基因工程的基本工具和基本操作程序【谷風課資】

1、基因工程的基本工具和基本操作程序 考點一 基因工程的概念理解和理論基礎 1.基因工程的概念理解 (1)操作環(huán)境：體外關鍵步驟“表達載體的構 建”的環(huán)境。,1,課資參照,(2)優(yōu)點 與雜交育種相比：克服遠緣雜交不親和障礙。 與誘變育種相比：定向改造生物性狀。 (3)操作水平：分子水平。 (4)原理:基因重組。 (5)本質:甲(供體提供目的基因) 乙(受體表達 目的基因),即基因未變、合成蛋白質未變,只是合 成場所的轉移。,2,課資參照,2.基因工程的基本原理和理論基礎概括如下圖 提醒 若題目強調(diào)“目的基因”的表達過程,則只 包括“轉錄和翻譯”兩個過程,不包括目的基因的 復制。,3,課資參照,對位

2、訓練 1. 目的基因導入受體細胞后，是否可以穩(wěn)定維持和 表達其遺傳特性,只有通過鑒定與檢測才能知道。 下列屬于目的基因檢測和鑒定的是 ( ) 檢測受體細胞中是否有目的基因 檢測受體 細胞中是否有致病基因 檢測目的基因是否轉 錄出了mRNA 檢測目的基因是否翻譯成蛋白質 A.B. C.D.,C,4,課資參照,2.科學家通過基因工程的方法，能使大腸桿菌產(chǎn)生 人的胰島素。以下敘述錯誤的是（ ） A.可用含抗生素的培養(yǎng)基檢測大腸桿菌中是否導入 了重組質粒 B.導入大腸桿菌的目的基因不一定能成功表達 C.DNA連接酶和限制性核酸內(nèi)切酶都是構建重組 質粒必需的工具酶 D.目的基因的檢測與鑒定表達過程中沒有

3、發(fā)生堿 基互補配對,D,5,課資參照,考點二 基因工程的操作工具 1.限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術刀” (1)來源:主要是從原核生物中分離純化出來的。 (2)化學本質：蛋白質。 (3)作用 (4)作用特點：特異性,即限制酶可識別特定的脫 氧核苷酸序列,切割特定位點。 (5)切割方式,催化作用,所以可重復利用,可用于DNA的切割獲取目的基因和載體的切割,錯位切：產(chǎn)生兩個相同的黏性末端,平切：形成平末端,6,課資參照,提醒 切割的化學鍵為磷酸二酯鍵。 在切割目的基因和載體時要求用同一種限制酶, 目的是產(chǎn)生相同的黏性末端。 將一個基因從DNA分子上切割下來,需要2個限制 酶,同時產(chǎn)生4個黏性末端。 不

4、同DNA分子用同一種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末 端都相同,同一個DNA分子用不同的限制酶產(chǎn)生的 黏性末端不相同。,7,課資參照,2.DNA連接酶“分子縫合針”,8,課資參照,拓展提升 DNA連接酶與DNA聚合酶的比較,9,課資參照,3.基因進入受體細胞的載體“分子運輸車” (1)類型 提醒 質粒本質是DNA,不是細胞器;特點:小 型環(huán)狀。 (2)功能：將目的基因導入受體細胞。 (3)應具備條件 能在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復制； 有一個至多個限制酶的切割位點,以便于與外源 基因連接； 有特殊的遺傳標記基因,供重組DNA的檢測和鑒定。,最常用載體:質粒,其他載體:噬菌體的衍生物、動植物病毒等,10,

5、課資參照,提醒 一般來說,天然載體往往不能滿足人類的 所有要求,因此人們根據(jù)不同的目的和需要,對某 些天然的載體進行人工改造。 常見的標記基因有抗生素基因、產(chǎn)生特定顏色 的表達產(chǎn)物基因、發(fā)光基因等。 作為載體必須具有多個限制酶切點,而且每種酶 的切點最好只有一個。因為某種限制酶只能識別 單一切點,若載體上有一個以上的酶切點,則切割 重組后可能丟失某些片段,若丟失的片段含復制起 點區(qū),則進入受體細胞后便不能自主復制。一個載,11,課資參照,體若只有某種限制酶的一個切點,則酶切后既能把 環(huán)打開接納外源DNA片段,又不會丟失自己的片段。 注意與細胞膜上載體的區(qū)別,兩者的化學本質和 作用都不相同。 質

