TUNEL檢測(cè)方法

1、TUNEL檢測(cè)方法DeadEnd?Colorimetric?TUNEL System 試劑盒法檢測(cè)原理：細(xì)胞凋亡時(shí)，其DNA會(huì)產(chǎn)生3 -OH末端，而正常細(xì)胞則幾乎沒有。使用末端脫氧核 苷轉(zhuǎn)移酶（TdT酶）將生物素標(biāo)記的核苷酸連接到 DNA的 3 -OH末端。再將辣根過氧化物 酶標(biāo)記的鏈霉親和素（Streptavidin?HRP）結(jié)合在此核苷酸上。Streptavidin?HRP 可與過 氧化物酶的底物過氧化氫和穩(wěn)定的顯色劑氨基聯(lián)苯胺（DAB）產(chǎn)生深棕色反應(yīng)。即可通過光學(xué)顯微鏡觀察到凋亡細(xì)胞。材料試劑盒（G7130內(nèi)容:名稱量說明平衡緩沖液9.6ml生物素標(biāo)記的核苷酸混合物40卩l(xiāng)2 X 20

2、卩 lTdT酶40卩l(xiāng)2 X 20 卩 lStreptavid in ?HRP40卩l(xiāng)0.5mg/mlDAB 20X Chromoge n200 卩 lDAB Substrate 20X Buffer200 卩 lHydrogen Peroxide 20X200 卩 lSSC, 20X70mlProte in ase K10mgPlastic Coverslips40(2 X 20)儲(chǔ)存條件:?平衡緩沖液,?TdT酶,?生物素標(biāo)記的核苷酸混合物，蛋白酶 K?：- 20 CStreptavidin?HRP,?DAB?20X?Chromogen,?20X?DAB底物緩沖液，20X過氧化氫：？4 C

3、 20X?SSC塑料蓋玻片：室溫保存需自備：PBS緩沖液0.3%過氧化氫溶液（用以抑制內(nèi)源性過氧化氫酶 ?） 固定液（例如：10%緩沖的福爾馬林，4%多聚甲醛，4%6甲醇甲醛）？ 封固劑用于組織的檢測(cè)方法由試劑盒內(nèi)容制備：20卩g/ml蛋白酶K工作液：10mg蛋白酶K+ 1ml蛋白酶K緩沖液r宀10mg/ml蛋白酶K儲(chǔ)備液宀20卩g/ml蛋白酶K工作液TdT酶反應(yīng)液（使用時(shí)制備）：緩沖液成分每標(biāo)準(zhǔn)100ul反應(yīng)的成分 體積反應(yīng)次數(shù)（實(shí)驗(yàn)反 應(yīng)+選擇性陽性對(duì) 昭）八、）成分的體 積平衡緩沖液98ulX ?=生物素化的核苷混合 物1ulXrTdT 酶1ul?X ?=?2X SSC用去離子水1: 1

4、0稀釋20X?SSCStreptavidin?HRP 工作液： 以 PBS500 1 稀釋 Streptavidin?HRP.DAB昆合液（使用時(shí)制備，避光，30mins ）:950ul去離子水+ 50ul?20X?DAB底物緩沖液+ 50ul?DAB?20X色原體+ 50ul?20X過氧化氫步驟：1. 0.85%氯化鈉溶液浸洗5mins （室溫）2. PBS浸洗 5mins （室溫）3. 4%多聚甲醛溶液或含10%畐爾馬林的PBS溶液中固定15?mins （室溫）4. PBS浸洗二次，每次5?mins （室溫）5. 除去多余液體，滴加100卩L 20卩g/ml蛋白酶K工作液，覆蓋組織。置于平

5、面，孵育10-30mins （室溫）。6. 染色缸內(nèi)PBS浸洗5mins。（室溫）7. 4%多聚甲醛溶液或含10%畐爾馬林的PBS溶液固定5?mins。（室溫）8. PBS浸洗二次，每次5?mins。（室溫）9. 除去多余液體，滴加100卩L平衡緩沖液，覆蓋組織。置于平面，平衡 510mins （室 溫）。10. 置于冰上，除去多余液體，添加100卩LTdT酶反應(yīng)液，防止干燥。37C，濕盒中孵育 60min,（以使末端標(biāo)記反應(yīng)發(fā)生）。（過程中應(yīng)防止干燥）。11. 染色缸內(nèi)2X SSC浸洗15mins （用于終止反應(yīng)）。（室溫）12. PBS浸洗三次，每次5min,（用于移去未結(jié)合的生物素標(biāo)記的

