幾種常用生物活性測試方法簡介（經(jīng)典實用）

1、幾種常用生物活性幾種常用生物活性 測試方法簡介測試方法簡介 幾種常用生物活性測試方法簡介 2 總結(jié)總結(jié) 3 分子水平活性測試分子水平活性測試方法方法 1 CONTENTS 細胞水平活性測試方法細胞水平活性測試方法 幾種常用生物活性測試方法簡介 等溫滴定量熱法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年來發(fā)展起來的一種 研究生物熱力學與生物動力學的重要方法，它通過高靈敏度、高自動化的微量 量熱儀連續(xù)、準確地監(jiān)測和記錄一個變化過程的量熱曲線，原位、在線和無損 傷地同時提供熱力學和動力學信息。 Isothermal Titration Calorimetry

2、(ITC) 基本原理基本原理： Q = Ho x V x H.G = Ho x V x x Ho Ka G 1+Ka G Go = -RT ln K a Go = Ho - TSo 注：H 為受體（主體），G為配體（客體），Ka為結(jié)合常數(shù) Go為Gibbs自由能變化，Ho 為焓變，So 為熵變 幾種常用生物活性測試方法簡介 受體-配體復(fù)合物的形成伴隨著能量的釋放或吸收，導(dǎo)致樣品池溫度的變化，參比池 始終保持在實驗溫度，反饋系統(tǒng)提供熱或降低熱量來補償樣品池的溫度變化，每注 射一次后系統(tǒng)恢復(fù)至平衡狀態(tài)再進行下一滴滴定。結(jié)果以峰的形式表示平衡溫度偏 移所需要的能量，峰的面積相當于反應(yīng)釋放或吸收的熱量

3、。 ITC儀儀結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)示意圖示意圖 Isothermal Titration Calorimetry (ITC) ITC是一種熱量連續(xù)變化的量熱器。主 要由隔熱夾套包裹著的樣品池(反應(yīng)池) 和參比池、注射器和一臺計算機組成， 注射器同時具有攪拌作用，計算機控 制溫度控制裝置和信息反饋系統(tǒng)。 Methods In Cell Biology, 2008, 84,79.幾種常用生物活性測試方法簡介 Isothermal Titration Calorimetry (ITC) ITC數(shù)據(jù)圖數(shù)據(jù)圖 Journal of Molecular Recognition.2008, 21, 289. 左圖： 橫

4、坐標：時間 縱坐標：熱功率 峰底與峰尖之間的峰面積為每次注射時釋放或吸收的總熱量。 右圖： 橫坐標：滴定物與樣品溶液的摩爾比 縱坐標：滴定產(chǎn)生的總熱量 反應(yīng)過程的結(jié)合等溫曲線 幾種常用生物活性測試方法簡介 ITC獨特之處： 樣品用量小，方法靈敏度和精確度高。最小可檢測熱效應(yīng)0.125uJ，生物樣品最 小用量0.4ug，滴定池體積1.43 ml 實驗時間較短。典型的ITC實驗只需30-60分鐘，并加上幾分鐘的響應(yīng)時間。 操作簡單。整個實驗由計算機控制，使用者只需輸入實驗的參數(shù)，如溫度、注 射次數(shù)、注射量等，計算機就可以完成整個實驗，再由軟件分析ITC得到的數(shù)據(jù)。 量熱實驗完畢的樣品未遭破壞，還可

5、以進行后續(xù)生化分析。 ITC的用途： 獲得生物分子相互作用的完整熱力學參數(shù)，包括結(jié)合常數(shù)(Ka)、結(jié)合位點數(shù)(n)、摩 爾結(jié)合焓(H）、摩爾結(jié)合熵（ S）、摩爾恒壓熱容（ Cp），和動力學參數(shù) (如酶活力（Kcat）、酶促反應(yīng)米氏常數(shù)(Km) 。 可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)折疊/去折疊、蛋白質(zhì)-小分子相互作用、 酶-抑制劑相互作用、酶促反應(yīng)動力學、藥物-DNA/RNA相互作用、RNA折疊、蛋 白質(zhì)-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-細胞 相互作用等方面。 Isothermal Titration Calorimetry (ITC) 幾種常用生物活性

