新型格列酮類化合物ANY2對原代大鼠前體脂肪細胞糖脂代謝的影響

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減新型格列酮類化合物ANY2對原代大鼠前體脂肪細胞糖脂代謝的影響（作者：單位：郵編：）【摘要】目的研究新型格列酮類化合物ANY2對原代大鼠前體脂肪細胞糖脂代謝的影響。方法 用H型膠原酶消化法得 到原代大鼠前體脂肪細胞接種于 24孔細胞培養(yǎng)板，以誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘 導(dǎo)分化，油紅0染色法觀察化合物ANY2對前體脂肪細胞分化的影 響，并用異丙醇萃取油紅 0測定吸光度，比較各組分化程度。以 高濃度地塞米松作用于分化的脂肪細胞，制備胰島素抵抗模型，觀察化合物ANY2對胰島素抵抗脂肪細胞葡萄糖消耗量（GC）和游離脂肪 酸（FFAs）溢出量的影響。結(jié)果 濃度為1.1mg L-1的

2、化合物ANY2能 顯著促進前體脂肪細胞分化，分化率高達 152%，提高其儲脂能力， 增加小脂肪細胞數(shù)量；提高胰島素抵抗脂肪細胞糖耗量達 363 mg mg pro-1，減少其游離脂肪酸溢出，溢出量僅 69 mmol mg pro-1。結(jié)論 化合物ANY2可促進原代前體脂肪細胞分化充脂，并改善高濃度地塞 米松所導(dǎo)致的胰島素抵抗作用。【關(guān)鍵詞】 原代前體脂肪細胞；分化；脂肪酸溢出；胰島素抵抗Effect of Novel Thiazolid in edi one ANY2 on Glycometabolism and Lipid Metabolism in Primary Precursor Ad

3、ipose CellsAbstract: Objective To investigate the effects of a novel thiazolidi nedi one ANY2 in primary precursor adipose cells.Methods 1.Us ing en zyme-digesti ng method,primary precursor adipose cells from the rat adipose tissues were cultured in 24wells Culture Plate.Using culture medium to indu

4、ce the transformation of the cells andstai ned with oilred Oto con trast thediffere ntiatio n. 2.Differe ntiaedcells were exposed to highconcentrationof dexamethasoneto build model of Insulinresista neecells.The effects ofANY 2,i ncludi ngglucoseconsumption (GC) and FFAs releastion were tested in th

5、is model.Results ANY2 could sig ni fica ntly promote the differe ntiatio n on primary precursor adipose cells,increaseconsumptionofglucose 363mg (mg pro)-1 and reduce FFAs releastion 69 mmol (mg pro)-1) under the state of insulin resistance.Conclusion Compound ANY2 has remarkable effects on improvin

6、g insulin resiste nee in adipose cells.Key words:primary precursor adipose cells; differentiation; FFAs releasti on ; in suli n-resista nee脂肪組織具有重要的內(nèi)分泌功能，由它產(chǎn)生眾多的細胞因子和炎癥因子，通過內(nèi)分泌旁分泌和自分泌途徑廣泛影響機體物質(zhì)和能量代謝過程，參與炎性反應(yīng)，引起以代謝綜合征、2型糖尿病為代表的胰島素抵抗相關(guān)疾病的發(fā)生。本實驗以原代大鼠前體脂肪細胞為研究對象，觀察新型格列酮類化 合物ANY2對正常狀態(tài)下脂肪細胞分化的影響及胰島素抵抗狀態(tài)下

