病理制片技術(shù)手冊(cè)

1、病理制片技術(shù)手冊(cè)第一章病理標(biāo)本的接收第二章組織固定第三章取材第四章組織脫水第五章包埋第六章組織石蠟切片第七章常規(guī)染色第八章封片第九章冷凍切片的制作第十章常用特殊染色第十一章常用試劑及染液的配制第一章病理標(biāo)本的接收病理標(biāo)本的接收是在取材、固定組織前首先要做的第一步工作，它是臨床與病理科交接的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，它為開(kāi)展病理學(xué)檢查、病理檔案的保存奠定了基礎(chǔ)。標(biāo)本接收程序如下。1首先核對(duì)病理申請(qǐng)單與標(biāo)本上的紅色號(hào)碼是否一致。2核查病理申請(qǐng)單上寫(xiě)明的送檢標(biāo)本及數(shù)目是否與實(shí)際送檢標(biāo)本一致。3觀察送檢標(biāo)本的大小及固定液比例是否合適。(1)穿刺活檢及纖支鏡所取的小標(biāo)本，4中性甲醛(10中性福爾馬林)固定組織的量應(yīng)

2、在610倍。(2)對(duì)于較大的手術(shù)切除標(biāo)本，應(yīng)及時(shí)切開(kāi)固定；核對(duì)后將病理申請(qǐng)單和標(biāo)本編上病理標(biāo)本號(hào)。4將病人姓名、性別、年齡、病歷號(hào)、科別、臨床診斷、部位、標(biāo)本來(lái)源、標(biāo)本例數(shù)等逐項(xiàng)錄入電腦存儲(chǔ)。5作為病理資料不僅要做好計(jì)算機(jī)錄入工作，還須進(jìn)行文字登記，以便病理檔案長(zhǎng)期保存。第二章組織固定一、固定的目的和意義活體組織一旦停止血液循環(huán)和物質(zhì)代謝就會(huì)因物質(zhì)代謝障礙產(chǎn)生一系列的生物化學(xué)和組織化學(xué)改變，并導(dǎo)致形態(tài)學(xué)上可見(jiàn)的細(xì)胞器變化和細(xì)胞組織的形態(tài)改變直至腐敗自溶。固定的目的就是要通過(guò)使用化學(xué)和物理的方法，盡可能地保存組織細(xì)胞離體時(shí)具有的生理和病理形態(tài)結(jié)構(gòu)及生物化學(xué)和免疫化學(xué)成分。良好的固定是制作優(yōu)秀病理

3、切片的基礎(chǔ)，也是特殊染色、組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)和組織原位分子雜交等技術(shù)方法賴以成功的基礎(chǔ)。因此，在病理技術(shù)工作中必須高度重視固定的質(zhì)量。二、組織固定的注意事項(xiàng)1及時(shí)取材：由于甲醛對(duì)組織的平均穿透速度只有0.8 mm/h，因此手術(shù)切除的送檢標(biāo)本應(yīng)及時(shí)切開(kāi)進(jìn)行取材，以便保證重要的鏡檢部位能及時(shí)地得到固定。2及時(shí)固定：完成取材的組織塊應(yīng)立即投入固定液以便盡可能地保存組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗原性。3液量充分：一般情況下要求固定液的量應(yīng)為組織體積的610倍。4適度固定：現(xiàn)代固定的要求是，在良好保存組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的同時(shí)盡可能較好地保存組織細(xì)胞的抗原性。長(zhǎng)時(shí)間的固定會(huì)導(dǎo)致某些組織抗原性的逐漸喪失，因此，適

4、時(shí)固定可以在保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)和抗原性之間取得必要的平衡。對(duì)于較大的送檢標(biāo)本而言，在及時(shí)切開(kāi)固定的基礎(chǔ)上，應(yīng)盡可能在24 h以內(nèi)取材進(jìn)入組織脫水程序。5適宜溫度：低溫可以降低固定的速度，反之可以加快固定進(jìn)程。在自動(dòng)組織脫水機(jī)上可以施加恒定的溫度使得在有限的時(shí)間內(nèi)可以完成固定過(guò)程。一般情況下應(yīng)將固定溫度控制在3638。6適當(dāng)攪拌：在自動(dòng)組織脫水機(jī)上可以通過(guò)使用攪拌和試劑循環(huán)功能使固定過(guò)程在標(biāo)本與試劑充分接觸的條件下完成。三、固定液的選擇影響標(biāo)本固定的因素很多，如組織與固定液的比例、固定時(shí)間、固定溫度等；除此之外，固定液本身也很重要，若所選固定液不當(dāng)，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類、核酸等成分將會(huì)有不同程度地?fù)p失。

5、固定劑最好隨配隨用，并注意其濃度和酸堿度。因此根據(jù)實(shí)際工作的目的，選用合適的固定液非常重要。下面是一些常用固定液的配制方法及適用范圍。1單純固定液(1)4中性甲醛固定液：最常用的固定液，能滿足常規(guī)HE及免疫組化、PCR等工作。一般無(wú)特殊要求的病理標(biāo)本均適用。尤其值得注意的是，中性甲醛是以pH 7274的磷酸緩沖液為溶劑配制的，其固定效果及對(duì)組織抗原性的保存均優(yōu)于一般的4甲醛固定液。此固定液配制后應(yīng)密封并保存在陰涼處，保存時(shí)間不超過(guò)一個(gè)月。 甲醛(40%) 100 ml 無(wú)水磷酸氫二鈉 6.5 g磷酸二氫鈉 4.0g 蒸餾水 900 ml(2)乙醇固定液：使用時(shí)以8095的濃度為宜，具有硬化、固

6、定、脫水等作用，對(duì)組織滲透力較弱，因此很少單獨(dú)使用，但其保存組織中的核酸強(qiáng)于中性甲醛，故常用于有核酸操作的實(shí)驗(yàn)或檢查，如果用于證明尿酸結(jié)晶和保存糖原，可用100%乙醇固定組織。(3)4的多聚甲醛：主要用于培養(yǎng)細(xì)胞的固定。2混合固定液(1)乙醇一甲醛(乙醇福爾馬林，AF)固定液：適用于皮下組織中肥大細(xì)胞的固定。該固定液有固定兼脫水作用，固定后的標(biāo)本可直接入95乙醇脫水。甲醛(40) 100 ml 95乙醇 900 ml(2)B5(醋酸鈉一升汞一甲醛)固定液：多用于固定淋巴組織。染色前應(yīng)進(jìn)行脫汞沉淀處理。無(wú)水醋酸鈉 1.25 g 升汞 6.0 g 蒸餾水 90 ml 使用前加入甲醛 10 ml(3

