醫(yī)學微生物學實驗

1、醫(yī)學微生物學實驗,醫(yī)學微生物學實驗,醫(yī)學微生物學實驗課是一門操作技能很強的課程。 實驗課教學的主要目標是使學生了解醫(yī)學微生物學主要的研究方法和手段，掌握基本技能和基本原理，樹立牢固的無菌觀念。 更重要的是培養(yǎng)學生自學能力、科學思維能力、動手能力和表達能力,微生物學實驗室規(guī)則,進入實驗室必須穿白大衣、戴帽子。 書本、文具放在抽屜里。 實驗室內(nèi)不準吃東西、喝飲料，不準把任何東西放入嘴中，也不要用手撫摸頭臉等部位。 凡是廢棄的細菌培養(yǎng)物、帶菌材料，應放在指定地點等待滅菌處理，不得隨便亂放或用水沖洗。 一旦發(fā)生意外，造成污染，應立即報告老師進行處理。 離開實驗室前，必須洗手。懷疑污染應及時用1新潔而滅

2、泡手。 每次實驗后，實驗臺用消毒液擦拭，地板先用濕的拖把拖地以后再掃地，實驗室用紫外線燈照射1小時,實驗分組,倆倆相對4人為一組,組號編在電源插座上。 每組按從前到后,從左到右的順序，分別編號為甲、乙、丙、丁,甲 乙 4 丙 丁,甲 乙 3 丙 丁,甲 乙 2 丙 丁,甲 乙 1 丙 丁,甲 乙 5 丙 丁,甲 乙 8 丙 丁,甲 乙 7 丙 丁,甲 乙 6 丙 丁,甲 乙 10 丙 丁,甲 乙 9 丙 丁,講 臺,實驗室器材 整齊有序,常用器材擺放順序： 電源插座試管架酒精燈污物盤。 試管架上器材： 按接種針、接種環(huán)、油性筆和打火機的順序，分別放置在試管架中間兩行，靠近電源插座一側(cè)。 器材使

3、用以后，必須放回原處，依次擺整齊,普通冰箱(3顆星*) 冷藏室(上柜）： 溫度48，保存培養(yǎng)基、細菌培養(yǎng)物、常用菌種和抗菌素紙片等。 冷凍室（下柜）： 溫度18，保存診斷血清、血漿，長期保藏的菌種和抗菌素紙片,衛(wèi)生工具： 掃帚，拖把，撮箕，垃圾筐，放置在冰箱和水池之間,隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：3537， 一般細菌培養(yǎng)時間為1824小時,奧林巴斯 CX21型 生物顯微鏡 （實驗柜內(nèi)，每人一臺,注意：只能橫放，不得豎放,1500W電爐安全警告 培養(yǎng)基沸騰溢出流入電爐： 觸電危及生命！ 短路斷電,蒸餾水：配制培養(yǎng)基。 1新潔而滅：懷疑病原菌污染，泡手35分鐘。 消毒液：擦拭實驗臺臺面。 玻片缸：浸泡用

4、過的載玻片,醫(yī)學微生物學實驗綜合性實驗一,膿汁和糞便標本中病原菌的檢測（P2） 培養(yǎng)基的制備P2 消毒與滅菌P5 細菌的人工培養(yǎng) 無菌技術(shù)（錄像） 擺斜面，傾注平板,常見病原性球菌的檢查程序P47： 直接涂片、革蘭染色、鏡檢 膿汁、痰、咽部分泌物 觀察菌落性狀、溶血性、色素 血瓊脂平板培養(yǎng) 涂片染色鏡檢 挑取可疑菌落 生化反應 純培養(yǎng) 動物實驗 藥敏實驗 血液、穿刺液 肉湯增菌培養(yǎng) 培養(yǎng)液涂片染色境檢 常見腸道致病菌的檢查程序P48： 糞便 SS瓊脂、伊紅美藍平板培養(yǎng) 挑取可疑菌落 血清學鑒定 血、骨髓 增菌培養(yǎng) 雙糖鐵培養(yǎng)基 染色鏡檢 生化反應,從培養(yǎng)基的制備，細菌的分離、純化、形態(tài)學檢查，

