā)射出熒光信號(hào)。前者由于增加了探針的識(shí)別步驟，特異性更高，但后者則簡(jiǎn)便易行。 熒光定量 PCR 最常用的方法是 DNA 結(jié)合染料 SYBR Green的非特異性方 法和 Taqman 水解探針的特異性方法，在這里主要介紹這 2 種方法，其它方法請(qǐng) 參考其它熒光定量 PCR 資料。 1、非特異性 SYBR Gree

19、n I 染料 法 SYBR Green I 是一種結(jié)合于所有dsDNA 雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料（圖 7），在游離狀態(tài)下，SYBR Green I 發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈 DNA 結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)（圖 8）。因此，SYBR Green I 的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈 DNA 的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數(shù)量。SYBR Green I 的最大吸收波長(zhǎng)約為 497nm，發(fā)射波長(zhǎng)最大約為 520nm。 圖 8 SYBR Green I 作用機(jī)理示意圖 SYBR Green I 的優(yōu)點(diǎn)： 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，僅需要設(shè)計(jì)上下游一對(duì)引物，不需要設(shè)計(jì)探針，

20、無(wú)需設(shè)計(jì)多個(gè)探針即可快速檢驗(yàn)多個(gè)基因，通用性好；成本低；能夠通過(guò)溶解曲線分析檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。因而在低通量實(shí)驗(yàn)和單重實(shí)驗(yàn)時(shí)一般優(yōu)先考慮使用 SYBR Green I 染料法。 SYBR Green I 的缺點(diǎn)：由于 SYBR Green I 與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合， 因此由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽(yáng)性會(huì)影響定量的精確性，SYBR Green I 方法對(duì) PCR 擴(kuò)增特異性要求較高。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)熔解曲線來(lái)分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量結(jié)果。另外， 因?yàn)?SYBR Green I 不能區(qū)分不同擴(kuò)增子發(fā)出的熒光而導(dǎo)致它不能用于多

21、重反 應(yīng)。 溶解曲線分析可以用來(lái)確定不同的反應(yīng)產(chǎn)物，包括非特異性產(chǎn)物。擴(kuò)增反應(yīng) 完成后，通過(guò)逐漸增加溫度同時(shí)監(jiān)測(cè)每一步的熒光信號(hào)來(lái)產(chǎn)生溶解曲線，隨著反應(yīng) 變性，熒光染料又回復(fù)到游離狀態(tài)導(dǎo)致熒光信號(hào)降低，用熒光信號(hào) DNA 中雙鏈 改變的負(fù)的一次導(dǎo)數(shù)與溫度作圖，在擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度上有一特征峰（Tm， ，用這個(gè)特征峰就可以將特異產(chǎn)物與其它產(chǎn)物如引的溫度）DNA 雙鏈解鏈 50 。 9）（圖物二聚體區(qū)分開，因?yàn)樗鼈冊(cè)诓煌臏囟热芙?9 SYBR Green I 擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線分析圖 Taqman 水解探針?lè)?、特異性 熒光探針為Taqman 熒光探針為基礎(chǔ)，Taqman Taqman 熒光定量技

22、術(shù)是以 一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光發(fā)射基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí)，外切3 擴(kuò)增時(shí)，Taq 酶的 5PCR 發(fā)射基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)實(shí)現(xiàn) 系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條 DNA 鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，產(chǎn)物形成完全同步。從而實(shí)現(xiàn)定量。當(dāng)探針與靶序了熒光信號(hào)的累積與 PCR 端的淬滅基團(tuán)接近而被淬滅。在進(jìn)行延 3列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，5伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的 。隨著擴(kuò)增產(chǎn)物10） 發(fā)出熒光。一分子產(chǎn)物生成伴隨一分子熒光信號(hào)產(chǎn)生（圖 的增加，熒