7、)Bouin固定液：特別適用于睪丸活檢組織的固定。Bouin液對(duì)組織固定較均勻，收縮很少，不會(huì)使組織變硬變脆。需現(xiàn)配現(xiàn)用。飽和苦味酸水溶液(約1.22%) 75 ml 甲醛 25 ml 冰醋酸 5 ml(4)Carnoy固定液：穿透能力強(qiáng)，可很好的固定細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，特別適合于固定外膜致密的組織，亦適用于糖原及尼氏小體的固定。無(wú)水乙醇 60 ml 氯仿 30 ml 冰醋酸 10 ml(5)Zenker固定液：經(jīng)此液固定的標(biāo)本，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色頗為清晰，但成本較昂貴且需特殊處理汞。該固定液要避免接觸陽(yáng)光，以免引起化學(xué)變化而失效。升汞 5.0 g 重鉻酸鉀 2.5 g 硫酸鈉 1.0g蒸餾水(加

8、至) 100 ml四、操作方法臨床醫(yī)師切取標(biāo)本后，應(yīng)盡快將標(biāo)本置于盛有足夠量固定液的容器內(nèi)，盡量避免可能出現(xiàn)固定不及時(shí)或不充分導(dǎo)致標(biāo)本干涸或腐敗，無(wú)法進(jìn)行切片制作。病理科工作人員驗(yàn)收標(biāo)本后，必須對(duì)臨床初步固定的標(biāo)本及時(shí)進(jìn)行規(guī)范的處理：對(duì)于穿刺及胃腸鏡所取的小標(biāo)本，直接添加中性甲醛，添加的量應(yīng)610倍于標(biāo)本體積；對(duì)于較大的手術(shù)切除標(biāo)本應(yīng)呈書(shū)頁(yè)狀切開(kāi)、有包膜的標(biāo)本切開(kāi)固定，切開(kāi)的厚度1 cm左右，為了保存標(biāo)本的原有大體形態(tài)，切開(kāi)時(shí)最好不要完全斷開(kāi)，兩切面之間用脫脂棉或紗布隔開(kāi)，然后放人610倍體積的固定液中完全淹沒(méi)。特殊標(biāo)本特殊處理：如脾臟或淋巴結(jié)等包膜較厚，固定劑滲透力有限，應(yīng)切薄薄的一小片單獨(dú)

9、固定，對(duì)于宮頸錐切標(biāo)本及胃腸等空腔器官應(yīng)及時(shí)釘板展開(kāi)固定。固定到取材的時(shí)間應(yīng)視標(biāo)本的大小及切面的厚度而定，小標(biāo)本應(yīng)不少于4 h,大標(biāo)本不少于18 h。第三章 取材一、概念取材是將送檢標(biāo)本進(jìn)行客觀描述并將病變部位組織切成厚薄適度的小片后裝入小盒(進(jìn)入組織脫水程序)，取材至關(guān)重要。二、取材環(huán)境取材室由取材臺(tái)、記錄桌、標(biāo)本陳列架、電腦查詢等組成；取材臺(tái)應(yīng)有良好的排風(fēng)、進(jìn)出水系統(tǒng)，配備齊全的刀、剪、鑷、尺等基本工具和備用固定劑，記錄桌應(yīng)備有打號(hào)機(jī)(無(wú)時(shí)應(yīng)用鉛筆)、記錄紙張、標(biāo)本小盒及盒蓋等，標(biāo)本陳列架應(yīng)存放、拿取方便、排風(fēng)良好，電腦查詢應(yīng)與登記臺(tái)和醫(yī)師診斷記錄結(jié)果的計(jì)算機(jī)相連。三、操作1首先進(jìn)行核對(duì)：

10、記錄者拿出一份申請(qǐng)并唱出病理號(hào)，取材醫(yī)師按病理號(hào)拿出一份標(biāo)本，核對(duì)無(wú)誤后唱出申請(qǐng)單編號(hào)，記錄者核對(duì)無(wú)誤后念出申請(qǐng)單上填寫(xiě)的取材部位和送檢標(biāo)本份數(shù)及具體塊數(shù)，取材醫(yī)師核對(duì)無(wú)誤后對(duì)標(biāo)本進(jìn)行具體描述。2對(duì)送檢標(biāo)本的觀察和描述：可分為活檢小標(biāo)本(包括經(jīng)內(nèi)窺鏡獲取的黏膜組織、淺表或深在部位的穿刺物、子宮腔刮取物、經(jīng)微創(chuàng)手術(shù)由器官或腫瘤中切取的不完整組織等)和手術(shù)大標(biāo)本。(1)小標(biāo)本檢查：描述送檢標(biāo)本的數(shù)量(量少時(shí)精確計(jì)數(shù))、大小(量少時(shí)精確測(cè)量，量多時(shí)聚堆測(cè)量體積)、色澤、形狀以及質(zhì)地等。(2)大標(biāo)本檢查：檢查切除標(biāo)本的手術(shù)類型。測(cè)量標(biāo)本的大??；描述標(biāo)本的形狀、色澤、有無(wú)包膜或被膜及質(zhì)地，必要時(shí)(如內(nèi)分

11、泌腫瘤)要在切開(kāi)標(biāo)本前稱重；帶有臟器的標(biāo)本還應(yīng)注意檢查病變與有關(guān)臟器的比鄰關(guān)系。按操作規(guī)范切開(kāi)檢查標(biāo)本切面，如實(shí)性區(qū)域觀察色澤、質(zhì)地、紋理、有無(wú)出血壞死以及腫瘤肉眼浸潤(rùn)深度和范圍；囊性區(qū)域觀察囊腫壁的厚度、內(nèi)外表面、內(nèi)容物及其性狀等。注意各系統(tǒng)臟器大體檢查的特殊要求。必要時(shí)繪制簡(jiǎn)圖說(shuō)明標(biāo)本大體特點(diǎn)和解剖關(guān)系，也可進(jìn)行表面及剖面攝影，以保存大體資料。3組織取材：按病理診斷和研究的目的和要求，從標(biāo)本上切取適當(dāng)大小和數(shù)目的組織塊，供后續(xù)制片和顯微鏡下觀察用于診斷以及相關(guān)研究。取材的一般原則如下。(1)認(rèn)真地進(jìn)行大體檢查，準(zhǔn)確選取病變部位。(2)顯示病變?nèi)?，切取有代表性的病變區(qū)域組織，包括病變周邊相