6、粒能自我復制,既可在自身細胞、受體細胞也 可在體外復制。,12,課資參照,對位訓練 3.下列關于DNA連接酶作用的敘述，正確的是 （ ） A.將單個核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸 二酯鍵 B.將斷開的兩個DNA片段的骨架連接起來，重新 形成磷酸二酯鍵 C.連接兩條DNA鏈上堿基之間的氫鍵 D.只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間連接 起來，而不能將雙鏈DNA片段平末端之間進行 連接,B,13,課資參照,考點三 基因工程的基本操作程序 1.基因工程圖解:抗蟲棉的培育過程,14,課資參照,2.基本操作程序 (1)目的基因的獲取 從基因文庫(基因組文庫或cDNA文庫)中獲取,15,課資參照,

7、人工合成目的基因:常用的方法有化學合成法和 反轉錄法。 化學合成法:蛋白質 氨基酸序列 RNA 堿基序列 DNA堿基序列 用4種脫氧核 苷酸人工合成目的基因 反轉錄法:分離出供體細胞mRNA 單鏈DNA 合成目的基因,16,課資參照,PCR擴增技術與DNA復制的比較,17,課資參照,(2)基因表達載體的構建最核心步驟 基因表達載體的組成:啟動子、目的基因、終止 子以及標記基因等。,18,課資參照,提醒 與載體相比較,增加啟動子、目的基因和 終止子三個基因片段,其功能各不相同。 啟動子(DNA片段)起始密碼子(RNA);終止子 (DNA片段)終止密碼子(RNA)。 基因表達載體的構建方法 提醒

8、該過程把三種工具(只有兩種工具酶)全用 上了,是最核心、最關鍵的一步,在體外進行。,19,課資參照,(3)將目的基因導入受體細胞,20,課資參照,提醒 唯一不涉及到堿基互補配對的操作步驟。 微生物做受體細胞主要是個體微小,代謝旺盛, 繁殖速度快,獲得目的基因產(chǎn)物多。 植物細胞還可用基因槍法和花粉管通道法。 (4)目的基因的檢測和表達,21,課資參照,對位訓練 4.下列有關基因工程技術的敘述,正確的是（ ） A.重組DNA技術所用的工具酶是限制酶、連接酶 和載體 B.所有的限制酶都只能識別同一種特定的核苷酸 序列 C.選用細菌作為重組質粒的受體細胞是因為細菌 繁殖快 D.只要目的基因進入受體細胞

9、就能實現(xiàn)表達,C,22,課資參照,5.利用外源基因在受體細胞中表達，可生產(chǎn)人類所 需要的產(chǎn)品。下列選項中能說明目的基因完成了 在受體細胞中表達的是（ ） A棉花二倍體細胞中檢測到細菌的抗蟲基因 B大腸桿菌中檢測到人胰島素基因及其mRNA C山羊乳腺細胞中檢測到人生長激素DNA序列 D酵母菌細胞中提取到人干擾素蛋白,D,23,課資參照,解題思路探究 思維誤區(qū)警示 易錯分析 基因工程中易錯點辨析不清 (1)基因工程中有3種工具,但工具酶只有2種。 (2)工具酶本質為蛋白質,載體本質為小型DNA分子,但不一定是環(huán)狀。 (3)標記基因的作用篩選、檢測目的基因是否導入受體細胞,常見的有抗生素抗性基因、發(fā)

10、光基 因,表達產(chǎn)物為帶顏色物質等。,24,課資參照,(4)受體細胞中常用植物受精卵或體細胞(經(jīng)組織培養(yǎng))、動物受精卵(一般不用體細胞)、微生物大腸桿菌、酵母菌等,但要合成糖蛋白、有生物活性的胰島素則必需用真核生物酵母菌需內(nèi)質網(wǎng)、高爾基體的加工、分泌。一般不用支原體,原因是它營寄生生活;一定不能用哺乳動物成熟紅細胞,原因是它無細胞核,不能合成蛋白質。,25,課資參照,糾正訓練 1.(2009浙江卷,3)下列關于基因工程的敘述,錯誤 的是 ( ) A.目的基因和受體細胞均可來自動、植物或微生物 B.限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶是兩類常用的工 具酶 C.人胰島素原基因在大腸桿菌中表達的胰島素原 無