23、光增強(qiáng)。PCR 擴(kuò)增程序通常將復(fù)性與延伸合二為一。常用的 熒光基團(tuán)是 FAM, TET, VIC, HEX。 圖 10 Taqman 探針工作原理 由于 Taqman 探針?lè)ㄖ?，除引物外，還使用了一條特異的探針，因此此方法可以特異的檢測(cè)目標(biāo)序列，防止非特異產(chǎn)物的干擾影響定量的準(zhǔn)確性，同時(shí)它也可以用于多重反應(yīng)，但探針設(shè)計(jì)成本較高，有時(shí)探針設(shè)計(jì)困難。 第二章 實(shí)踐篇 ）測(cè)定未知樣品的絕對(duì)我們?cè)谠O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候通常對(duì)下列事情更感興趣：1）未知量：如給定的血樣中的病毒顆粒數(shù)，食品中某一種轉(zhuǎn)基因成分的含量；2樣品與已知樣品相比，基因的表達(dá)量改變了多少倍：如相當(dāng)量的腫瘤組織和正常改變了多少倍。分析這兩種假設(shè)

24、的方法就分別叫絕對(duì)定量和組織相比，p53mRNA 相對(duì)定量。值和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較實(shí)現(xiàn)的。分析的結(jié)果是給 Ct 絕對(duì)定量是通過(guò)樣品的 ）中核酸的量（拷貝數(shù)、微RNA 定數(shù)量的樣品中（給定數(shù)量的細(xì)胞，每微克總 克）。 B ）中 ）和對(duì)照組（樣品A 相對(duì)定量的分析結(jié)果是在相當(dāng)量的試驗(yàn)組（樣品 一個(gè)靶基因的相對(duì)比率（倍數(shù)差異）。接下來(lái)我們就來(lái)看看我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中如何來(lái)使用絕對(duì)定量和相對(duì)定量的 分析方法。 一、絕對(duì)定量分析 1、絕對(duì)定量分析方法的使用條件在這里我將舉例來(lái)說(shuō)明我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中，何種實(shí)驗(yàn)需要用絕對(duì)定量來(lái)進(jìn)行的精確拷貝數(shù)感興趣。首HBV DNA 分析。醫(yī)生對(duì)一個(gè)乙肝病人的每毫升血液中 病HBV

25、 PCR 實(shí)驗(yàn)來(lái)確定 先醫(yī)生要從病人血液中提取 DNA，然后通過(guò)熒光定量對(duì)照樣HBV Ct 值和設(shè)置梯度稀釋的已知 DNA 的 copy 數(shù)。通過(guò)病人樣品的 毒數(shù)。的 copy 病毒品的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，醫(yī)生就能確定病人血液中 HBV DNA 從這個(gè)例子，我們也可以看出，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，如果最終的結(jié)果是對(duì)未知樣品的定、引量描述，并不依賴別的樣品的性質(zhì)的時(shí)候，就應(yīng)該使用絕對(duì)定量進(jìn)行分析。 2 物和探針的設(shè)計(jì)探針?lè)ㄒ瑫r(shí)考慮探針和引物的質(zhì)量。首先要尋找合適的探針使用 Taqman 位置，再設(shè)計(jì)引物，并使引物盡可能靠近探針。 引物設(shè)計(jì)原則2.1引物引物的設(shè)計(jì)大家應(yīng)該非常清楚了，在這里就不再贅述，但熒光

26、定量 PCR PCR 引物設(shè)計(jì)有所差別和要求。的設(shè)計(jì)還是與普通 探針設(shè)計(jì)原則2.2 范圍內(nèi)； ?探針位置盡可能地靠近上游引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在 50150bp ?探針長(zhǎng)度通常在 2030bp，Tm 值在 ? ， 高510，通常比引物6570 Tm ? GC含量在 40%70%。 ? 探針的 5端應(yīng)避免使用堿基 ? G。 ? 3 個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列。探針內(nèi)部或探針與 2 條引物之間避免 G ?的含量。整條探針中，堿基 C 的含量要明顯高于 中核實(shí)一次，如果發(fā)現(xiàn) blast ? 為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計(jì)好的序列在 有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計(jì)引物探針。 、標(biāo)準(zhǔn)品的制作：3 標(biāo)準(zhǔn)品制作流