12、對(duì)正常的組織和壞死組織等；對(duì)有腫瘤的標(biāo)本應(yīng)包括切緣、腫瘤包膜及轉(zhuǎn)移部位等。(3)組織塊的面積通常為2.0 cmX1.5cm，厚度不超過(guò)3.0mm。太大太厚的組織塊常會(huì)固定不充分，而影響脫水和制片。組織塊的數(shù)量依具體情況而定，一般以滿足診斷和相關(guān)研究需要為準(zhǔn)。(4)骨或鈣化組織需要先經(jīng)脫鈣處理；腔道器官及囊壁組織應(yīng)立埋。4記錄：大體檢查和取材要由具備一定經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師進(jìn)行，應(yīng)配備人員進(jìn)行記錄。記錄人員負(fù)責(zé)如下事宜。(1)每例標(biāo)本在病理醫(yī)師進(jìn)行大體檢查和取材前，與其共同核對(duì)該例標(biāo)本份數(shù)、內(nèi)容、病變特征及其標(biāo)志是否與申請(qǐng)單相關(guān)內(nèi)容一致。(2)病理醫(yī)師在進(jìn)行大體檢查和取材時(shí)，記錄人員根據(jù)申請(qǐng)單向醫(yī)師報(bào)

13、告病人基本情況、術(shù)中所見(jiàn)、送檢醫(yī)師特殊要求等，并如實(shí)清楚地將病理醫(yī)師口頭描述記錄于記錄單上，必要時(shí)繪制簡(jiǎn)圖顯示大體所見(jiàn)及標(biāo)示取材部位。(3)病理醫(yī)師取材完畢后，與其共同核實(shí)取材內(nèi)容，確保組織塊及其編號(hào)標(biāo)簽準(zhǔn)確置人脫水盒內(nèi)，并在記錄單和取材工作單上簽名并簽署日期。5注意事項(xiàng)(1)核對(duì)要認(rèn)真，描述要客觀，取材要準(zhǔn)確。(2)每例標(biāo)本取材前后，均應(yīng)用流水徹底清洗取材臺(tái)面和所有相關(guān)器物，避免交叉污染。(3)細(xì)小標(biāo)本取材時(shí)可用伊紅點(diǎn)染并用濾紙包裹，嚴(yán)防標(biāo)本丟失。(4)大標(biāo)本取材大小要適當(dāng)(組織塊的面積通常為2.0cm1.5cm，厚度不超過(guò)3.0mm)(5)取材刀刃要鋒利，避免使用鈍刀或齒鑷過(guò)度擠壓組織，取

14、材動(dòng)作要輕柔，不可來(lái)回切割或過(guò)度牽拉組織，以免組織結(jié)構(gòu)變形或內(nèi)部細(xì)胞脫落。(6)組織塊切面應(yīng)平整，如有線結(jié)和鋼絲應(yīng)拔除。(7)所取組織應(yīng)包括各臟器的重要結(jié)構(gòu)或全層。(8)特殊標(biāo)本要在取材前照相留資料。第四章 組織脫水組織經(jīng)固定后會(huì)有大量水分，組織脫水是用某些溶劑逐漸將組織內(nèi)的水分置換出來(lái)，以利于透明劑和石蠟的滲入。一、手工脫水1器械準(zhǔn)備：大標(biāo)本缸6個(gè)，浸蠟用金屬缸3個(gè)，脫水籃，恒溫烤箱。2日常工作程序見(jiàn)表51。表51 手工脫水日常工作程序表51 手工脫水日常工作程序試劑濃度溫度時(shí)間設(shè)定中性緩沖甲醛4%3.00h乙醇80%1.00h乙醇90%1.00h乙醇95%過(guò)夜無(wú)水乙醇I2.00h無(wú)水乙醇2

15、.00h二甲苯一無(wú)水乙醇體積比為1:130min二甲苯I30min二甲苯1.00h石蠟601.00h石蠟601.00h石蠟601.00h3注意事項(xiàng)(1)所用標(biāo)本缸要大一些，達(dá)到組織塊與液體比610倍。(2)固定液、脫水劑要勤更換，可以采用前移更換。(3)二甲苯時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，不要超過(guò)2 h。(4)石蠟溫度不得高于60。(5)所有程序應(yīng)每間隔05 h搖動(dòng)23次以利于固定脫水浸蠟徹底。二、半自動(dòng)脫水機(jī)半自動(dòng)脫水機(jī)日常工作程序可參考全手工脫水日常工作程序進(jìn)行。梯度乙醇的脫水時(shí)間加長(zhǎng)。注意事項(xiàng)同手工脫水。三、全自動(dòng)密閉式脫水機(jī)全自動(dòng)密閉式脫水機(jī)有控制面板、處理槽、石蠟箱和試劑柜四個(gè)部分。為保證組織處理無(wú)

16、刺激味道，全自動(dòng)密閉式脫水機(jī)還設(shè)有活性炭過(guò)濾器。 (1)控制面板有顯示屏和小鍵盤，可由此輸入20個(gè)不同的處理程序，可設(shè)置處理時(shí)間和溫度，可啟動(dòng)P/V循環(huán)(壓力和真空交替)和混合循環(huán)，出現(xiàn)故障時(shí)有報(bào)警提示。(2)處理槽是組織塊進(jìn)行處理的容器。(3)石蠟箱可將熔化的石蠟保持在設(shè)定的溫度待用。(4)試劑柜裝有處理試劑。1日常工作程序見(jiàn)表52。表52 全自動(dòng)密閉式脫水機(jī)脫水日常工作程序溶液百分濃度 時(shí)間設(shè)定溫度 （）P/V循環(huán)（壓力和真空交替）混合循環(huán)中性緩沖甲醛液42.00h35乙醇801.00h乙醇951.00h乙醇951.00h乙醇951.00h乙醇1001.00h乙醇1001.00h乙醇100

17、1.00h二甲苯1000.50h二甲苯1001.00h石蠟1.00h60石蠟1.00h60石蠟1.00h60石蠟1.00h60注：截止時(shí)間為1/8：00 am2雙休日工作程序：脫水程序及各試劑的所用時(shí)間及功能相同，只將截止時(shí)間調(diào)至3/8:00 am即可。3外檢小標(biāo)本工作程序見(jiàn)表53。表53全自動(dòng)密閉式脫水機(jī)外檢小標(biāo)本工作程序試劑濃度（）時(shí)間設(shè)定溫度（）P/V循環(huán)（壓力和真空交替）混合循環(huán)中性甲醛42.00h35乙醇801.00h乙醇951.00h乙醇951.00h乙醇951.00h乙醇10030min乙醇10030min乙醇10030min二甲苯10020min二甲苯10020min石蠟30m