7、對細胞代謝活動的影響。1材料與方法1.1藥品和試劑DMEM培養(yǎng)基，GIBCO公司；HEPES , Merk公司；H型膠原酶， 胰蛋白酶（1 250），AMRESCO公司；游離脂肪酸（FFAs）測定試劑盒 和考馬斯亮藍法總蛋白測定試劑盒，均由南京建成生物工程研究所提 供；葡萄糖試劑盒，由上?？菩郎锛夹g(shù)研究所提供；胰島素注射液 （江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，400單位，10mL，批號070603）； 匹格列酮，上海蘭生股份有限公司提供；ANY2由中國藥科大學(xué)藥物 化學(xué)教研室提供，純度為98.5%。其余試劑均為市售分析純。吡格列酮和化合物 ANY2均用二甲亞砜（DMSO）助溶，再用PBS 稀釋至

8、終濃度1.1 mg L-1 （DMSO終濃度v 0.01% ）。1.2儀器和用具精密電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；LS-1F型超凈工 作臺（上海索譜儀器有限公司）；YCP-200型CO2細胞培養(yǎng)箱（上海易 亮醫(yī)療器械有限公司）；倒置顯微鏡（Olympus公司）;全波長酶聯(lián)免 疫檢測儀（Thermo Election Corporation）。1.3實驗動物清潔級SD大鼠，雄性，體重250300g ,由河南省鄭州大學(xué)動物 實驗中心提供，SCXK（豫）2005-0001。1.4實驗方法1.4.1原代前體脂肪細胞的提取1 SD大鼠1只，雄性，體重（250 30） g，脫頸椎處死，75 %

9、 （v/v） 乙醇浸泡約1min后在超凈臺無菌條件下打開腹腔，用眼科剪剪下二 側(cè)附睪脂肪墊（注意避開血管和附睪）。冰無菌生理鹽水洗滌脂肪墊 3 次，眼科剪剪碎成約 0.5mm X）.5mm X）.5mm1mm X1mm X1mm大 小均勻的小顆粒，以1000r min-1離心5min，取上層的純脂肪顆粒 于50mL圓底聚丙烯塑料管內(nèi)，加入2倍于脂肪組織塊體積1mg mL-1的H型膠原酶溶液進行消化，置37 C 5% CO2條件下孵 育，每5min震搖1次，直至脂肪組織塊呈絮狀，約需 40min，取出 塑料管，消化液過150目不銹鋼篩網(wǎng)，并不斷用滴管吹打以利于細 胞過篩，過篩后的細胞懸液收集于1

10、5mL塑料離心管，以1000r min-1 離心5min，棄去上層脂肪層和液體，細胞沉淀用 PBS緩沖液清洗， 1000r min-1離心5min，重復(fù)1次；細胞沉淀懸浮于含5%小牛血清 的H-DMEM培養(yǎng)基中，置37 C 5% CO2 條件下培養(yǎng)。1.4.2原代前體脂肪細胞的接種將細胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入原代培養(yǎng)基 （H-DMEM培養(yǎng)基中 另含有100U mL-1青霉素加100U mL-1鏈霉素），在37 C孵箱 （5%CO2加95%空氣）中培養(yǎng)細胞，每2天換液1次，待細胞生長至 接近完全融合時（設(shè)定為第1天）開始傳代并誘導(dǎo)分化。143脂肪細胞鑒定1油紅0染色移去細胞培養(yǎng)基，用PBS洗細胞2

11、次，每孔加 10%福爾馬林溶液，置室溫條件下固定 40min后，PBS洗3次，每 孔加入200讓油紅0溶液浸染30min ; PBS洗2次，顯微鏡下觀察， 脂肪細胞中脂滴被染成紅色，圖1（見封4）。1.4.4最佳分化條件的選擇將消化后的細胞以5 X105個mL-1均勻地接種于24孔細胞培 養(yǎng)中，待細胞生長貼壁后，加入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基培養(yǎng) （H-DMEM培養(yǎng)基中 含不同濃度的胰島素和地塞米松， 見表1），96h后，撤去胰島素和地 塞米松，每2天換培養(yǎng)液1次，至細胞融合，同時設(shè)立基礎(chǔ)培養(yǎng)基對 照組。油紅O染色后，異丙醇萃取，萃取液于510nm測定吸光度值， 確定最佳細胞分化條件，即誘導(dǎo)培養(yǎng)基；在后續(xù)的實