11、生物活性 D.載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細胞 和促進目的基因的表達,26,課資參照,解析 基因工程中目的基因和受體細胞均可來自 動、植物或微生物;常用的工具酶是限制性核酸內(nèi) 切酶和DNA連接酶;人胰島素原基因在大腸桿菌中 表達的胰島素原無生物活性,只有經(jīng)過一定的物質 激活以后,才有生物活性。載體上的抗性基因主要 是有利于篩選含重組DNA的細胞,不能促進目的基 因的表達。所以D錯誤。,答案 D,27,課資參照,2.(2009重慶卷,2)下表有關基因表達的選項中,不 可能的是 ( ),28,課資參照,解析 細菌抗蟲蛋白基因可通過轉基因技術轉入 棉花體內(nèi),在棉花的葉肉細胞中表達產(chǎn)生細菌

12、抗蟲 蛋白,使棉花具有抗蟲能力;人酪氨酸酶基因可在 正常人的皮膚細胞中表達產(chǎn)生酪氨酸酶,酪氨酸酶 催化酪氨酸轉化為黑色素;動物胰島素基因可通過 轉基因技術轉移到大腸桿菌體內(nèi),在大腸桿菌工程 菌細胞中合成動物胰島素;兔屬于哺乳動物,其成 熟的紅細胞中沒有細胞核,所以不可能表達出血紅 蛋白。 答案 D,29,課資參照,3.(2009安徽卷,4)2008年諾貝爾化學獎授予了 “發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了水母綠色熒光蛋白”的三位科學 家。如果將綠色熒光蛋白基因的片段與目的基因 連接起來組成一個融合基因,再將該融合基因轉入 真核生物細胞內(nèi),表達出的蛋白質就會帶有綠色熒 光。綠色熒光蛋白在該研究中的主要作用是( ) A

13、.追蹤目的基因在細胞內(nèi)的復制過程 B.追蹤目的基因插入到染色體上的位置 C.追蹤目的基因編碼的蛋白質在細胞內(nèi)的分布 D.追蹤目的基因編碼的蛋白質的空間結構,30,課資參照,解析 將綠色熒光蛋白基因的片段與目的基因連 接起來組成一個融合基因,將該融合基因轉入真核 生物細胞內(nèi),表達出的蛋白質帶有綠色熒光,從而 可以追蹤目的基因編碼的蛋白質在細胞內(nèi)的分 布。故C正確。 答案 C,31,課資參照,知識綜合應用 重點提示 通過“抗蟲作物培育過程的有關基因工程知識”的考查,提升“綜合運用所學知識解決自然界和社會生活中有關生物學問題”的能力。 典例分析 (2009江蘇卷,34)蘇云金桿菌(Bt)能產(chǎn)生具有殺

14、 蟲能力的毒素蛋白。下圖是轉Bt毒素蛋白基因植 物的培育過程示意圖(ampr為抗氨芐青霉素基因), 據(jù)圖回答下列問題。,32,課資參照,33,課資參照,(1)將圖中的DNA用Hind、BamH完全酶切后, 反應管中有 種DNA片段。 (2)圖中表示Hind與BamH酶切、DNA連接酶 連接的過程,此過程可獲得 種重組質粒; 如果換用Bst與BamH酶切,目的基因與質粒連 接后可獲得 種重組質粒。 (3)目的基因插入質粒后,不能影響質粒的 。 (4)圖中的Ti質粒調(diào)控合成的vir蛋白,可以協(xié)助 帶有目的基因的T-DNA導入植物細胞,并防止植物 細胞中 對T-DNA的降解。,34,課資參照,(5)