6、核苷酸）。（室溫）13. 0.3%過氧化氫的PBS中浸洗3-5min （用以抑制內(nèi)源性過氧化氫酶）。（室溫）14. PBS浸洗三次，每次5min。（室溫）15. 加 100 卩 LStreptavidin?HRP 工作液，反應(yīng) 30min。（室溫）16. PBS浸洗三次，每次5min。（室溫）17. 加100卩L?DAB混合液，直到呈現(xiàn)淺棕色背景，但背景不可太深。18. 去離子水漂洗若干次。19. 用水或永久的封片劑封片，水封片劑周圍用指甲膏封住，顯微鏡下觀察染色。用于細(xì)胞的檢測(cè)方法需自備：Poly-L-Lys ine 覆蓋的切片：在干凈的載玻片表面鋪 poly- L-lysine （可以Si

7、gma Cat.# P 892010 倍稀釋于水制得），在所需區(qū)域鋪一薄層。待干后，迅速以去離子水沖洗，空氣干燥30-60mins。4 C可儲(chǔ)存7天。0.2% Trit on X-100 溶液：Triton X-100 溶于 PBSTdT酶反應(yīng)液（使用時(shí)制備）：緩沖液成分每標(biāo)準(zhǔn)100ul反應(yīng)的成分反應(yīng)次數(shù)（實(shí)驗(yàn)反 應(yīng)+選擇性陽性對(duì)成分的體 積體積昭）八、）平衡緩沖液98ulX ?=生物素化的核苷混合 物1ulX=rTdT 酶1ul?X ?=?2X SSC用去離子水1: 10稀釋20X?SSCStreptavidin?HRP 工作液： 以 PBS500 1 稀釋 Streptavidin?HRP

8、.DAB昆合液（使用時(shí)制備，避光，30mins ）:950ul去離子水+ 50ul?20X?DAB底物緩沖液+ 50ul?DAB?20X色原體+ 50ul?20X過氧化氫步驟：1. 將細(xì)胞以PBS清洗，重懸后鋪于Poly-L-Lysine 覆蓋的切片上，組織培養(yǎng)罩內(nèi)空氣干 燥約15mi ns2. PBS青洗2次。（室溫）3. 4多聚甲醛溶液或含10%畐爾馬林的PBS溶液，或10%畐爾馬林浸泡細(xì)胞25mins。（室 溫）4. PBS浸洗二次，每次5?mins。（室溫）5. 0.2% Triton X-100 溶液浸洗 5?mins。（室溫）6. PBS浸洗二次，每次5?mins。（室溫）7. 除

9、去多余液體，滴加100卩L平衡緩沖液，覆蓋組織。置于平面，室溫平衡510mins。8. 置于冰上，除去多余液體，添加100卩LTdT酶反應(yīng)液，防止干燥。37C，濕盒中孵育 60min,（以使末端標(biāo)記反應(yīng)發(fā)生）。（過程中應(yīng)防止干燥）。9. 染色缸內(nèi)2X SSC浸洗15mins （用于終止反應(yīng)）。（室溫）10. PBS浸洗三次，每次5min,（用于移去未結(jié)合的生物素標(biāo)記的核苷酸）。（室溫）11. 0.3%過氧化氫的PBS中浸洗3-5min （用以抑制內(nèi)源性過氧化氫酶）。（室溫）12. PBS浸洗三次，每次5min。（室溫）13. 加 100 卩 LStreptavidin?HRP 工作液，反應(yīng) 3

10、0min。（室溫）14. PBS浸洗三次，每次5min。（室溫）15. 加100卩L?DAB混合液，直到呈現(xiàn)淺棕色背景，但背景不可太深。16. 去離子水漂洗若干次。17. 用水或永久的封片劑封片，水封片劑周圍用指甲膏封住，顯微鏡下觀察染色。附：用于細(xì)胞的檢測(cè)方法非試劑盒法TUNEI法檢測(cè)SK-N-SH細(xì)胞的凋亡1. SK-N-SH細(xì)胞于激光共聚焦專用玻璃培養(yǎng)皿中，PBS洗滌，用4%勺多聚甲醛（以0.1mol/L NaH2PO4 為溶劑，pH=7.4）固定細(xì)胞 15 min ;2. PBS洗滌3次，每次5 min3. 含有 0.5%Tween-20和 0.2%BSA勺 PBS室溫孵育 15 min4. PBS洗滌 2 min5. 每孔加入50卩L TdT混合物（TdT緩沖液：Biotin-dUTP : TdT為90 : 5 : 5,體積比， 現(xiàn)配現(xiàn)用）室溫孵育60 min6. 吸棄TdT混合物，加入1X TB室溫作用5 min7. PBS洗滌4次，每次2 min ;每孔滴加50卩L的封閉液室溫處理20 min8. 現(xiàn)配的avi