DNA序列測定技術樣本

1、資料內容僅供您學習參考，如有不當或者侵權，請聯(lián)系改正或者刪除。DNA序列測定技術序列測定的技術和策略Sanger 雙脫氧鏈終止法MaxamGilbert DNA化學降解法測序策略當前應用的兩種快速序列測定技術是Sanger 等 ( 1977)m和 Gilbert(1977)提出的化學降解法。雖然其原理大相徑庭提出的酶法及 Maxa,但這兩種方法都是同樣生成互相獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸 , 每組寡核苷酸都有固定的起點 , 但卻隨機終止于特定的一種或者多種殘基上。 由于 DNA上的每一個堿基出現(xiàn)在可變終止端的機會均等,因些上述每一組產物都是一些寡核苷酸混合物 , 這些寡核苷酸的長度由某一

2、種特定堿基在原 DNA全片段上的位置所決定。 然后在能夠區(qū)分長度僅差一個核苷酸的不同 DNA分子的條件下 , 對各組寡核苷酸進行電泳分析 , 只要把幾組寡核苷酸加樣于測序凝膠中若干個相鄰的泳道這上 ,即可從凝膠的放射自影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。一 Sanger 雙脫氧鏈終止法Sanger 法 DNA測序的試劑引物模板DNA聚合酶放射性標記的 dNTPdNTP類似物現(xiàn)行的邏終止法人加減法序列測定技術( Sacger和 Coulson, 1975)發(fā)展而來的。加減法首次引入了使用特異引物在DNA聚合酶作用下進行延伸反應、資料內容僅供您學習參考，如有不當或者侵權，請聯(lián)系改正或者刪除。堿基特

3、異性的鏈終止 , 以及采用聚丙烯酰胺凝膠區(qū)分長度差一個核苷酸的單鏈DAN等 3 種方法。盡管有了這些進展 , 但加減法依然太不精確 , 也太不得法 , 因此難以廣為接受。 直至引入雙氧核苷三磷酸 ( ddTBP) 作為鏈終止劑 ( Sanger 等 , 1977 ) , 酶法 DNA序列測定技術才得到廣泛應用。 2, 3ddNTP 與普通 dNTP不同之處在同它們在脫氧核糖的 3 位置缺少一個羥基。 它們能夠在 DNA聚合酶作用下經過其 5 三磷酸基團摻入到正在增長的 DNA鏈中 , 但由于沒有 3 羥基 , 它們不能同后續(xù)的 dNTP形成磷酸二酯鏈 , 因此 , 正在增長的 DNA鏈不可能繼

4、續(xù)延伸。這樣 , 在 DNA合成反應混合物的 4 種普通 dNTP中加入少量的一種 ddNTP后 , 鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止展開競爭 , 反應產物是一系列的核苷酸鏈 , 其長度取決于從用以起始 DNA合成的引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止的位置之間的距離。 在 4 組獨立的酶反應中分別采用 4 種不同的 ddNTP, 結果將產生 4 組寡核苷酸 ,它們將分別終止于模板鏈的每一個A、每一個 G或每一個 T的位置上。Sanger 法 DNA測序的試劑引物酶促測序反應中利用一個與模板鏈特定序列互補的合成寡核苷酸作為 DNA 合成的引物。在許多情況下 , 可將靶 DNA片段克隆于 M13噬菌體

5、或噬菌粒載體 , 以取得單鏈 DNA分子作為模板。 但也能夠采用 Sanger 法商定變性雙鏈 DNA模板的序列。在以上兩種情況下 , 都能夠采用能與位于靶 DNA側翼的載體序列相退火的通用引物 , 而不必取得與未知 DNA序列互補的引物。適于 M13噬菌體重組克隆的通用測序引物一般長 15-29 個核苷酸 , 并可與緊靠 M13mp18噬菌體多克隆位點區(qū)的 Hind位點成 M13mp19噬菌體多克隆位點區(qū)的 EcoRI 位點的序列互補。這些引物同樣也可用于對克隆于 pUC質粒的 DNA進行”雙鏈”測序 , 并可從許多資料內容僅供您學習參考，如有不當或者侵權，請聯(lián)系改正或者刪除。廠商中購置得到