5、到細菌的生化試驗、血清學試驗和藥敏試驗，全都由同學們親自動手操作和完成。 綜合性實驗是一個連續(xù)的過程，一個步驟，一個環(huán)節(jié)的失誤，將直接影響到最終實驗結(jié)果。 實驗時應嚴格按要求操作，實驗結(jié)果要及時觀察，及時記錄，以便撰寫實驗論文,培養(yǎng)基的制備,公共培基，勿作標記,1500W電爐安全警告 培養(yǎng)基沸騰溢出流入電爐： 觸電危及生命！ 短路斷電,分裝,包裝,量筒,錐形瓶,砝碼,干粉培養(yǎng)基,試管筐,天平,邊臺柜子內(nèi)器材,錐形瓶用后洗凈、包扎。 器材用后放回原處，依次擺整齊,邊臺抽屜內(nèi)器材： 試管（棉塞），刻度吸管，洗耳球，稱量紙，藥勺，硫酸紙、牛皮紙、橡皮筋,尺子。 藥勺、吸管用后洗凈、甩干，放回原處,稱

6、量紙置于左盤，游碼移至標尺左端“0”點位置上，指針應對準中線，取得平衡。否則將杠桿兩端的調(diào)整螺母旋動調(diào)節(jié)平衡,秤物時“左物右碼”，物品在左盤上，砝碼在右盤，盡可能放在秤盤中心。天平保持干燥、清潔,培養(yǎng)基制備,培養(yǎng)基制備程序： 干粉培養(yǎng)基蒸餾水加熱溶化分裝集中放在試管筐里，然后罩上硫酸紙，牛皮紙，用橡皮筋扎好 放入講臺邊的高壓滅菌桶或高壓滅菌筐內(nèi)送到高壓滅菌室（洗刷室）。 請在 30分鐘內(nèi)完成,培養(yǎng)基,培養(yǎng)基是用人工的方法，將多種營養(yǎng)物質(zhì)，根據(jù)各種微生物生長繁殖的需要而合成的一種營養(yǎng)制品。它的主要成分是蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉和水，pH7.47.6。 培養(yǎng)基制備的一般程序： 調(diào)配溶化 矯正pH 分

7、裝滅菌檢定保存。 干粉培養(yǎng)基蒸餾水加熱溶化分裝滅菌檢定 保存。 培養(yǎng)基的制備原則： (1)適當?shù)臓I養(yǎng)成分,(2)合適的酸堿度,(3)配制后必須滅菌,培養(yǎng)基的種類（按物理性狀分類） 液體培養(yǎng)基:不含凝固劑（瓊脂），用于增菌，純培養(yǎng),保種。 固體培養(yǎng)基:含12瓊脂，用于分離培養(yǎng),純培養(yǎng),保種。 半固體培基:含0.30.5瓊脂，用于動力檢測,保種,液體培養(yǎng)基 固體斜面培養(yǎng)基 半固體高層培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的種類（按用途分類）P3 基礎培養(yǎng)基:含一般細菌生長繁殖所需的基本營養(yǎng)成分，可作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎成分，如普通平板。 營養(yǎng)培養(yǎng)基：在基礎培養(yǎng)基中加入血液、生長因子等特殊成分，供營養(yǎng)要求較高的細菌和須要

8、特殊生長因子的細菌生長，如血平板。 增菌培養(yǎng)基：促進目的菌的生長，適用于含菌量較少的標本，如葡萄糖肉湯。 選擇培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入抑制劑抑制雜菌生長，有助于目的菌的生長，如EMB、SS平板。 鑒別培養(yǎng)基：利用細菌分解能力及代謝產(chǎn)物的不同，在培養(yǎng)基中加入特定的作用底物和指示劑，用來試驗細菌的生化反應、代謝產(chǎn)物，如糖發(fā)酵管。 厭氧培養(yǎng)基：氧化還原電勢低，表面用凡士林、石蠟封住，與空氣隔絕，成為無氧環(huán)境，如庖肉培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的滅菌,在冷空氣完全排盡的情況下，蒸汽壓103.43 kPa ,溫度可達到121.3 ,維持15-30分鐘，可以殺滅包括細菌芽胞在內(nèi)的所有微生物。 基礎培養(yǎng)基：121高壓蒸汽滅