18、in60石蠟30min60石蠟1.00h60石蠟1.00h60注：截止時(shí)間為18：00am4小動(dòng)物組織工作程序見(jiàn)表54。表54全自動(dòng)密閉式脫水機(jī)小動(dòng)物組織工作程序溶液百分濃度（）時(shí)間設(shè)定溫度（）P/V循環(huán)（壓力和真空交替）混合循環(huán)中性甲醛42.00h35乙醇800.50h乙醇950.50h乙醇950.50h乙醇950.50h乙醇1000.50h乙醇1000.50h乙醇1001.00h二甲苯10020min二甲苯10020min石蠟0.50h60石蠟0.50h60石蠟1.00h60石蠟1.00h605大動(dòng)物組織(如狗、兔、猴)：可以同外檢組織使用一個(gè)程序。6脫水程序運(yùn)行完畢后處理。(1)先按泵出

19、按鈕將石蠟抽回缸內(nèi)，再打開(kāi)處理槽將組織塊取出。(2)將處理槽內(nèi)及槽蓋上的余蠟擦凈。(3)將底部中央過(guò)濾器螺絲擰開(kāi)，將管道口的蠟擦凈，擰緊螺絲。(4)蓋上蓋后，按清洗按鈕清洗。7全自動(dòng)密閉式脫水機(jī)的注意事項(xiàng)。(1)固定液每三天更換一次，組織塊為600800塊。組織固定的好壞直接影響切片質(zhì)量。為達(dá)到組織固定徹底的目的，可使用脫水機(jī)的PV循環(huán)和混合循環(huán)功能，也可將溫度定在3840。(2)梯度乙醇脫水劑每星期更換一次，組織塊約為10001200塊。方法是將第二缸的80乙醇倒棄，以后的95乙醇和無(wú)水乙醇依次前移。只將最后一缸的無(wú)水乙醇更換為新液。這樣更換不但節(jié)約了乙醇，更重要的是如果脫水劑全部更換為新液

20、就會(huì)產(chǎn)生過(guò)脫水，組織發(fā)脆。經(jīng)過(guò)幾次脫水后的乙醇，濃度雖然只降低了510，但脫水過(guò)程中置換出的細(xì)胞外液、組織液等可減弱乙醇的脫水能力。因此實(shí)際工作過(guò)程中須根據(jù)組織塊的多少、脫水劑的使用時(shí)間合理設(shè)定脫水劑的脫水時(shí)間、PV循環(huán)和混合循環(huán)功能。(3)透明劑二甲苯1015天更換一次。第一缸二甲苯倒棄，第二缸前移至第一缸，第二缸更換為新液。二甲苯起媒介作用，將無(wú)水乙醇置換出又使石蠟很好地浸入組織內(nèi)。如果透明時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、強(qiáng)度過(guò)大(如PV循環(huán)和混合循環(huán)全程使用)就會(huì)產(chǎn)生透明，以致組織發(fā)脆發(fā)干不利于切片。所以透明劑設(shè)定的時(shí)間、PV循環(huán)和混合循環(huán)的使用要有機(jī)配合。(4)所用石蠟要干凈無(wú)雜質(zhì)，熔點(diǎn)5860。使用一定時(shí)

21、間后，倒棄二甲苯含量過(guò)高的第一缸石蠟，將后三缸石蠟依次前移，最后一缸換新鮮石蠟。石蠟溫度設(shè)定為60，這樣的溫度可避免小標(biāo)本浸蠟因溫度過(guò)高而發(fā)脆。(5)脫水機(jī)要放置干燥通風(fēng)房間，防止陽(yáng)光直射顯示屏。最好配置一臺(tái)不間斷電源(UPS)，防止瞬間斷電影響機(jī)器使用。(6)使用全自動(dòng)密閉式脫水機(jī)要防止過(guò)脫水，過(guò)透明。第五章包埋一、意義組織塊經(jīng)過(guò)固定、脫水、透明、浸蠟等處理后，用包埋劑(如石蠟、樹(shù)脂、塑料等)將其包制成含組織塊的蠟塊或塑料塊等的過(guò)程稱為包埋。不同的包埋方法有不同的要求，經(jīng)包埋后，組織可達(dá)到一定的硬度和韌度，有利于切成理想的薄片。二、包埋步驟先將熔化的石蠟注入包埋托內(nèi)(模具)，而后用鑷子將經(jīng)過(guò)

22、浸蠟的組織塊從脫水盒中取出，放入包埋托中央，放在小冷臺(tái)上，用鑷子輕按組織塊，以達(dá)到組織塊平整，蓋上脫水盒底，再加好石蠟，移至冷凍臺(tái)上，待冷凍好后，卸下組織蠟塊待切。包埋時(shí)應(yīng)根據(jù)組織的不同，選擇大小型號(hào)適合的包埋托；有要求直立包埋的組織要用鑷子將組織固定在蠟塊中央稍停片刻，以使組織在蠟?zāi)龝r(shí)立住，達(dá)到立埋的要求。三、注意事項(xiàng)1每次夾取組織塊時(shí)，鑷子用乙醇燈加熱至溫度適中。2包埋托內(nèi)不要有水、碎蠟等異物，以免影響包埋質(zhì)量。3包埋蠟的溫度要控制好，包埋蠟的熔點(diǎn)應(yīng)為5860。4包埋蠟加入少量蜂蠟(蜜蠟)，可以增加韌度，利于切片。5夾取組織塊放人包埋托內(nèi)時(shí)，一定要注意包埋面。6包埋好的蠟塊，用刀修整時(shí)，一

23、定要適當(dāng)保留蠟塊中組織周邊的白蠟邊，以利于連續(xù)切片。7每包埋完一塊組織，鑷子必須擦干凈或用乙醇燈燒。四、自動(dòng)包埋機(jī)簡(jiǎn)介自動(dòng)包埋機(jī)是對(duì)組織經(jīng)脫水、浸蠟后進(jìn)行包埋處理的設(shè)備。有多種類型，其設(shè)計(jì)具有人性化，一般整機(jī)由包埋部分和冷凍部分組合而成(一體化簡(jiǎn)潔緊湊)，全自動(dòng)程序控制，具有延時(shí)自動(dòng)開(kāi)機(jī)功能，加熱快速，溫控準(zhǔn)確，安全可靠，包埋效果好等特點(diǎn)，冷臺(tái)最低溫度可達(dá)一5，可進(jìn)行快速冷凍處理包埋塊，具有大冷臺(tái)，冷凍面積大，可放置超大包埋盒或多個(gè)包埋盒。包埋部分溫度可以從5570，可儲(chǔ)存35 L石蠟，自動(dòng)熔解石蠟，可容納70100個(gè)樣品包埋盒。金屬板表面容易清洗，有2個(gè)加熱的抽屜，可收集多余的石蠟，進(jìn)行重新