27、程3.1 重組質(zhì)粒篩選 目的基因擴(kuò)增PCR 目的基因克隆 提取、質(zhì)粒DNADNA 計(jì)算質(zhì)粒梯度稀釋 重組質(zhì)粒鑒定 拷貝數(shù) 制作標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的計(jì)算 3.2稀釋倍數(shù)ng/ul）OD40待測(cè)樣本濃度（260324 樣本分子量=堿基數(shù)14 106待測(cè)樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測(cè)樣本濃度/樣本分子量 標(biāo)準(zhǔn)品的梯度稀釋：3.3ii 1v 原液(標(biāo)準(zhǔn)品 i) +9v 稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii 1v 標(biāo)準(zhǔn)品 ii+9v 稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品 iv iii +9v 稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品1v 標(biāo)準(zhǔn)品 v 稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品1v iv +9v ，這樣有助于保證標(biāo)準(zhǔn)品1ul，體積最好加大

28、，如 10ul1v注意：稀釋的時(shí)候，體積不要只加 . 10 倍梯度稀釋是均一的 PCR 4、熒光定量 模板的制備 請(qǐng)查閱提取、逆轉(zhuǎn)錄的相關(guān)資料。 DNA/RNA 體系準(zhǔn)備 5、熒光定量PCR PCR 條件摸索：反應(yīng)，驗(yàn)證引物是否合適、模板是否降解、模板純度是否PCR 不加探針的常規(guī)，所合適。同時(shí)確定最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。由于當(dāng)前大部分實(shí)驗(yàn)為使用mix 以只用摸索模板、引物條件即可。如果是首次實(shí)驗(yàn)，那么應(yīng)選擇一系列稀釋濃度的模板來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件模板濃度： 摸索，以選擇出最合適的模板濃度，條件困難時(shí)，也至少要選擇兩個(gè)稀釋度（高 或中、低濃度）來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。一般而言，Ct 值在 1530 范圍內(nèi)比較合

29、適，若大于 30 則應(yīng)加大模板使用量，如果 Ct 小于 15 則應(yīng)對(duì)模板進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 引物的濃度：引物的濃度是一個(gè)影響 PCR 反應(yīng)的關(guān)鍵因素，若濃度太低，會(huì)致使反應(yīng)不完全，若引物太多，則發(fā)生錯(cuò)配以及產(chǎn)生非特異的產(chǎn)物的可能性會(huì)大大增加。對(duì)于大多數(shù) PCR 反應(yīng)，可在 0.11.0uM 之間進(jìn)行選擇，直至得到滿意的結(jié)果。 探針濃度：初次實(shí)驗(yàn)每個(gè)探針用 0.2uM，如果信號(hào)強(qiáng)度達(dá)不到要求，可以適當(dāng)增加至 0.4uM 34、10、5 510HBV將已知濃度的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品做系列濃度稀釋，分別含有 56 copies /ml，建立 20ul10反應(yīng)體系（參照優(yōu)化體系），3 次重復(fù)（熒510、5光

30、PCR一般進(jìn)行 3 次以上重復(fù)，有的甚至達(dá)到了 6 次以上重復(fù)）。 以某病人的血液提取的 HBV 病毒 DNA 為模板，建立 20ul 熒光定量 PCR 反 應(yīng)體系（參照優(yōu)化體系），每個(gè)樣品 3 次重復(fù)，同時(shí)設(shè)置不加模板的陰性對(duì)照。 6、熒光定量 PCR 體系配制及儀器程序設(shè)置 請(qǐng)參照各公司熒光定量PCR 試劑、熒光定量 PCR 儀器說(shuō)明書進(jìn)行。 7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)處理 PCR 反應(yīng)結(jié)束后，得到如下數(shù)據(jù)： copies/ml Ct1 Ct2 Ct3 Mean Ct STD 0.13 27.61 5103 27.84 27.58 27.67667 24.55 24.25 0.08 5104 24