12、驗中，以誘導(dǎo)培 養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞組為誘導(dǎo)組。1.4.5地塞米松誘導(dǎo)胰島素抵抗及其檢測2 誘導(dǎo)分化的細胞中加入1呵ol的地塞米松，此為模型組（同時設(shè)立無 地塞米松對照組），持續(xù)作用4d，每2d換液1次，取培養(yǎng)上清， GOD-POD法的微量化測定法檢測培養(yǎng)上清中的葡萄糖含量，以培養(yǎng)基中的葡萄糖的消耗量反映胰島素抵抗（IR ）的程度。1.4.6新型格列酮類化合物ANY2對原代前體脂肪細胞分化的 影響取未分化的脂肪細胞以1 X105個mL-1接種于24孔培養(yǎng)板中， 分為對照組、誘導(dǎo)組、匹格列酮組和 ANY2組，每組4孑L。細胞貼 壁后，除對照組外，其他 3組加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基和相應(yīng)的藥物，作用 4d。撤去誘

13、導(dǎo)培養(yǎng)基和藥物繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合，棄去培養(yǎng)液-PBS 洗2次-10%福爾馬林室溫條件下固定30min -PBS洗3次-每孔200 山油紅0浸染細胞，室溫放置20min -PBS洗2次-每孔加300山 異丙醇萃取，室溫放置 20min，100山轉(zhuǎn)移于潔凈96孔培養(yǎng)板， 510nm測定吸光度值，確定細胞分化情況。147新型格列酮類化合物ANY2對原代IR脂肪細胞代謝作用 的影響取未分化的脂肪細胞以1 X105個mL-1接種于24孔培養(yǎng) 板中，分為對照組、誘導(dǎo)組、模型組、匹格列酮組和 ANY2組，每組 4孔。細胞貼壁后，除對照組外，其他 4組加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用4d ; 撤去誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細胞約

14、 80%融合；模型組、匹格列酮組 和ANY2組均加入1 gol L-1的地塞米松，每2天換液1次，作用 4d，復(fù)制IR細胞模型；各組細胞均換入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并且匹格列酮 組和ANY2組分別加入相應(yīng)藥物，作用2d。培養(yǎng)結(jié)束后，取各組細 胞培養(yǎng)上清檢測葡萄糖的消耗量和 FFAs溢出量。1.5統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標準差（k）表示，以t檢驗分析組間差異，Pv 0.05為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，Pv 0.01為差異有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意 義。2結(jié)果 2.1脂肪細胞鑒定顯微鏡下觀察，原代脂肪細胞為梭型或三角形， 經(jīng)過誘導(dǎo)，細胞分 化充脂，細胞內(nèi)有脂滴形成，經(jīng)油紅 0染色后，脂滴被染成紅色（圖 1,見封4）

15、。2.2前體脂肪細胞最佳分化條件脂肪細胞經(jīng)油紅0染色后，異丙醇萃取，510nm處讀取0D值； 各組0D值與對照組0D值的比值為分化比例，比較不同濃度胰島素 和地塞米松對前體脂肪細胞分化作用的影響。結(jié)果可見，不同濃度胰島素和地塞米松均可以引起大鼠前體脂肪細 胞分化，但分化程度有所不同。當胰島素濃度為5xi0-8mol L-1，地塞米松濃度為0.01呵ol L-1時，前體脂肪細胞分化程度最高，由此 條件培養(yǎng)的細胞為誘導(dǎo)組（以下實驗均以此條件進行），見表1。表1不 同濃度胰島素和地塞米松對前脂肪細胞分化的作用（略）2.3新型格列酮類化合物ANY2對前體脂肪細胞分化的影響作 用脂肪細胞經(jīng)油紅0染色后，