15、已知轉基因植物中毒素蛋白只結合某些昆蟲腸 上皮細胞表面的特異受體,使細胞膜穿孔,腸細胞 裂解,昆蟲死亡。而該毒素蛋白對人類的風險相對 較小,原因是人類腸上皮細胞 。 (6)生產(chǎn)上常將上述轉基因作物與非轉基因作物混 合播種,其目的是降低害蟲種群中的 基 因頻率的增長速率。,35,課資參照,解析 本題重點考查轉基因技術的相關知識,需特 別注意基因工程的步驟、DNA的復制、基因工程的 操作工具等知識。本題需特別注意圖示過程,從中 獲取有效信息,然后結合課本知識即可正確解答。 答案 (1)4 (2)2 1 (3)復制 (4)DNA水解酶 (5)表面無相應的特異性受體 (6)抗性,36,課資參照,定時檢

16、測 組題說明 特別推薦 綜合應用題1、3；知識拓展提升 題2、6、8。,37,課資參照,1.(2009福建理綜,32)轉基因抗病香蕉的培育過程 如圖所示。質粒上有Pst、Sma、EcoR、Apa 等四種限制酶切割位點。請回答: (1)構建含抗病基因的表達載體A時,應選用限制酶 ,對 進行切割。 (2)培養(yǎng)基中的卡那霉素會抑制香蕉愈傷組織細胞 的生長,欲利用該培養(yǎng)基篩選已導入抗病基因的香 蕉細胞,應使基因表達載體A中含有 , 作為標記基因。,38,課資參照,(3)香蕉組織細胞具有 ,因此, 可以利用組織培養(yǎng)技術將導入抗病基因的香蕉組 織細胞培育成植株。圖中、依次表示組織培 養(yǎng)過程中香蕉組織細胞的

17、 。 解析 本題考查基因工程的有關知識。(1)從圖可 看出,只有Pst、EcoR兩種酶能保持抗病基因結 構的完整性,所以構建含抗病基因的表達載體A時, 應選用限制酶Pst、EcoR兩種酶,對抗病基因的 DNA和質粒進行切割。 (2)卡那霉素能抑制香蕉愈傷組織細胞的生長,欲 利用該培養(yǎng)基篩選已導入抗病基因的香蕉細胞,應,39,課資參照,使基因表達載體A中含有抗卡那霉素基因,以此作 為標記基因。 (3)香蕉組織細胞具有全能性,因此,可以利用組織 培養(yǎng)技術將導入抗病基因的香蕉組織細胞培育成 植株。圖中、依次表示組織培養(yǎng)過程中香蕉 組織細胞的脫分化和再分化。 答案 (1)Pst、EcoR 含抗病基因的

18、DNA、 質粒 (2)抗卡那霉素基因 (3)全能性 脫分化、再分化,40,課資參照,2.(2008江蘇卷,32)將動物致病菌的抗原基因導入 馬鈴薯制成植物疫苗,飼喂轉基因馬鈴薯可使動物 獲得免疫力。以下是與植物疫苗制備過程相關的 圖和表。,41,課資參照,表1 引物對序列表,42,課資參照,請根據(jù)以上圖表回答下列問題: (1)在采用常規(guī)PCR方法擴增目的基因的過程中,使 用的DNA聚合酶不同于一般生物體內(nèi)的DNA聚合酶, 其最主要的特點是 。 (2)PCR過程中退火(復性)溫度必須根據(jù)引物的堿 基數(shù)量和種類來設定。表1為根據(jù)模板設計的兩對 引物序列,圖2為引物對與模板結合示意圖。請判 斷哪一對

19、引物可采用較高的退火溫度？ 。,43,課資參照,(3)圖1步驟所用的DNA連接酶對所連接的DNA兩 端的堿基序列是否有專一性要求？ 。 (4)為將外源基因轉入馬鈴薯，圖1步驟轉基因 所用的細菌B通常為 。 (5)對符合設計要求的重組質粒T進行酶切。假設 所用的酶均可將識別位點完全切開，請根據(jù)圖1中 標示的酶切位點和表2所列的識別序列，對以下酶 切結果作出判斷。 采用EcoR I和Pst I酶切,得到 種DNA片斷。 采用EcoR I和Sma I酶切,得到 種DNA片斷。,44,課資參照,解析 (1)PCR技術中需通過高溫使DNA解旋,故所 用DNA聚合酶的耐熱性必須要好。(2)退火溫度與 時間