9、菌1530分鐘。 含糖培養(yǎng)基：115滅菌15分鐘。 雞蛋、牛奶培養(yǎng)基:75100間歇滅菌3次(1天1次)。 不耐高溫的液體成分：濾菌器濾過除菌（EK型蔡氏濾器、 G5或G6玻璃濾器、0.45um或0.22um微孔濾膜,培養(yǎng)基滅菌以后，冷卻5060（溫度越高，冷凝水越多，越易污染 ），以無菌操作，傾注平皿10ml（直徑7厘米平皿），瓊脂凝固后形成瓊脂平板。 平板主要用于細菌的分離培養(yǎng)和藥敏試驗,平板儲存待用或做細菌培養(yǎng)時，為什么要倒置？ 防止平板水分蒸發(fā)丟失。 防止冷凝水滴于平板表面，影響單菌落形成。,培養(yǎng)基滅菌以后，趁熱斜放，培基不超過試管長度的2/3，瓊脂凝固以后形成一個傾斜的表面。 斜面主

10、要用于純菌移種和菌種保存。 斜面底部的冷凝水有利于純菌移種、菌苔形成和菌種保藏,怎樣檢查培養(yǎng)基是否合格,無菌試驗：將待檢培養(yǎng)基置于35培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，無任何細菌生長為合格。 效果試驗：將已知的標準參考菌株，接種于待檢培養(yǎng)基中，檢查細菌的生長繁殖狀況和生化反應是否與預期的結(jié)果相符合,臥式圓形壓力蒸汽滅菌器,YXQ.WY21D,滅菌器主要由滅菌室、管道系統(tǒng)、電器系統(tǒng)和蒸汽發(fā)生器構(gòu)成。 蒸汽發(fā)生器電壓380伏，功率12千瓦。滅菌室結(jié)構(gòu)采用雙層單門不銹鋼制造，兩層之間為夾層。 鍋爐的蒸汽通過管道直接進入夾層，儲存高溫飽和蒸汽，預熱滅菌室。經(jīng)電磁閥控制進入滅菌室。 滅菌室的冷空氣通過冷凝閥以冷凝水的

11、形式排出,滅菌器的設置,安全閥：當蒸汽壓力超過最高允許使用壓力時能自動跳起，釋放超壓蒸汽，確保安全使用。 壓力表：滅菌室和蒸汽套層各裝有壓力表一只，能指示各層內(nèi)的蒸汽工作壓力。 溫度表：能隨時顯示滅菌室內(nèi)最低滅菌溫度，有利操作。 冷凝水泄出器：能將滅菌室內(nèi)的冷空氣和冷凝水在滅菌過程中予以排出，確保滅菌效果。 安全聯(lián)鎖裝置：滅菌室壓力降到零，蜂鳴器聲響，提示可以安全開門,高壓蒸汽滅菌器的操作程序,冷空氣的排除：滅菌室壓力升至0.07MPa時，關進汽閥，開排汽閥，使壓力降到零 ，排汽一次。然后關排汽閥，開進汽閥，重復以上操作。如此反復三次，方可排凈冷空氣。冷空氣的排除是滅菌成功和失敗的關鍵。 物品

12、的滅菌：一般維持1530分鐘。 排除蒸汽。 滅菌物品的干燥（根據(jù)需要,熱蒸汽比冷空氣大概輕一倍，浮在上層，把冷空氣擠壓到底部，經(jīng)排氣管道排出,高壓蒸汽滅菌器,冷氣出口,蒸汽入口,熱氣流,冷氣流,常用蒸汽壓力與相應溫度,壓力(磅/吋） 壓力（Kpa） 相對溫度() 8 55.16 112.6 10 68.95 115.2 15 103.43 121.3 20 137.90 126.2 1標準大氣壓=76厘米汞柱高=1.013105帕斯卡=14.696磅/英寸2。 采用2000個大氣壓也不能殺死細菌，真正起殺菌作用是高溫,滅菌所需時間、壓力與溫度指標,滅菌物品類 滅菌時間(分) 蒸汽壓力Mpa 相