24、利用，避免石蠟浪費(fèi)。具有冷卻鑷子架，方便使用。可配放大鏡利于小活檢標(biāo)本的包埋；可配腳踏：石蠟注入由腳踏開(kāi)關(guān)控制或上手工控制。所有溫度和工作時(shí)間參數(shù)全部由程序控制，記憶功能配有備用電池，這使病理組織學(xué)實(shí)驗(yàn)室的工作更為靈活。這種獨(dú)特的結(jié)合使當(dāng)前組織學(xué)和病理組織學(xué)實(shí)驗(yàn)包埋技術(shù)達(dá)到了新的水平。是創(chuàng)新發(fā)展的石蠟包埋技術(shù)和智能化高水準(zhǔn)工藝的完美結(jié)合。第六章組織石蠟切片組織經(jīng)石蠟包埋后制成的蠟塊，用切片機(jī)制成切片的過(guò)程為石蠟切片法。石蠟切片法現(xiàn)使用的切片機(jī)有平推式切片機(jī)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)兩種。一、平推式切片機(jī)石蠟切片法1切片前的準(zhǔn)備：清洗過(guò)的載物片(或免清洗的)，毛筆，鉛筆，小竹片，水槽，霧化器，攤片器，切片刀

25、，刀架。2切片制作步驟：刀架的粗削部放在頭端，在切片機(jī)刀架部夾緊。組織蠟塊裝在切片機(jī)蠟塊固定器上夾緊。右手握切片機(jī)刀頭運(yùn)動(dòng)手柄，左手轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)蠟塊運(yùn)動(dòng)旋鈕。先轉(zhuǎn)動(dòng)此鈕，后平拉刀架運(yùn)動(dòng)手柄，進(jìn)行粗削，直至組織切全。停止，將刀架移到細(xì)削部，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)蠟塊運(yùn)動(dòng)旋鈕，后拉刀架手柄進(jìn)行細(xì)削。削至組織光滑發(fā)亮，右手拿毛筆掃凈刀架及蠟塊上的蠟屑，組織屑，放下毛筆，再用右手握住刀架運(yùn)動(dòng)手柄。左手拿小竹片，用竹片頭蘸一下水槽中的水。左手中指搬動(dòng)薄切鈕，霧化器的噴頭對(duì)準(zhǔn)蠟塊。右手拉刀架運(yùn)動(dòng)手柄。左手中的小竹片在蠟塊空白處等待切片刀切起蠟片一端挑起粘住，隨切片刀移動(dòng)，完整的蠟片切出后，粘在竹片上，移入水槽中，撈片，放

26、在攤片器上攤片5 min后，裝在染色籃上，放入75烤箱烤片。3注意事項(xiàng)(1)無(wú)冷臺(tái)的病理科可以將包埋好的組織蠟塊放到冰箱內(nèi)，但如放置時(shí)間過(guò)久溫度太低切片時(shí)蠟塊會(huì)產(chǎn)生熱漲，切片會(huì)厚，要多切幾張，后面的片子就會(huì)薄一些。(2)霧化器是去除靜電的，但也有增加切片厚度的缺陷。尤其霧氣大時(shí)，使蠟塊熱漲，厚度增加更明顯。為了保證切片厚度，一定要控制好風(fēng)力、霧力。霧化器使用自來(lái)水，水位控制在30刻度。(3)切片機(jī)使用前一定要檢查各部位情況。先檢查固定器是否固定在你所要的厚度上。切片機(jī)刀架角度與蠟塊呈90。從蠟塊右上角進(jìn)刀。二、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)石蠟切片法1切片前的準(zhǔn)備：清洗過(guò)的載玻片、毛筆、鉛筆、盛有30乙醇的小燒

27、杯、牙科鑷、展片槽、切片機(jī)、一次性刀片及刀架。檢查輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片厚度的鈕是否固定于你所要切的厚度刻度上。2切片制作步驟：將放在5冷臺(tái)上的組織蠟塊裝在切片機(jī)固定器上夾緊，空白蠟多的一端在上。將切片刀固定一端為粗削部，左手旋動(dòng)蠟塊推動(dòng)器，右手旋動(dòng)切片機(jī)把手。先搖動(dòng)蠟塊推動(dòng)器，后搖動(dòng)切片機(jī)機(jī)頭半輪上下運(yùn)動(dòng)，進(jìn)行粗削，一進(jìn)一削，直至組織切全。而后將切片刀移至另一端進(jìn)行細(xì)削，削至蠟塊光滑平整。用毛筆將其刀架、蠟塊面清掃干凈。左手持毛筆，右手整輪轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)手柄進(jìn)行切片。將毛筆貼于刀架背不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)，輕輕托起連片的蠟片。右手停止轉(zhuǎn)動(dòng)機(jī)頭，換持牙科鑷，夾住連片蠟片頭端，放入盛30乙醇的燒杯內(nèi)。用牙科鑷去除不好的

28、蠟片。放入水溫4550水槽內(nèi)展片后撈片。3注意事項(xiàng)(1)無(wú)冷臺(tái)的病理科可以將包埋好的組織蠟塊放到冰箱內(nèi)，但如放置時(shí)間久溫度太低注意切片時(shí)蠟塊會(huì)產(chǎn)生熱漲，切片會(huì)厚，要多切幾張，后面的片子就會(huì)薄一些。(2)為了能夠連片，蠟塊兩端要有空白蠟。多的一端放在上面。(3)展片槽溫度不要過(guò)高，有時(shí)會(huì)有小組織塊散漂在水面上造成污染。可用手紙折成與水槽寬度相同水面行走，將組織屑撈走。第七章常規(guī)染色蘇木精(hematoxylin)和伊(eosin)染色方法，簡(jiǎn)稱HE染色方法，是生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)與組織學(xué)最廣泛應(yīng)用的染色方法。在病理科稱為常規(guī)染色方法。病理學(xué)的診斷都是以HE方法為基礎(chǔ)的。染色的目的是把組織切片或細(xì)胞涂片