31、.40667 24.42 21.16 0.06 21.04 5105 21.11 21.10333 18.21 0.08 18.06 106 518.05 18.10667 None BLANK None None 23.25 0.05 23.46 sample 23.39 23.36667 注：平行樣的 Ct 值之間的差0.5 時(shí)表示重復(fù)性較好 直接從熒光 PCR 儀上就可以得到標(biāo)準(zhǔn)曲線： 29 y = -3.2013x + 30.827 27 2R = 0.9995 25 23 值 tC21 19 17 15 5103 51045106 5105拷貝數(shù)2 sloper理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)劣有

32、兩個(gè)指標(biāo)，相關(guān)系數(shù)（）和斜率（）。相關(guān) 系數(shù)反映標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線性，理想值應(yīng)大于 0.98，越接近 1 說(shuō)明直線性越好， 定量越準(zhǔn)確。斜率反映PCR擴(kuò)增效率（E），理想的PCR擴(kuò)增效率在 90105之間，如果PCR擴(kuò)增效率低，必須重新設(shè)計(jì)引物或探針；如果擴(kuò)增效率高于理想值， 可能是系列稀釋樣品加樣錯(cuò)誤，或者非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，或反應(yīng)體系中可能存在著對(duì)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或PCR反應(yīng)阻害的物質(zhì)，需要相應(yīng)的解決辦法。 20.9995，大于 0.98，標(biāo)準(zhǔn)差都在 0.2 范圍內(nèi)， 從標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出： r-1/-3.2013=2.04，擴(kuò)增效率（2.041）100%=104%，表示定量準(zhǔn)確，可而E=10將未知樣品

33、的Ct值帶入方程： 23.36667= -3.2013 X + 30.827 可得 X2.33 44/2) 2.335.82510(510所以copies 但我們需要注意的是，標(biāo)準(zhǔn)曲線只可能用于推算稀釋梯度范圍內(nèi)的未知樣本的量，而不能外推稀釋梯度外的未知樣本的含量。所以，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中盡可能使未知樣品的濃度在標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋范圍內(nèi)。 二、相對(duì)定量分析 1、相對(duì)定量分析方法的使用條件 同絕對(duì)定量分析類似，我將舉例來(lái)說(shuō)明我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中何種實(shí)驗(yàn)需要用相對(duì)定量來(lái)進(jìn)行分析。我們?nèi)绻胫澜?jīng)過(guò)藥物處理過(guò)的組織和未處理的組織中某一目的基因的表達(dá)水平是否有差異，相差多少倍？我們可以選擇以下 2 種方式： 1)

34、我們可以從等量的 2 種組織中提取 RNA，分別進(jìn)行目的基因的反轉(zhuǎn)錄特異性熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn)來(lái)確定目的基因在 2 種組織中的表達(dá)量，結(jié)果可以反映等量的 2 種組織中目的基因表達(dá)量的比率。 2）如果我們之前已經(jīng)確定 2 種組織中看家基因如 GAPDH 的表達(dá)量相等，那么， 我們就可以從大約等量（不需要等量）的2 種組織中分別提取RNA，通過(guò)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)來(lái)確定 2 種組織中目的基因和看見(jiàn)基因的表達(dá)水平。藥物處理組織的目的基 因的表達(dá)量可由 2 種組織中看家基因和未處理組織中目的基因的表達(dá)量共同來(lái)確定。 2 種分析方法的差異就在于用的標(biāo)準(zhǔn)有所不同，方法 1）中的標(biāo)準(zhǔn)是 2 種組織的量相等；