6、。另外 , 還有若干家公司出售一些引物 , 這些引物下為了對經過多種限制酶切位點克隆于不同質粒的靶 DNA進行測序而設計的。模板如上所述 , 有兩類 DNA能夠用作 Sanger 法測序的模板 : 純單鏈 DNA和經過熱變性或堿變性的雙鏈 DNA。采用一般從重組 M13噬菌體顆粒中分離得到的單鏈DNA應中獲得數百個核苷酸的序列。 如用變性雙鏈 DNA用模板 , 則較難獲得這咱質量的結果。盡管采用雙鏈 DNA模板的方法顯然既簡單又方便 ( Chen 和 Seebur g, 1985) , 然而只是在不久前得到改進以后 , 這一方法才發(fā)展到能夠獲得明確可信結果的水平。 其中有兩個因素是至關重要的

7、, 這就是模板 DNA的質量和所用 DNA聚合酶的種類。小量制箅的質粒 DNA常常被寡脫氧核糖核苷酸小分子、核糖苷酸及 DNA聚合酶的抑制劑所污染 , 其中前兩種污染物可被用作隨機引物。結果 , 種種”鬼”帶、 強終止現(xiàn)象 , 以及其它假象往往使測序凝膠含混不清、黯然失色。因此采用小量制備的質粒 NDA來測定未知 DNA克隆片段的序列 , 并不可取。然而 , 這類 DNA?？勺鳛閷σ呀浗涍^另一方法測定的序列進行進一步的合適模板。采用 CsCl溴化乙錠梯度平衡離心法來純化質粒 DNA, 測序的結果會好得多 , 但卻要耗費大量的人務和物力。 模板鏈的每一個 A、 每一個 G或每一個 T 的位置上。

8、 DNA聚合酶一般見于雙脫氧法序列測定的有幾種不同的酶,其中包括大腸桿菌DNA聚合酶 I 的 Klenow 片段 ( Sanger 等 , 1977) ,和 Prfeffer, 1987)經過修飾消除了 3 5反轉錄酶 ( 見文獻 , 如外節(jié)酶活性的 T7噬菌體Mieredorf DNA聚合酶( Sequenase)和測序酶 2.0) , Tabor和 Richardson, 1978惟及從嗜熱水生菌( Thermus aquaticus) 分離的耐熱 DNA聚合物 ( Taq DNA 聚合酶 ) 。這些酶的特性差別懸殊 , 因而可大大影響經過鏈終止反應所獲得的 DNA序列的數量的質資料內容僅

9、供您學習參考，如有不當或者侵權，請聯(lián)系改正或者刪除。量。( 1)大腸桿菌 DNA聚合酶 IKlenow 片段 這種酶是最初用以建立Sanger 法的酶 ,也是至今依然廣泛用于 DNA序列測定的酶。 一般碰到的兩個問題是 : 1) Koen ow片段的持續(xù)合成能力低 , 以致一些片段并非由于 dd NTP的摻入 , 而是因為聚合酸人模板上隨機解離而終止合成,因而導致背景增高。 由于該酶不能沿模板進行長中距離移動 ,因此利用該酶進行的標準測序反應所得序列的長度有限。一般 ,這一反應只能得到大約 250-350 個核苷酸的序列。 如果分兩步進行反應 , 所得序列的數目能夠翻一番 ; 其中第一步是初始