29、等浸入染料及其他染色劑配成的染色液中，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和處理，使組織或細(xì)胞及其他成分染上不同深淺的顏色，產(chǎn)生不同的折射率，從而便于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察和研究。進(jìn)行染色前進(jìn)行染色液的配制，應(yīng)根據(jù)工作量的多少配制相應(yīng)量的染液，同時(shí)應(yīng)注意溶液種類的選擇、溶液濃度、pH值等，另外也應(yīng)注意配方的合理選擇。在實(shí)際工作中，應(yīng)做到以下幾點(diǎn)。(1)保持染液的清潔，應(yīng)經(jīng)常過(guò)濾或更換。(2)染色時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織的種類、染液的新舊及特殊要求而決定。(3)染色環(huán)境溫度對(duì)染色效果也有著密切的影響，故染色時(shí)間必須依據(jù)不同條件靈活掌握。(4)脫蠟干凈與否對(duì)染色效果有著重要影響，烤片溫度、脫蠟二甲苯的溫度、二甲苯的新舊和二甲苯脫蠟

30、的時(shí)間長(zhǎng)短都與染色有著密切關(guān)聯(lián)。(5)標(biāo)本脫水的好壞及固定的充足與否對(duì)染色效果影響極大。(6)切片染色后，經(jīng)梯度乙醇脫水，若每步的時(shí)間不足易造成切片發(fā)霧、模糊不清，影響診斷。在染色過(guò)程中，既要按常規(guī)方法步驟進(jìn)行操作，也應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況、個(gè)人經(jīng)驗(yàn)靈活運(yùn)用，不斷總結(jié)，才能熟練掌握并提高實(shí)際工作能力與效率。一、人工染色人工染色已使用近百年，至今還在使用，既古老又實(shí)用。人工染色的設(shè)置因地區(qū)的差異設(shè)置也不同，但大多數(shù)的地方基本一樣。石蠟切片HE人工染色程序(見(jiàn)表81)。 表81人工染色程序液體設(shè)置175恒溫烤箱烤片20 min2二甲苯I25 min3二甲苯25 min4二甲苯25 min5無(wú)水乙醇I1mi

31、n6無(wú)水乙醇1min795乙醇I1min895乙醇1min985%乙醇1min1080%乙醇1min1170%乙醇1min12自來(lái)水水洗3次，將水控凈13蘇木精?5min14自來(lái)水水洗3次15l鹽酸乙醇分化35s16自來(lái)水水洗3次17O5氨水返藍(lán)18自來(lái)水水洗3次191伊紅水溶液1min20自來(lái)水水洗3次2170%乙醇1min2280%乙醇1min2395%乙醇I1min2495%乙醇1min25無(wú)水乙醇I1min26無(wú)水乙醇1min27無(wú)水乙醇1min28二甲苯I1min29二甲苯1min30二甲苯擱置至封片2注意事項(xiàng)(1)石蠟切片放入恒溫箱中烤片，溫度不可過(guò)低或過(guò)高，以75為宜，否則在染色

32、過(guò)程中容易發(fā)生脫片。(2)組織切片脫蠟要經(jīng)二甲苯三次才能徹底。切片從恒溫箱取出后應(yīng)趁熱浸入二甲苯以利于徹底脫蠟。使用一段時(shí)間后，第一缸二甲苯融的蠟較多應(yīng)倒棄，其后的二甲苯依次前移，最后一缸換新鮮的二甲苯。(3)切片經(jīng)70乙醇后入蘇木精染液前，必須自來(lái)水水洗3次，最后1次最好用蒸餾水水洗并控干。這樣可以保證Harris蘇木精染色能力持久，而不會(huì)因?yàn)榈蜐舛纫掖嫉幕旌隙^(guò)早的喪失染色能力。(4)Harris蘇木精染液配制的好壞直接影響切片染色質(zhì)量。好的蘇木精染液500 ml正常染色能力為2500張左右。為保證染色質(zhì)量應(yīng)及時(shí)更換染液。(5)蘇木精染液要經(jīng)常過(guò)濾以保證染色清潔而不在切片上有染色渣的出現(xiàn)。

33、(6)鹽酸乙醇分化液配制參見(jiàn)本書(shū)第十二章。分化時(shí)間可根據(jù)分化液的新舊適當(dāng)調(diào)整，新的分化液時(shí)間短些。分化的目的就是讓該染上要清晰地染上，而不該著色的一定要分化掉。(7)氨水返藍(lán)液濃度不可過(guò)高，返藍(lán)時(shí)間不可過(guò)高，不要過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)發(fā)生脫片現(xiàn)象。(8)1伊紅水溶液是理想的胞漿染液。要選擇好水溶性的伊紅染料使胞質(zhì)鮮艷一些，切片不但漂亮且利于觀片。(9)切片染色后的脫水要充分，每道乙醇脫水的時(shí)間不要過(guò)短，尤其是三道無(wú)水乙醇更為如此。無(wú)水乙醇要勤更換。(10)切片經(jīng)最后一次無(wú)水乙醇后盡快地放人二甲苯中。在夏季室內(nèi)濕度較大的環(huán)境中更是如此。如切片在濕度大的空氣中停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)就會(huì)在封片時(shí)產(chǎn)生霧氣，而不能現(xiàn)片。其

34、原因是無(wú)水乙醇吸收了空氣中的水汽，在二甲苯中難以分離析出，當(dāng)用中性樹(shù)膠封片后，二甲苯揮發(fā)，而水汽留在膠中產(chǎn)生霧氣。(11)封片所使蓋玻片需大小合適、清潔。樹(shù)膠用量視蓋玻片大小而定，要求不發(fā)生溢膠或缺如。(12)不提倡切片經(jīng)無(wú)水乙醇，然后干燥，直接用中性樹(shù)膠封固。這樣會(huì)產(chǎn)生人為的細(xì)小黑點(diǎn)，與細(xì)胞核相似。(13)封片要在通風(fēng)廚中進(jìn)行，防止二甲苯污染工作間，危害技師的身體。二、自動(dòng)染色機(jī)自動(dòng)染色機(jī)是近幾年才引進(jìn)的病理自動(dòng)儀器，在病理制片過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，它可以連續(xù)進(jìn)行染色，自動(dòng)記憶，染色效果好，質(zhì)量控制到位。起到了手工無(wú)法比擬的作用。1液體設(shè)置：由于機(jī)器為電腦控制，染液順序及液體的設(shè)置根據(jù)染色