13、對溫度 含糖培養(yǎng)基： 15 0.07 115 基礎培養(yǎng)基： 1530 0.11 121 橡 膠 類 15 0.11 121 敷 料 類 3045 0.110.14 121126 器 皿 類 15 0.110.14 121126 器 械 類 10 0.110.14 121126 瓶裝溶液類 2040 0.110.14 121126,細菌生長繁殖的方式和速度,細菌繁殖方式：以二分裂方式進行無性繁殖。 繁殖速度：多數(shù)2030分鐘繁殖1代，結(jié)核桿菌1820小時繁殖一代。 細菌生長繁殖曲線,細菌的生長曲線,細菌數(shù)目的對數(shù),培養(yǎng)時間 （小時,5 10 15 20 25 30,活菌數(shù),總菌數(shù),遲緩期,對數(shù)生

14、長期,穩(wěn)定期,衰退期,細菌生長曲線意義,遲緩期：一般14h，細菌代謝活躍，但不繁殖。 對數(shù)期：維持4 8h，細菌快速繁殖，數(shù)目呈幾何級數(shù)增加，細菌形態(tài)、染色性、生理活性最典型、對抗生素最敏感。細菌鑒定選用此期為佳。 穩(wěn)定期： 通常維持10h，活菌數(shù)和死菌數(shù)幾乎相等，代謝產(chǎn)物形成較多。 衰亡期：培養(yǎng)18 24 h以后，代謝逐漸停滯,死菌數(shù)超過活菌數(shù),常用玻璃器材的處理程序（示教,新購置的玻璃器材：12鹽酸浸泡過夜中和游離堿 流水沖洗15次晾干包裝滅菌 。 無污染器皿:洗滌劑洗刷。 病原菌污染的器材（消毒、滅菌后再處理）： 試管、吸管和平皿：高壓蒸汽滅菌趁熱倒出污物洗滌劑浸泡瓶子、試管、吸管用毛刷

15、，平皿用紗布洗刷干凈。 吸管：3來蘇兒浸泡過夜。 載玻片：3來蘇兒浸泡過夜 肥皂水煮沸10min,玻璃器材洗干凈的標準,1.洗滌時觀察:洗后的玻璃器材附著在內(nèi)壁上的水不是個別水珠,而是一層極薄的水膜。 2.干燥后觀察:對著光亮處觀看玻璃器材,非常透明, 內(nèi)外壁上不出現(xiàn)大片發(fā)白或白點,也無微小污點和粉末,思考題,人工培養(yǎng)細菌需要提供的條件是什么? 培養(yǎng)基制備的原則是什么? 怎樣檢查培養(yǎng)基是否合格? 培養(yǎng)基按物理形狀分哪幾種?各有何用途? 高壓蒸汽滅菌法、紫外線、碘酒的殺菌機理各是什么,醫(yī)學微生物學實驗綜合性實驗一,膿汁和糞便標本中病原菌的檢測（一） 培養(yǎng)基的制備P2 消毒與滅菌P5 細菌的人工培養(yǎng) 無菌技術(shù)（錄像） 擺斜面，傾注平板,量筒,錐形瓶,砝碼,干粉培養(yǎng)基,試管筐,天平,邊臺柜子內(nèi)器材,錐形瓶用后洗凈、包扎。 器材用后放回原處，依次擺整齊,邊臺抽屜內(nèi)器材： 試管（棉塞），刻度吸管，洗耳球，稱量紙，藥勺，硫酸紙、牛皮紙、橡皮筋,厘米尺。 藥勺、吸管用后洗凈、甩干，放回