10、標記步驟 , 采用低濃度的 dNTP, 而隨后的第二步是鏈延伸鏈終止反應 , 含有 ddNTP和高濃度的 dNTP( Johoston-Dow等, 1987;Stambaugh和 Blakesley, 1988)。然而即使有了這些改進,用Klenow酶所測序列的長度一般還是不如持續(xù)合成能力較強的測序酶。2) 這種酶對模板中的同聚核苷酸段或其它含牢固二級結構的區(qū)域進行復制的效能很低。將聚合反應的溫度提高到55,能夠緩解但并不能徹底解決這一問題( Gomer 和 Firtel, 1985)。有時可采用一些dNTP類似物 如 dITP 或 7脫氮 dGTP( 7 deaza-dGTP) 來獲取模板中

11、可形成穩(wěn)定二級結構的相應區(qū)段的序列信息,但 Kleow酶對這些類似物的作用不如測序酶有效,這可能是因為它們使Klenow 酶原已較低的持續(xù)合成能力進一步降低。 總而言這 , 能夠選用大腸桿菌 DNA聚合酶 IKl enow片段測定從引物 5 位置起 250 個堿基以內的一段 DNA序列 , 但不宜用它來測定更長一段 DNA序列或者具有二重對稱和 ( 或) 同聚核苷酸段的 DNA序列。 ( 2) 反轉錄酶 盡管日常測序工作并不廣泛使用反轉錄酶 , 但有時用這個酶解決一些由于模板 DNA中存在 A/T 或 G/C 同聚核苷酸區(qū)而引起的問題。 來自禽類和鼠類反轉錄病毒的反轉錄酶在這一看來要比Klen

12、ow 酶略勝一籌 ( Karanthaansis, 1982;Graham等,1986 ) ,盡管它們可能還是比測序酶遜色( Cameron-Mills,1988;Revak 等 1988) 。( 3) 測序酶 : 測序酶 ( SequenaseTM) 是一種經過化學修飾的 T7 噬菌體 DNA聚合酶。這酶原來具有很強的 3 5 外切核酸活性 , 經過修飾后 , 這一活性大部分均被消除。 測序酶 2.0 版是測序酶的基因工程產品 , 它完全缺失了 3 5 外資料內容僅供您學習參考，如有不當或者侵權，請聯(lián)系改正或者刪除。切核酸酶活性,極其穩(wěn)定而經活性要比經化學修飾的測序酶高2 倍。測序酶持續(xù)合成

13、能力很強,聚合速率很高,對諸如dITP和 7脫氮 dGTP等用于提高分子辨率使測序凝膠某些區(qū)段上的壓縮條帶得以分開的核苷酸類似物具有廣泛的耐受性。它是測定長段DNA序列的首選酶。測序酶能夠沿模板移動很長的距離,因而一套反應常常就能夠測定數百個核苷酸的DNA序列。實際上 ,測得序列的長度更多是受聚丙烯酰胺凝膠的分辨能力而不是受該聚合酶的特性所制約。為了充分利用測序酶極高的持續(xù)合成能力,可采用兩步測序反應。 第一步首先采用低濃度的 dNTP的較低溫度 ,以便將合成反應限制在適度之下并確保放射性標記dNTP 和較低溫度,以便將合成反應限制在適度之下并確保放射性標記dNTP的有效摻入 ,這步反應的產物

14、是僅僅延伸了20-30堿基的引物。再將第一步反應等分于 4 組 1 套的標準反應系統(tǒng)中,每組反應中都含有高濃度的d NTP和一種ddNTP。這樣聚合反應就得以繼續(xù),直至造成鏈終止的核革酸摻入正在增長的鏈中。( 4) Taq DNA 聚合酶 Taq DNA 聚合酶適用于測定在 37 形成大段穩(wěn)定十級結構的單鏈 DNA模板序列。這是因為 Taq DNA聚合酶在 70- 75活性最高 , 這一溫度下即使 GC豐富的模板也無法形成二級結構。 按照 1nnis 等( 1988) 介紹的方法使用 Taq DNA聚合酶進行測序 , 在放射自顯影片上得到的測序梯連續(xù)數百個堿基條帶始終清晰如一 ,表明這種酶的持續(xù)合成能力甚佳。模板鏈的每一個A、每一個 G或每一個 T 的位置上。模板鏈的每一個 A、