35、機(jī)所設(shè)置的染色缸多少來(lái)調(diào)配。染色機(jī)基本模擬手工方法，利用機(jī)器手來(lái)完成操作程序見(jiàn)表82。表82機(jī)染程序的液體設(shè)置二甲苯二甲苯二甲苯無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇95%乙醇85%乙醇水水水水水烤箱65停機(jī)報(bào)警取籃處二甲苯二甲苯二甲苯無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇95%乙醇85%乙醇伊紅1% 氨水1% 鹽酸乙醇蘇木精裝機(jī)2注意事項(xiàng)(1)工作前先檢查染液及試劑，并開(kāi)啟電源。(2)開(kāi)啟進(jìn)水開(kāi)關(guān)。(3)調(diào)試好所需的染色程序，根據(jù)蘇木精一伊紅的新舊來(lái)調(diào)整時(shí)間。(4)將切片染色籃放人染色機(jī)后按提示鍵即可按程序進(jìn)行染色。(5)聽(tīng)到提示音響后，取出已染好的切片染色籃進(jìn)行封片。(6)工作完成后，關(guān)閉電源，關(guān)掉水源，并蓋好染色缸。(7)染色機(jī)配

36、制的無(wú)水乙醇及95乙醇的程序比手工程序少，但不影響染色效果，因機(jī)械手在提升時(shí)有抖動(dòng)作用，帶的液體很少。(8)定期取出活性碳過(guò)濾網(wǎng)晾曬保證使用。(9)工作結(jié)束后一定要取出鹽酸乙醇，以免長(zhǎng)期放在機(jī)器內(nèi)，腐蝕機(jī)器。第八章 封片封片是將組織切片封固保存于載玻片與蓋玻片之間，使之不與空氣發(fā)生接觸，防止其氧化、褪色，利于鏡檢觀察及保存。一、手工封片手工封片應(yīng)注意以下七點(diǎn)。(1)所用樹(shù)膠濃度要適中，以一般速度滴下并恰能成珠既可。太稀時(shí)易溢出玻片，當(dāng)二甲苯揮發(fā)后，組織切片就會(huì)收縮產(chǎn)生膠不勻并出現(xiàn)大片氣泡。太濃時(shí)，滴在玻片上樹(shù)膠不易散開(kāi)，易產(chǎn)生氣泡，難以驅(qū)除，并影響折光率。(2)樹(shù)膠用量多少應(yīng)根據(jù)組織大小、厚薄

37、而定。(3)應(yīng)迅速敏捷滴膠。(4)封片時(shí)，切片上應(yīng)保留適當(dāng)?shù)亩妆?，以防干封，產(chǎn)生氣泡。(5)為防止氣泡，封片時(shí)，樹(shù)膠不宜攪動(dòng)。(6)如遇有小氣泡時(shí)可用鑷子輕壓蓋玻片，排除氣泡。(7)封片時(shí)，若離面部較近，鼻、口呼出的氣體會(huì)有水分造成切片云霧狀甚至模糊不清，需引起注意。二、機(jī)器膠帶封片機(jī)機(jī)器膠帶封片機(jī)不用樹(shù)膠，只用少量二甲苯即可封片。使用方便，切片診斷后即可歸檔，不會(huì)因樹(shù)膠不干造成粘片等。使用封片機(jī)時(shí)，首先檢查二甲苯瓶，并檢查滴液分注量，檢查膠帶可用量、選擇膠帶長(zhǎng)短規(guī)格，檢查接片筐是否安裝到位。工作時(shí)開(kāi)通電源，并打開(kāi)過(guò)濾網(wǎng)開(kāi)關(guān)。工作完成后，關(guān)閉2個(gè)電源，擦拭機(jī)器。三、機(jī)器蓋玻片封片機(jī)機(jī)器蓋玻片

38、封片機(jī)采用模擬人工手法來(lái)完成封片工作。使用機(jī)器封片，封片效率高、質(zhì)量好，同時(shí)可減少封片對(duì)技術(shù)人員身體的傷害。其操作步驟為如下。(1)接通電源，打開(kāi)開(kāi)關(guān)，機(jī)器進(jìn)行白檢后，指示燈變綠即可工作。(2)將染色完成的染色籃準(zhǔn)確的放人封片機(jī)內(nèi)。(3)按動(dòng)開(kāi)始鍵，封片機(jī)進(jìn)入工作狀態(tài)。(4)封片結(jié)束后報(bào)警，即可取出封好的切片。機(jī)器蓋玻片封片機(jī)的蓋玻片采用2440、2450、2460等規(guī)格的蓋片(目前國(guó)產(chǎn)免洗蓋玻片已代替進(jìn)口，使用效果良好)。第九章 冷凍切片的制作一、概述冷凍切片是利用物理降溫的方法將新鮮的組織標(biāo)本冷凍使其產(chǎn)生一定的硬度進(jìn)行切片的技術(shù)方法。與石蠟切片相比，由于冷凍切片不需脫水包埋因此制片速度快，

39、是為手術(shù)進(jìn)行中的臨床醫(yī)師提供病理診斷的良好方法。此外由于冷凍切片的標(biāo)本是未經(jīng)固定的新鮮組織，因此冷凍切片也是脂肪染色、酶組織化學(xué)染色以及某些免疫組織化學(xué)染色和原位分子雜交的理想制片方法。冷凍切片的不足是組織細(xì)胞的形態(tài)略遜于石蠟切片。二、冷凍切片的制作方法利用氯乙烷噴灑、二氧化碳噴射、半導(dǎo)體制冷的方法均可制作普通的冷凍切片，用于術(shù)中的病理診斷。恒冷箱冷凍切片機(jī)可以制作適用于各種目地的冷凍切片，是目前最為常用的理想冷凍切片制片方式。1.冷凍切片的技術(shù)操作方法(1)將恒冷箱冷凍切片機(jī)的速凍頭和箱內(nèi)溫度調(diào)整到適宜的切溫度，一般情況下為一18一25。(2)在標(biāo)本冷凍托上涂布一層冷凍包埋劑一OCT，然后將

40、取材后新鮮標(biāo)本安放在標(biāo)本冷凍托上并用OCT覆蓋標(biāo)本。(3)標(biāo)本冷凍完成后將標(biāo)本托固定在切片機(jī)的機(jī)頭上，調(diào)整機(jī)頭位置使其恰好位于切片刀的后方。(4)使用粗切削方式進(jìn)行標(biāo)本的粗切削至暴露標(biāo)本的最大平面，使用自動(dòng)推進(jìn)方式連續(xù)切削23刀后用毛筆清除機(jī)頭、標(biāo)本托及切片刀上的組織碎屑。(5)調(diào)整并確認(rèn)切片的厚度，一般為48 um，染脂肪和神經(jīng)組織應(yīng)控制在1225 um。(6)放下防卷板使防卷板的位置恰好與切片刀的刀刃完全平行并略突出于刀刃。(7)以自動(dòng)推進(jìn)的方式進(jìn)行切片，良好的切片將在防卷板的下方形成一張完整平整的薄片，如切片略有彎曲可用小毛筆輕輕展平切片。(8)打開(kāi)防卷板，用載玻片平穩(wěn)地輕壓切片使其平整