16、異丙醇萃取，510nm處讀取0D 值；各組0D值與誘導(dǎo)組0D值的比值為分化率，比較匹格列酮和 ANY2對前體脂肪細胞分化作用的影響。結(jié)果表明，匹格列酮和 ANY2均可促進大鼠原代前體脂肪細胞分 化充脂，并增加小脂肪細胞數(shù)量；與誘導(dǎo)組比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué) 意義（P V0.05），見表2。表2化合物ANY2對前體脂肪細胞分化的 影響作用（略）2.4新型格列酮類化合物ANY2對原代IR脂肪細胞FFAs溢出 及糖耗量的影響以葡萄糖氧化酶法測定細胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量，以無細胞對 照組培養(yǎng)液中葡萄糖含量減去各組細胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量， 即為細 胞所消耗的葡萄糖量（GC）；以銅試劑法測定FFAs含量，

17、考馬斯亮藍 法測定細胞裂解液蛋白含量，比較各組 GC和FFAs溢出量。結(jié)果表明，ANY2可顯著增加IR脂肪細胞糖耗量，減少FFAs溢 出，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表 3。表3化合物ANY2 對IR脂肪細胞FFAs溢出及糖耗量的影響（略）3討論前體脂肪細胞是一類具有增殖和向脂肪細胞分化能力的細胞，它持續(xù)存在和作用于動物的一生3。前體脂肪細胞的原代培養(yǎng)能保持細 胞的生物學(xué)特性，便于直接觀察各種因素對細胞分化過程的調(diào)控機 制，是研究脂肪組織的理想模型，也是與脂肪代謝有關(guān)的疾病發(fā)病機 制研究以及相關(guān)藥物篩選與作用機制研究的重要細胞模型4。已建立的來源于鼠前脂肪細胞的細胞株如 3T3-L1系列等

18、，在國外應(yīng)用廣 泛，但對國內(nèi)來說，存在著標準細胞株難以得到的問題，而且細胞經(jīng) 過傳代后其性狀、生物學(xué)特性會有一定的改變，與在體實驗的聯(lián)系受 到限制。我們對Yu等5的方法進行了改良，使用低濃度胰島素 和地塞米松誘導(dǎo)和降低培養(yǎng)液中血清含量等， 以此促使細胞自然向脂 肪細胞分化，從而建立了大鼠前脂肪細胞的原代培養(yǎng)方法。培養(yǎng)細胞的形態(tài)學(xué)觀察顯示，脂肪細胞貼壁后初為類圓形，3d后即可觀察到細胞漸成梭形，7d左右細胞增殖明顯，形狀由多角梭形變?yōu)闄E圓形，并開始積聚脂肪顆粒。脂肪細胞的重要功能是儲存脂肪；胰島素抵抗時脂肪細胞即表現(xiàn)為 儲存脂質(zhì)能力的下降，甘油三酯分解加快， FFAs過度溢出；而高濃 度的FFA

19、s又可引起和加重胰島素抵抗。兩者互為因果，相互影響:6。通過結(jié)果可以看出，化合物ANY2可顯著促進前體脂肪細胞分化， 提高細胞儲脂能力；1呵ol L-1地塞米松作用于大鼠原代脂肪細胞， 可明顯減少細胞對培養(yǎng)基中葡萄糖的攝取，F(xiàn)FAs溢出量也大大增加， 說明細胞胰島素抗性已基本形成?；衔顰NY2可顯著增加細胞糖耗 量，減少其因脂解作用釋放到上清中 FFAs的濃度，同時還增加對胰 島素敏感的小脂肪細胞數(shù)目，改善胰島素抵抗狀態(tài)，其作用與匹格列 酮相當，具有良好的開發(fā)潛力。【參考文獻】:1 陳國柱，林亞秋，龐衛(wèi)軍，等.全反式維甲酸對大 鼠前體脂肪細胞增殖與分化的影響J.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2005，36(4): 357-361.:2 楊桂枝，高小平，晏菊芳，等.地塞米松