20、,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還 有靶基因序列的長度。含有(G+C)多的引物,可采 用相對較高的退火溫度。(3)DNA聚合酶與限制酶 不同,從將DNA由5端點開始復制到3端的酶,不具 有特異性。(4)農(nóng)桿菌的細胞中有一段T-DNA,農(nóng)桿 菌通過侵染植物傷口進入細胞后,可將T-DNA插入 到植物基因中,因此,農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺 傳轉化體系,常用作植物轉基因工程中的載體。,45,課資參照,(5)對于重組質粒,EcoRI能切開M和X連接處,PstI能 在M和N之間專一切點處切開,將DNA分為兩個片段; EcoRI仍能切開M處,SmaI則不能識別N和Y重新結合 形成的連接點,只能得到1個

21、DNA片段。 答案 (1)耐高溫 (2)引物對B (3)否 (4)農(nóng)桿菌 (5)2 1,46,課資參照,3.基因工程中,需使用的限制酶切割目的基因和質粒, 便于重組和篩選。已知限制酶的識別序列和切 點是GGATCC,限制酶的識別序列和切點 是GATC。,47,課資參照,(1)根據(jù)已知條件和圖回答： 上述質粒用限制酶 切割,目的基因 用限制酶 切割。 將切下的目的基因片段插入質粒的切口處,還要 加入適量的 。 請指出質粒上至少要有一個標記基因的理由： 。 (2)不同生物的基因可以拼接的結構基礎是 。 (3)大腸桿菌是首先成功表達外源基因的宿主菌, 但不能表達結構復雜的蛋白質,哺乳類細胞、昆蟲,4

22、8,課資參照,細胞表達系統(tǒng)雖然能表達結構復雜的哺乳類細胞 蛋白,但操作復雜,表達水平低,不易推廣使用。基 因工程中常選用酵母菌作為受體細胞,請從細胞結 構等方面分析用酵母菌作受體細胞能克服上述不 足的理由： 。 答案 (1) DNA連接酶 檢測重組質 粒(或目的基因)是否導入受體細胞 (2)DNA結構 基本相同(其他合理答案均可) (3)單細胞真核 生物,含有加工、修飾蛋白質的內(nèi)質網(wǎng)和高爾基體; 繁殖速度快,能很快得到大量的目的基因;培養(yǎng) 成本低;容易培養(yǎng),49,課資參照,4.在培育轉基因植物的研究中,卡那霉素抗性基因 (kanr)常作為標記基因,只有含卡那霉素抗性基因 的細胞才能在卡那霉素培

23、養(yǎng)基上生長。下圖為獲 得抗蟲棉的技術流程。,50,課資參照,請據(jù)圖回答： (1)A過程需要的酶有 。 (2)B過程及其結果體現(xiàn)了質粒作為載體必須具備 的兩個條件是 。 (3)C過程的培養(yǎng)基除含有必要營養(yǎng)物質、瓊脂和 激素外,還必須加入 。 (4)如果利用DNA分子雜交原理對再生植株進行檢 測,D過程應該用 作為探針。 (5)科學家發(fā)現(xiàn)轉基因植株的卡那霉素抗性基因的 傳遞符合孟德爾遺傳規(guī)律。,51,課資參照,將轉基因植株與 雜交, 其后代中抗卡那霉素型與卡那霉素敏感型的數(shù)量 比為11。 若該轉基因植株自交,則其后代中抗卡那霉素型 與卡那霉素敏感型的數(shù)量比為 。 若將該轉基因植株的花藥在卡那霉素培