41、地吸附到載玻片上。三、冷凍切片的染色切好的冷凍切片立即投入丙酮中進(jìn)行固定，一般固定12 min即可進(jìn)行染色，用于免疫組化染色的冷凍切片應(yīng)在切片略干時(shí)即刻投入冷甲醇中固定1015 rmin然后進(jìn)行相應(yīng)的組織化學(xué)染色程序。1冷凍切片的HE染色程序。(1)切片在丙酮中固定12 min。(2)水洗5 s。(3)使用新鮮的Harris蘇木精染液染細(xì)胞核2min。(4)水洗5 s。(5)在0.5的鹽酸乙醇液中分化13 s。(6)水洗5 s。(7)在0.51的伊紅染液中染細(xì)胞質(zhì)2030 s。(8)水洗5 s。(9)在95乙醇I、95乙醇、100乙醇I、100乙醇、中逐級(jí)脫水各35 s。(10)甲苯I、二甲苯

42、透明各5 s。(11)干組織周圍的二甲苯，在二甲苯尚未干燥前滴加光學(xué)樹(shù)脂膠封片。四、注意事項(xiàng)1提倡使用新鮮蘇木精染色液：高質(zhì)量的冷凍切片和良好的染色，是病理醫(yī)師為在手術(shù)中的外科醫(yī)師提供病理診斷的重要手段。為了在短時(shí)間內(nèi)獲得高質(zhì)量的HE染色冷凍切片，在保證高質(zhì)量冷凍切片的同時(shí)使用新鮮的蘇木精染色液是保證高質(zhì)量染色的重要前提。2.防卷板的調(diào)整：正確地調(diào)整使用冷凍切片機(jī)的防卷曲板是獲得平展完整冷凍切片的重要手段，防卷曲板的正確位置是與切片刀的刀刃平行并略微突出于刀刃。如防卷曲板過(guò)度突出于刀刃會(huì)造成切片機(jī)頭上的組織與防卷曲板相撞，如防卷曲板低于刀刃會(huì)造成切片向上卷曲不能形成平整的切片。在調(diào)試時(shí)可從下向

43、上逐步提高防卷曲板的位置，每提高一點(diǎn)切一張切片測(cè)試，直至切片能在防卷曲板下形成完整平展的切片。正確位置 防卷曲板低于刀刃 防卷曲板過(guò)于突出 3.防止污染：切片污染是病理組織制片的大忌，在冷凍切片進(jìn)行粗切削完畢后必須用毛筆清理碎屑，以防止其他標(biāo)本的組織碎片沾染到正在進(jìn)行切片的標(biāo)本上。4不同組織的切片溫度調(diào)整：不同組織冷凍切片的冷凍溫度調(diào)整原則是，柔軟稚嫩富含水分的組織選擇相對(duì)較高的溫度，較為致密富含脂肪的組織選擇相對(duì)較低的溫度。柔軟稚嫩富含水分的組織選擇較低的溫度易造成切片呈碎屑狀，而致密富含脂肪的組織選擇較高的溫度易造成切片堆積不能形成片狀。詳見(jiàn)表91。表91 部分組織冷凍切片的參考溫度值冷凍

44、溫度組織-10-15淋巴結(jié)、腎上腺、腦組織、脾臟、子宮內(nèi)膜、黏液軟骨-16-25乳腺、肺、膽囊、子宮、小腸、結(jié)腸、腎、肝臟、肌肉、胰腺、前列腺、皮膚、甲狀腺、扁桃體、軟組織腫瘤-25-50富于脂肪的乳腺組織、纖維脂肪組織、富于脂肪的皮膚組織、富于脂肪的腫瘤第十章 常用特殊染色一、六胺銀染色1第一步準(zhǔn)備工作：配制六胺銀染液，將10硝酸銀25ml倒入干凈的染色缸內(nèi)，加入2硼砂5ml，液體呈乳白色，再加入3烏洛托品40ml，染液逐漸呈透明狀。2第二步染色過(guò)程：事先把溫箱調(diào)至60備用，切片經(jīng)脫蠟至水，用1過(guò)碘酸氧化10 min，水洗，然后切片放人六胺銀染液放置60溫箱1 h，染真菌時(shí)間要相對(duì)短一些，一

45、般情況下肉眼看到染液變色，切片呈棕色時(shí)從溫箱取出染色缸，倒掉染液，自來(lái)水沖洗1min，用025氯化金調(diào)色1 min，水洗后，用3硫代硫酸鈉染5min,水洗，用蘇木精染液淺染，水洗、分化、沖水返藍(lán)，伊紅染10 s，最后經(jīng)脫水、透明、封固。3圖示結(jié)果：基底膜與毛細(xì)血管間質(zhì)性物質(zhì)、真菌呈棕黑色，核呈藍(lán)色。4注葸事項(xiàng)(1)掌握染色溫度和時(shí)間，如60染1 h，80染3040 min。(2)真菌類染色時(shí)間相對(duì)要短，染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，切片染色過(guò)深，可用分色劑處理。二、黏液卡紅染色1第一步準(zhǔn)備工作：配制黏卡染液，將稱好的胭脂1 g、氫氧化鋁1 g倒入瓶?jī)?nèi)，加入50L醇100 rnl混合搖勻，再加入氯化鋁05g，水

46、浴加溫逐漸煮沸并攪動(dòng)液體，使其充分溶解(注意染液容易外濺)，數(shù)分鐘后，染液由紅色變成透明深紫紅色，冷卻后將液體倒入量筒，再加入50乙醇至原量，過(guò)濾，放人冰箱備用。2第二步染色方法：染液使用時(shí)原液與蒸餾水比例為1：4稀釋.切片厚5 um，脫蠟至水，經(jīng)蘇木精染色2 min、水洗、分化、返藍(lán)后進(jìn)人黏卡液染色2 h以上，染液可以重復(fù)使用多次，但要適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間切片水洗后，脫水、透明、封固。3圖示結(jié)果：黏液為紅色，胞核為藍(lán)色4注意事項(xiàng)(1)染液使用時(shí)比例為1份黏卡原液，4份蒸餾水。(2)用酶消化對(duì)照染色特異性很大，消化時(shí)間為20 min。(3)配制黏卡染液時(shí)要防止液體濺出。三、石碳酸品紅染色1第一步準(zhǔn)備工作(1)配制鹽基性品紅飽和液：鹽基性品紅溶于乙醇內(nèi)。(2)配制石碳酸水溶液：將石碳酸結(jié)晶放入熱水浴溶解后取5 ml與事