35、方法 2）中的標(biāo)準(zhǔn)是 2 種組織中看家基因如 GAPDH 的表達(dá)量恒定不變； 2、相對(duì)定量數(shù)據(jù)處理方法： 對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)需求，我們可以采用不同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析， -Ct、用參照基因的Ct法和2一般常用的方法有雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法、Ct、Pfaffi 法，應(yīng)用每種方法都有適應(yīng)條件。 如為檢測(cè) A 基因在某因子干預(yù)下的表達(dá)，我們得到一組數(shù)據(jù)見(jiàn)下表： E） 參照基因擴(kuò)增效率（ 參照基因（Ct 值） 待測(cè)基因擴(kuò)增效率（E待測(cè)基因（Ct 值） D C A B 干預(yù)前 干預(yù)后D F E C 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求我們可以選擇相應(yīng)的方法，如下表：數(shù)據(jù)處理方法 參考條件 計(jì)算方法 -Ct-(E-A) =2表達(dá)水平2

36、 擴(kuò)增效率為 100% Ct 法，僅需目標(biāo)基因即可Ct-2表達(dá)水平，且相 目的基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近 100 Ct -2-(E-F)-(A-B) 2對(duì)偏差不超過(guò) 5，需要目標(biāo)基因和參照基因。 -Ct (F-B)-(E-A) 2同 2表達(dá)水平參照基因的Ct 目標(biāo)基因和參照基因擴(kuò)增效率不同，但目標(biāo)基因間(F-B) (A-E)/D表達(dá)水平C 的擴(kuò)增效率相同，需目標(biāo)基因和參照基因，以及擴(kuò)Pfaffi 法 增效率。Ct-分析方法，下面就以此分析方法而目前相對(duì)定量普遍采用操作簡(jiǎn)便的 2 為例進(jìn)行分析，應(yīng)用SYBR Green方法對(duì)不同樣本間X基因表達(dá)分析的詳細(xì)說(shuō)明和舉例。 3、引物的設(shè)計(jì) 在這里不再

37、贅述，但需要提醒大家再設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度時(shí)，最好在 100 200bp 范圍內(nèi)，在這范圍內(nèi)，擴(kuò)增片段越短，有效擴(kuò)增反應(yīng)越容易實(shí)現(xiàn)，同時(shí)較短的擴(kuò)增片段也可保證分析的一致性。 4、模板的制備 請(qǐng)查閱 DNA/RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄的相關(guān)資料。 5、PCR 體系準(zhǔn)備 PCR 條件摸索： 同絕對(duì)定量分析條件摸索，只是值得注意的是由于 SYBR 染料法對(duì)引物要求要比探針?lè)ǜ?，在熒光定量?shí)驗(yàn)前，我們可通過(guò)普通 PCR 實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)引物質(zhì)量。 以 RTPCR 獲得的 cDNA 為模板，建立 20ul 熒光定量 PCR 反應(yīng)體系，每個(gè)樣品 6 次重復(fù)（藥物處理和未處理），對(duì) X 基因和 GAPDH 基因進(jìn)行擴(kuò)增，同

38、時(shí)設(shè)置不加模板的陰性對(duì)照。 6、熒光定量 PCR 體系配制及儀器程序設(shè)置 請(qǐng)參照各公司熒光定量 PCR 試劑、熒光定量 PCR 儀器說(shuō)明書進(jìn)行。7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)處理 7.1 溶解曲線繪制與分析 SYBR Green 染料沒(méi)有序列特異性，可以結(jié)合到包括非特異產(chǎn)物和引物二聚體在內(nèi)的任何 dsDNA 上，因此有必要區(qū)分目標(biāo)信號(hào)和假信號(hào)。內(nèi)嵌染料可以在反應(yīng)末尾對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解，稱為溶解曲線分析。在溶解曲線分析過(guò)程中，隨 著溫度從低于產(chǎn)物溶解點(diǎn)緩慢升到高于產(chǎn)物溶解點(diǎn)，實(shí)時(shí)儀器連續(xù)監(jiān)測(cè)每個(gè)樣品含量的不同，擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)在不同的溫度點(diǎn)解鏈。的熒光值?；诋a(chǎn)物長(zhǎng)度和 G/C 隨著產(chǎn)物的解鏈，可以看到熒光值的降