6、測試方法簡介 surface plasmon resonance , SPR 表面等離子表面等離子共振（共振（SPR）原理）原理 消逝波消逝波：當入射光到達界面時并不是直 接產(chǎn)生反射光，而是先透過光疏介質(zhì)約 一個波長的深度，再沿界面流動約半個 波長再返回光密介質(zhì)，透過光疏介質(zhì)的 波被稱為消逝波。 等離子波等離子波：當金屬受電磁干擾時，金屬內(nèi)部 的電子密度分布會變得不均勻。因為庫侖力 的存在，電子不會在引力與斥力的平衡位置 停下而向前運動一段距離，之后電子間存在 的斥力會迫使已經(jīng)聚集起來的電子再次離開 該區(qū)域。由此會形成一種整個電子系統(tǒng)的集 體震蕩，而庫侖力的存在使得這種集體震蕩 反復(fù)進行震蕩，

7、并以波的形式表現(xiàn)。 幾種常用生物活性測試方法簡介 surface plasmon resonance , SPR 表面等離子表面等離子共振原理共振原理 光在棱鏡與金屬膜表面上發(fā)生全反射 現(xiàn)象時，會形成消逝波進入到光疏介 質(zhì)中與介質(zhì)中存在一定的等離子波相 遇時可能會發(fā)生共振。當消逝波與表 面等離子波發(fā)生共振時，檢測到的反 射光強會大幅度地減弱。 SPR角：反射光完全消失的角。 SPR角隨金屬表面折射率變化而變化， 而折射率的變化又與金屬表面結(jié)合的 分子質(zhì)量成正比。 可通過 SPR 角的變化捕獲生物反應(yīng)過 程中生物分子之間相互作用的特異信 號，對待測物質(zhì)進行測定直接測量反 應(yīng)平衡常數(shù) Ka，解離平

8、衡常數(shù) Kd 等。 幾種常用生物活性測試方法簡介 surface plasmon resonance , SPR 將待測分子鍵合在生物傳感芯片表面，使其形成分子敏感膜， 再將分析物分子溶液 注入，使其以恒定流速流過芯片表面，如果兩者通過相互作用而結(jié)合，則將引起生 物傳感器表面質(zhì)量的增加， 導(dǎo)致傳感器表面折射率的變化，從而引起SPR角的改變。 SPR被廣泛應(yīng)用于分析生物分子如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、藥物-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-核酸、核 酸-核酸之間的相互作用，所涉及的研究領(lǐng)域包括免疫學、蛋白質(zhì)組學及藥物篩選等。 J.Pharmaceut.Biomedical.2008,11,28. 幾種常用生物活性測試方法簡

9、介 surface plasmon resonance , SPR SPR的優(yōu)點：的優(yōu)點： p 可以實時、連續(xù)監(jiān)測反應(yīng)的動態(tài)過程， 靈敏度較高 。 p 可實時記錄反應(yīng)的結(jié)合與解離過程。 p 每次檢測結(jié)束后，結(jié)合在金屬膜芯片 上的反應(yīng)物可以用洗脫液洗脫使芯片 再生，可重復(fù)使用，節(jié)約耗材。 p 可以得到高通量數(shù)據(jù)。 SPR的缺點：的缺點： p 待測物在金屬薄膜表面的固定：由于生物大分子本身理化性質(zhì)的復(fù)雜性，空間 結(jié)構(gòu)的特殊性，偶聯(lián)結(jié)果可能導(dǎo)致偶聯(lián)物特異作用位點的失活。 p 分析物在金屬薄膜表面的結(jié)合：難以區(qū)分非特異性結(jié)合，若分析物在芯片表面 是非特異性結(jié)合， 會給整個實驗帶來干擾，造成錯誤的結(jié)論。

10、 p 待測物的分子大?。哼m用于生物大分子，小分子的質(zhì)量變化對折射率變化不明 顯， 因此會給小分子待測物的檢測造成困難。 p 動態(tài)范圍過?。簩囟?、樣品組成、金屬薄膜要求高。 幾種常用生物活性測試方法簡介 分子水平活性測試方法 特點特點SPRITC 固定化需要不需要 結(jié)果動力學動力學和熱力學 得到數(shù)據(jù)Ka, KdKa,，H、 Cp 運行時間210min3060min 分子質(zhì)量1000無限制 樣品量約1mg最小含量0.4ug 溫度1540280 溶劑非強有機溶劑無限制 耗材芯片試劑 藥物篩選適用不適用 SPR 與與 ITC 功能特性功能特性對比對比 幾種常用生物活性測試方法簡介 Time-reso

