光學(xué)顯微鏡的七種觀察方式

1、光學(xué)顯微鏡的七種觀察方式 2021-4-24 五、顯微鏡的七種觀察方式 七種觀察方式 5.1、明場(chǎng)觀察 5.2、暗場(chǎng)觀察 5.3、像差觀察 5.4、偏光觀察 5.5、微分干涉觀察 5.6、霍夫曼觀察 5.7、熒光觀察 2021-4-242 明場(chǎng)BF（透射明場(chǎng)，反射明場(chǎng)）最常規(guī)的顯微觀察方法標(biāo)本的顏 色、透射率。 優(yōu)點(diǎn)： 應(yīng)用廣泛，操作簡(jiǎn)單； 視野亮度高、均勻， 較好的色彩還原、圖像平坦， 價(jià)格相對(duì)較低， 物鏡也可用于熒光觀察（如綠色、紅色熒光） 缺點(diǎn)： 成像對(duì)比度低（透明或未染色標(biāo)本）、缺乏立體感、應(yīng)用局限。 應(yīng)用領(lǐng)域：常規(guī)鏡檢、病理、染色標(biāo)本 2021-4-243 五、顯微鏡的七種觀察方式

2、5.1、明場(chǎng)觀察 原理： 丁道爾(Tyndall)現(xiàn)象，微粒對(duì)斜射光反射或衍射，增大了對(duì)人 眼可見(jiàn)性。 特點(diǎn)： 可以觀察在普通明場(chǎng)中看不見(jiàn)的微小標(biāo)本（如細(xì)菌、微粒等）， 分辨率可達(dá)20nm 4nm，超顯微觀測(cè)。 缺點(diǎn)： 只能觀察到物體存在、外部輪廓、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)等； 物鏡使用的局限，不方便調(diào)節(jié)； 對(duì)標(biāo)本要求較高（灰塵、蓋片、載片等）。 應(yīng)用： 微小粒子、細(xì)菌形態(tài)觀察、細(xì)菌記數(shù)，透明標(biāo)本觀察等。 2021-4-244 五、顯微鏡的七種觀察方式 5.2、暗場(chǎng)觀察 原理：利用被檢物體的光程（折射率 x 厚度）差進(jìn)行鏡檢，即利用干涉現(xiàn)象，將相 位差變?yōu)槿搜劭梢苑直娴恼穹睢?2021-4-245 五、顯微

3、鏡的七種觀察方式 5.3、相差觀察 聚光鏡環(huán)狀光闌聚光鏡環(huán)狀光闌 共軛面：吸收光線，直射光通過(guò)共軛面：吸收光線，直射光通過(guò) 補(bǔ)償面：相位推遲，衍射光通過(guò)補(bǔ)償面：相位推遲，衍射光通過(guò) 物鏡相板物鏡相板 特點(diǎn)： 鑒定活體細(xì)胞最實(shí)用、最經(jīng)濟(jì)的方法 缺點(diǎn)： 需要光強(qiáng)高； 切片不能太厚(510um)； 蓋片、載片需符合標(biāo)準(zhǔn)； 需增加單色濾鏡以提高相差效果； 操作較麻煩； 相差熒光物鏡的熒光成像效果較明場(chǎng)熒光物鏡差。 應(yīng)用： 可對(duì)無(wú)色透明的標(biāo)本進(jìn)行觀察，尤其適于培養(yǎng)的活細(xì)胞、組織觀察，也適用于細(xì)菌、血液、 水生無(wú)脊椎動(dòng)物等。 2021-4-246 五、顯微鏡的七種觀察方式 5.3、相差觀察 原理：依據(jù)波動(dòng)

4、光學(xué)原理觀察和精密測(cè)定標(biāo)本細(xì)節(jié),或透明物體改變光束的物理參數(shù), 以此判別物質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種顯微鏡。 2021-4-247 五、顯微鏡的七種觀察方式 5.4、偏光觀察 自然光（多自然光（多 振動(dòng)面）振動(dòng)面） 偏振器偏振器1 偏振器偏振器2 偏振光（單偏振光（單 一振動(dòng)面）一振動(dòng)面） 各向同性：各向同性：?jiǎn)握凵潴w，光性質(zhì)不因照射方向而改變，普通氣體、液體、非結(jié)晶固體等 各向異性：各向異性：雙折射體，光速度、折射率、吸收和振動(dòng)面、振幅隨照射方向不同，晶體、 纖維等 應(yīng)用：礦物質(zhì)、化學(xué)物品鑒別，鑒別纖 維、染色體、淀粉粒、細(xì)胞中晶體植物 病理檢驗(yàn)，鑒別骨骼、牙齒、膽固醇、 神經(jīng)纖維、腫瘤細(xì)胞、橫紋肌和毛發(fā)