39、低并被儀器所測(cè)量。對(duì)溶解曲線進(jìn)行微分可 以計(jì)算出溶解峰。溶解峰反映了反應(yīng)中擴(kuò)增到的產(chǎn)物。這些峰與凝膠電泳中條帶類似。1 95，每升高 PCR 完成后進(jìn)行，從 60升至熔解曲線的設(shè)置是在整個(gè) 值下降儀器會(huì)自動(dòng)收集熒光信號(hào)，得到的熔解曲線是逐漸下降的過(guò)程，且在 Tm 這最快，為方便分析，我們將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)，即得到單峰的熔解曲線， 樣我們就可以證明引物的特異性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受非特異性擴(kuò)增和引物二聚 體的干擾。 X GAPDH 數(shù)據(jù)處理7.2 Ct -2Ct Ct 值 樣品X Mean Ct 基因GAPDH 基因 Mean Ct 值 未處理6.18 20.34 26.52 樣品 藥物處4

40、.35 4.06 -2.12 20.12 24.18 理樣品None None BLANK 下面我們來(lái)看看上面表格中差異倍數(shù)是如何得來(lái)的： 首先，分別求出 6 個(gè)重復(fù)樣品 X 基因和 GAPDH 基因平均 Ct 值后，應(yīng)用參照基因 GAPDH 對(duì)未處理樣品和藥物處理樣品進(jìn)行校正： CtX基因 Mean Ct值GAPDH基因 Mean Ct值26.52 （未處理樣品）20.346.18 X基因 Mean Ct值 GAPDH基因 Mean Ct值24.18 Ct ）（藥物處理樣品20.124.06 然后，對(duì)未處理樣品和藥物處理樣品的Ct 進(jìn)行歸一化： -2 6.18 Ct 4.06 Ct Ct .

41、12 （藥物處理樣品）（未處理樣品）基因的X Ct 最后，我們就可以根據(jù)算出藥物處理樣品與未處理樣品間 表達(dá)差異： 2.12)-Ct(4.3522 X 基因的表達(dá)水平是未處理樣品的 4.35 此藥物處理樣本的倍。 因 此結(jié)果是通過(guò)參照基因表達(dá)水平校正的待測(cè)樣本中的目標(biāo)基因相對(duì)于校準(zhǔn)樣本，用參照基因校準(zhǔn)目標(biāo)基因表達(dá)的目的是彌補(bǔ)樣本組織量的差異。 為了更直觀的表示樣品間的表達(dá)差異，最后我們可以將計(jì)算得到的相對(duì)量用圖表來(lái)表示，如下圖： 54.5 4 3.5 量3 達(dá)表2.5 對(duì)2 相1.5 1 0.5 0 藥物處理樣品 未處理樣品 樣品名稱Ct-法的修正：2 如果目標(biāo)基因可參照基因有相同的擴(kuò)增效率，

42、但擴(kuò)增效率不等于 2，那么， -Ct法的公式可以修正為用實(shí)際擴(kuò)增效率值代替等式中的 22。例如，如果目標(biāo)-Ct 。1.98 ，計(jì)算公式可以修正為1.98 基因和參照基因的擴(kuò)增效率都為 第三章 常見(jiàn)問(wèn)題與解答篇 一、無(wú) Ct 值（信號(hào)）出現(xiàn) 1、反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在 35 個(gè)循環(huán)以上，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況增加循環(huán)，但 高于 45 個(gè)循環(huán)會(huì)增加過(guò)多的背景信號(hào)； 2、檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤：一般采用 72延伸時(shí)采集熒光，Taqman 方法則一般在退火結(jié)束或延伸結(jié)束采集信號(hào)； 3、引物或探針降解：可通過(guò) PAGE 電泳檢測(cè)其完整性； 4、探針設(shè)計(jì)不佳：設(shè)計(jì)探針溫度低于引物，造成探針未雜交上而產(chǎn)物已延伸； 5、模板量少：對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣品的最高濃度做起； 6、模板降解：避免樣