11、lved fluorescence energy transfer (TR-FRET) FRET原理原理 傳統(tǒng)FRET技術(shù)容易受樣品組分(緩沖液，蛋白， 化學物質(zhì)及細胞裂解產(chǎn)物等)背景熒光信號的 影響。 時間分辨通過去除壽命較短的背景，分辨目的 熒光。 通過使用供體和受體熒光團標記， TR-FRET 檢測將時間分辨 (TR) 和 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 原理的 優(yōu)勢結(jié)合到了一起。 J. Biomol. Screen. 2015, 7,4. 幾種常用生物活性測試方法簡介 鑭系元素（銪Eu 和鋱Tb）半衰期 長(us-ms)，將Eu 納入立體籠中， 形成穩(wěn)固復(fù)合體， 籠收集光將能量 轉(zhuǎn)移到

12、Eu上。 p Eu永久性嵌合穴狀口袋（非螯合作用） 耐受性好，對溫度，光強，PH，離子 強度變化影響較小。不易受化學物質(zhì) 干擾，如EDTA，二價離子（Mg2+， Mn2+）等。 p 持續(xù)激活后沒有光漂白現(xiàn)象,可以多次 讀數(shù)，從而進行動力學實驗。 p 鑭系元素的半衰期大于1毫秒，與普 通熒光納秒級的半衰期相差6個數(shù)量 級。當延遲50微秒讀數(shù)時，普通熒光 的信號近似于零。檢測的發(fā)射光中沒 有來自于激發(fā)波長的干擾。 J. Phys. Chem. C, 2008. 17, 112. 銪穴狀化合物的激發(fā)和發(fā)射光譜銪穴狀化合物的激發(fā)和發(fā)射光譜 Time-resolved fluorescence ener

13、gy transfer (TR-FRET) Stokes shift 300nm 幾種常用生物活性測試方法簡介 Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) Donor ExcitationE mission (nm) Acceptor ExcitationE mission (nm) Stokes Shift (nm)(donor excitation acceptor emission) Europium3+340615Allophycocyanin（APC）615660320 Terbium3+340545Phycoerythr

14、in（Phy）545575235 J. Phys. Chem. C. 2013,112,6589. When these two fluorophores are brought together by a biomolecular interaction, a portion of the energy captured by the Europium during excitation is released through fluorescence emission at 620 nm, while the remaining energy is transferred to the A

15、PC. This energy is then released by APC as specific fluorescence at 660 nm only via FRET with Europium. 幾種常用生物活性測試方法簡介 General Format For FRET Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) J. Biomol. Screen. 2015, 7,4. PD1-PDL1 binding assay 幾種常用生物活性測試方法簡介 1.根據(jù)需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer

16、分別將成分Eu-labeled donor 和 dye-labeled acceptor (帶帶straptavidin標記）標記） 100倍稀釋； 2.向384孔板中，每孔加入稀釋好的Eu-labeled donor 和dye-labeled acceptor 各2.5ul； 3.向每孔中加入一定量的化合物，陽性對照組加入對應(yīng)體積的DMSO；振蕩反應(yīng) 1min； 4 .根據(jù)需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer將組分BET Bromodomain 40倍稀釋。 分別向化合物檢測組和陽性對照組加入稀釋好的BET Bromodomain 2.5ul每孔； 5.根據(jù)需要，

17、使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer將組分acetylated Ligand1（帶（帶Biotin 標記）標記） 40倍稀釋。向陰性對照組加入稀釋好的BET Bromodomain 2.5ul每孔； 6. 每孔加入一定量的BRD4 bromodomain ，保證每個反應(yīng)體系中含有4.5ng含量的酶。 7 .室溫靜置反應(yīng)1h后，測值340/665nm。 Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) BDR4相關(guān)相關(guān)化合物化合物TR-FRET活性測試方法活性測試方法 BRD4(BD1)TR-FRET Assay Ki