24、養(yǎng)基上 作離體培養(yǎng),則獲得的再生植株群體中抗卡那霉素 型植株占 %。 解析 重組質粒的獲得需要限制酶和DNA連接酶; 作為載體必須具備以下幾個條件：一是能夠在宿 主細胞中復制并穩(wěn)定保存;二是具有多個限制酶切,52,課資參照,點,以便與外源基因連接;三是具有某些標記基因, 便于進行篩選等。B過程體現(xiàn)出了其中的一、三兩 條。轉基因植株與非轉基因植株雜交后,后代表現(xiàn) 型比例為11,說明轉基因植株為雜合子,該雜交 過程相當于測交;如果自交,則后代比例應為31; 卡那霉素對花粉進行了選擇,保留下了抗卡那霉素 的植株。 答案 (1)限制酶和DNA連接酶 (2)具有標記基因; 能在宿主細胞中復制并穩(wěn)定保存

25、(3)卡那霉素 (4)放射性同位素(或熒光分子)標記的抗蟲基因 (5)非轉基因植株 31 100,53,課資參照,5.如圖為利用生物技術獲得生物新品種的過程,據(jù)圖 回答： (1)在基因工程中,AB為 技術,利用 的原理是 ,其中為 過程。 (2)加熱至94的目的是使DNA中的 鍵 斷裂,這一過程在細胞內(nèi)是通過 的 作用來完成的。,54,課資參照,(3)當溫度降低時,引物與模板末端結合,在DNA聚 合酶的作用下,引物沿模板鏈延伸,最終合成兩條 DNA分子,此過程中的原料是 , 遵循的原則是 。 (4)目的基因導入綿羊受體細胞常用 技術。 (5)BD為抗蟲棉的培育過程,其中過程常用的 方法是 ,

26、要確定目的基因(抗蟲基因)導入受體細胞后是否 能穩(wěn)定遺傳并表達,需進行檢測和鑒定工作,請寫 出在個體生物學水平上的鑒定過程： 。,55,課資參照,解析 (1)AB為體外DNA復制即PCR技術,與體內(nèi) DNA復制原理相同,解旋方式不同,PCR技術是用高 溫變性使其解旋。 (2)94時DNA雙鏈解旋,破壞的是兩條鏈之間的氫 鍵,而在細胞內(nèi)DNA復制解旋時解旋酶起相同作用。(3)PCR技術與DNA復制過程原理是相同的,即堿基 互補配對,原料均為4種脫氧核苷酸。 (4)轉基因動物培育中目的基因的導入常用顯微注 射技術。 (5)將目的基因導入植物細胞常用的方法為農(nóng)桿菌,56,課資參照,轉化法,其優(yōu)點是能

27、將外源基因導入到受體細胞的 染色體DNA分子上;在個體水平上鑒定,即通過生物 體所體現(xiàn)的性狀來判斷,抗蟲棉應具有的性狀為害 蟲吞食后使其死亡。 答案 (1)PCR DNA復制 DNA解旋 (2)氫 解旋酶 (3)4種脫氧核苷酸 堿基互補配對原則 (4)顯微注射 (5)農(nóng)桿菌轉化法 讓害蟲吞食轉基因棉花的葉子, 觀察害蟲的存活情況,以確定性狀,57,課資參照,6.下圖a表示基因工程中經(jīng)常選用的載體pBR322 質粒,Ampr表示氨芐青霉素抗性基因,Tetr表示四環(huán) 素抗性基因。目的基因如果插入某抗性基因中,將 使該基因失活,而不再具有相應的抗性。為了檢查 載體是否導入原本沒有Ampr和Tetr的

28、大腸桿菌,將 大腸桿菌培養(yǎng)在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上。得到 如圖b的結果(黑點表示菌落)。再次滅菌的絨布按 到圖b的培養(yǎng)基上,使絨布面沾上菌落,然后將絨布 平移按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng),得到如圖c的 結果(空圈表示與b對照無菌落的位置)。據(jù)此分析 并回答：,58,課資參照,(1)pBR322質粒的基本組成單位是 。 該基因工程中,質粒上的Ampr、Tetr稱為 基因。 (2)與圖c空圈相對應的圖b中的菌落表現(xiàn)型是 ,由此說明目的基因插入 了 中。 (3)質粒作為基因表達載體除了具有Ampr或Tetr及 目的基因外,還必須具有 。,59,課資參照,(4)若用pBR322質粒作為載體,通過基因工程生產(chǎn)