5、等。 2021-4-248 五、顯微鏡的七種觀察方式 5.4、偏光觀察 什么是微分干涉？ 微分干涉(Differential interference contrast,DIC) :50年代法國(guó)光學(xué)家諾曼爾斯基 （Georges Nomarski）改良了沃拉斯頓棱鏡（Wollaston prism），在沃拉斯頓棱 鏡基礎(chǔ)上完善了DIC理論及顯微鏡中DIC的使用方法。 2021-4-249 五、顯微鏡的七種觀察方式 5.5、微分干涉觀察 原理： 通過(guò)特制的棱鏡將偏振光分解相互垂 直，強(qiáng)度相等的光束，光束載極近的 兩點(diǎn)（小于顯微鏡的分辨率）上通過(guò) 被檢物體，從而在相位上略有差別， 使圖象呈現(xiàn)出立體

6、三維感覺(jué)。 DIC組件： 檢偏鏡、 檢偏鏡、 2個(gè)DIC棱鏡（1個(gè)位于聚光鏡中，一 個(gè)位于物鏡轉(zhuǎn)盤中） 2021-4-2410 五、顯微鏡的七種觀察方式 5.5、微分干涉觀察 優(yōu)點(diǎn)： 可以使被檢物體產(chǎn)生三維立體感覺(jué)， 觀察效果更直觀， 無(wú)須特殊物鏡， 與熒光觀察配合更好可以調(diào)節(jié)背景和物體的顏色變化而達(dá)到理想的效果。 缺點(diǎn)： 需要光強(qiáng)高， 雙折射性物質(zhì)不能達(dá)到DIC鏡檢效果， 不能應(yīng)用于塑料容器培養(yǎng)物的觀察， 鏡檢靈敏度有方向性，調(diào)節(jié)較復(fù)雜。 2021-4-2411 五、顯微鏡的七種觀察方式 5.5、微分干涉觀察 應(yīng)用：無(wú)色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)，無(wú)色熒光標(biāo)本，染色標(biāo)本，顯微操作等 2021-4

7、-2412 五、顯微鏡的七種觀察方式 5.5、微分干涉觀察 2021-4-2413 五、顯微鏡的七種觀察方式 5.5、微分干涉觀察 透射光DIC 反射光DIC 原理：斜射光照射到標(biāo)本產(chǎn)生折射、衍射，光 線通過(guò)物鏡光密度梯度調(diào)節(jié)器產(chǎn)生不同陰影， 從而使透明標(biāo)本表面產(chǎn)生明暗差異，增加觀察 對(duì)比度。 2021-4-2414 五、顯微鏡的七種觀察方式 5.6、霍夫曼觀察 優(yōu)點(diǎn)： 強(qiáng)立體成像效果，無(wú)光暈， 塑料/玻璃培養(yǎng)器皿適用， 可檢測(cè)雙折射性物質(zhì)， 聚光鏡的工作距離大于DIC， 背景與標(biāo)本的亮度變化可調(diào)節(jié)， 物鏡可用于明場(chǎng)、暗場(chǎng)、熒光觀測(cè)。 缺點(diǎn)： 調(diào)試、使用稍復(fù)雜， 成本較高等。 應(yīng)用： 顯微操作

8、，內(nèi)部結(jié)構(gòu)、外部形態(tài)觀測(cè)等 2021-4-2415 五、顯微鏡的七種觀察方式 5.6、霍夫曼觀察 什么是熒光？ 物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的 光，是非溫度輻射光冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長(zhǎng)波光。 顯微鏡熒光利用光源激發(fā)光化熒光 2021-4-2416 五、顯微鏡的七種觀察方式 5.7、熒光觀察 2021-4-2417 五、顯微鏡的七種觀察方式 5.7、熒光觀察 熒 光 的 性 質(zhì) 吸收光，必需有激發(fā)光源 熒光波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)（損失熱能） 熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度 有不同程度的衰減 熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢 物濃度、熒光效率 優(yōu) 點(diǎn) 檢出

9、能力高（放大作用） 對(duì)細(xì)胞的刺激?。梢曰铙w染色） 能進(jìn)行多重染色 用途 物體構(gòu)造的觀察熒光素 熒光的有無(wú)、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別抗 體熒光等 發(fā)熒光量的測(cè)定對(duì)物質(zhì)定性、定量分析 熒光種類 自發(fā)熒光 二次熒光 2021-4-2418 五、顯微鏡的七種觀察方式 七種觀察方式 5.1、明場(chǎng)觀察 5.2、暗場(chǎng)觀察 5.3、像差觀察 5.4、偏光觀察 5.5、微分干涉觀察 5.6、霍夫曼觀察 5.7、熒光觀察 2021-4-2419 什么是微分干涉？ 微分干涉(Differential interference contrast,DIC) :50年代法國(guó)光學(xué)家諾曼爾斯基 （Georges Nomarski）改良了沃