18、t 購買自 BPS Bioscience 公司 (620/670nmCayman 幾種常用生物活性測試方法簡介 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 可用于測定抗體，也可用于檢測抗原。根據(jù)檢測目的和操作步驟不同，有以下 幾種類型： p 直接法 p 間接法 p 雙抗體夾心法 p 競爭法 酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 基本原理是先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。 測定時，將待檢標本和酶標抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體 或抗原發(fā)生

19、反應(yīng)。 用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離成分。然后加入酶的作用底物催化顯 色，進行定性或定量測定。 幾種常用生物活性測試方法簡介 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 直接法直接法（Direct ELISA） 間接法（間接法（Indirect ELISA） 將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標本 (含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。洗滌后，加入酶標 抗球蛋白抗體(酶標抗抗體)和底物進行測定。 檢測抗體最常用的方法。 幾種常用生物活性測試方法簡介 雙抗夾心法（雙抗夾心法（Sandwich ELISA） enzyme-linked immunosorbent a

20、ssay(ELISA) 將已知抗體吸附于固相載體加 入待檢標本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié) 合。溫育后洗滌，加入酶標抗體 和底物進行測定。 （競爭法（競爭法Competitive ELISA） 可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于 測定抗體。 以測定抗原為例將持異性抗體吸附于固 相載體；加入待測抗原和一定量的酶標已知 抗原，使二者競爭與固相抗體結(jié)合；經(jīng)過洗 滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標抗原與待測 抗原含量呈負相關(guān)。 幾種常用生物活性測試方法簡介 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 在ELISA法中，底物被酶裂解后，能生成可溶性有色產(chǎn)物，適合用分光光度計

21、(酶標儀)測量光密度值，以定量測定樣品中待測抗原或抗體的含量。 ELISA常用常用的酶及其底物的酶及其底物 酶來源底物/供氫體呈色測量方法 辣根過氧化物酶 （HRP） 辣根 H2O2 /四甲基聯(lián)苯胺 （TMB） 藍色450 nm H2O2 /鄰苯二胺 （OPD） 橙色490 nm 堿性磷酸酶 （AP） 小牛腸粘膜 大腸桿菌 對硝基苯磷酸鹽 （PNP） 黃色405 nm H2O2 + Donor 2 H2O + Oxidized donor HRP/AP 幾種常用生物活性測試方法簡介 1. Integrin 61蛋白 5g/ml，50l/孔，4C固定過夜；（包被（包被 Coating） 2. P

22、BS 250l/孔 沖洗3次；（封閉（封閉 Blocking） 3. 加入上述多肽，其中CRWY-biotin 工作濃度為0.00005mol/L，體積為 50l。阻斷肽為0.0005mol/L，50l； 4. 室溫結(jié)合1小時； 5. HEPES沖洗6次，250l/次； 6. 加入HRP- straptavidin 1：3000，室溫1小時； 7. HEPES沖洗6次，250l/次； 8. 加入50l TMB，觀察顯色效果； 9. 加入100l 0.5M H2SO4終止反應(yīng)，450nm測OD值。 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) ELISA測試測

23、試CRWY修飾肽與整合素修飾肽與整合素6的的親和力實驗方法親和力實驗方法 競爭法競爭法 BAS-ELISA 幾種常用生物活性測試方法簡介 2 總結(jié)總結(jié) 3 分子水平活性測試分子水平活性測試方法方法 1 CONTENTS 細胞水平活性測試方法細胞水平活性測試方法 幾種常用生物活性測試方法簡介 檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍 紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。DMSO能溶解細 胞中的甲瓚，用酶標儀在540 或720nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細 胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。用于檢測

24、細 胞增殖、細胞毒性。 MTT是一種粉末狀化學試劑，全稱為3- (4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，化學名為 3-(4， 5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽。 商品名：噻唑藍，是一種黃顏色的染料。 MTT 幾種常用生物活性測試方法簡介 MTT 1.將接種好的細胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，,加入濃度梯度的藥物, 一般5-7個梯 度,每孔100ul,設(shè)3-5個復(fù)孔。 2.5%CO2，37孵育16-48小時。 3.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。 4.終止培養(yǎng)

25、，準備溶解結(jié)晶，測試吸光度。 第一種，DMSO溶解 MTT加入培養(yǎng)4h后，結(jié)晶可充分形成，將細胞上清去掉。 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。 酶標儀測OD 570nm處測量各孔的吸光值。 第二種：三聯(lián)溶解液 該方法細胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。（溶解液因含 有SDS，在低溫保存的時候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至 室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。） 放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育46小時，鏡下觀察，待結(jié)晶全部溶解后570nm測吸 光度。 MTT一般操作方法一般操作方法 幾種常用生物活性測試方法簡介 MTT的缺點：的缺點：

26、 由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。不僅使 工作量增加，也會對實驗結(jié)果的準確性產(chǎn)生影響。 MTT有致癌性。 MTT對菌很敏感，配成的MTT需要無菌保存。 可靠度和靈敏度易受細胞容積、氧化還原劑、有色物質(zhì)等因素干擾。 MTT MTT的優(yōu)點：的優(yōu)點： 不涉及使用同位素； 使用試劑少，儀器簡單，耗時少； 線性范圍寬； 適用于大量抗癌藥物的篩選。 幾種常用生物活性測試方法簡介 Cell Counting Kit-8（CCK-8） 基本原理基本原理：該試劑中含有WST-8【化學名：2- (2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二 磺酸苯)-2H-四唑

27、單鈉鹽】，它在電子載體1-甲 氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被活細胞中的脫氫酶還原為具 有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成 正比。 幾種常用生物活性測試方法簡介 CCK8的優(yōu)點的優(yōu)點： 使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑； CCK-8法能快速檢測； CCK-8法的檢測靈敏度很高，可以測定較低細胞密度； CCK-8法的重復(fù)性優(yōu)于MTT 法； CCK-8法對細胞毒性小； CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。 Cell Counting Kit-8（CCK-8）

28、CCK8的缺點的缺點： p 與MTT法相 比，CCK8的價格比較貴。 p CCK8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏 加或多加。 幾種常用生物活性測試方法簡介 1、各種癌細胞系按適宜的細胞濃度，50uL/孔體積鋪板384孔板， 37培養(yǎng)過夜， 處理。 2、化合物稀釋: 先將化合物用DMSO溶解成10mM儲存液，并用DMSO 3倍梯度稀 釋成10個濃度梯度，成1000化合物系列濃度儲存液，再轉(zhuǎn)移至化合物轉(zhuǎn)移儀器 適配384 PP板中備用。 3、利用化合物轉(zhuǎn)移儀器Liquid Handler Echo520將1000系列濃度化合物轉(zhuǎn)移至癌 細胞384孔板的相應(yīng)孔中，

29、每孔50nL，空白對照孔加入50nL DMSO。輕柔混勻， 37繼續(xù)培養(yǎng)。 4、72小時后加入CCK8細胞增殖毒性檢測試劑，3uL/孔，37孵育2小時。然后 用酶標儀檢測450nm光吸收強度。 Cell Counting Kit-8（CCK-8） BDR4相關(guān)化合物抗癌細胞活性體外篩選方法相關(guān)化合物抗癌細胞活性體外篩選方法 幾種常用生物活性測試方法簡介 檢測方法MTT法XTT法WST-1法CCK8法 甲臢產(chǎn)物的水溶性 差（需加有機溶 劑溶解） 好好好 產(chǎn)品性狀粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液 使用方法配成溶液后使用現(xiàn)配現(xiàn)用即開即用即開即用 檢測靈敏度高很高很高高 檢測時間較長較短較短最短 檢測波長56

30、0-600nm420-480nm420-480nm430-490nm 細胞毒性高，細胞形態(tài)完 全消失 很低，細胞形態(tài) 不變 很低，細胞形態(tài) 不變 很低，細胞形態(tài) 不變 試劑穩(wěn)定性一般較差一般很好 批量樣品檢測可以非常適合非常適合非常適合 便捷程度一般便捷便捷非常便捷 細胞水平活性測試方法 檢測細胞增殖檢測細胞增殖/ /毒性測試方法比較毒性測試方法比較 幾種常用生物活性測試方法簡介 Sulforhodamine B（SRB） SRB（即磺酰羅丹明B， Sulforhodamine B）是一種粉紅色陰離子染料，易溶 于水，在酸性條件下可特異性地與細胞內(nèi)組成蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合;在515 nm波長下產(chǎn)生吸收峰，吸光值與活細胞數(shù)成線性正相關(guān)，故可用作細胞數(shù)的 定量檢測。 SRB法以