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文檔簡介
1、1、外周血單個核細胞Ficoll分離:向Ficoll分層液離心管中加入稀釋的血液樣本,1500rpm , 5min離心機離心;4力擅-4HG 績KXJd.i! :4-iir&Luuji用毛細吸管輕輕插入灰白色層,沿管壁輕輕吸出該層的單個核細胞,盛入另一支離心管中,將所得的單個核細胞懸液用5倍體積的Hanks液或 RPML1640洗滌 2 次,1500rpm,5min;用細胞計數(shù)儀或血球計數(shù)板計數(shù)細胞,調整細胞至所需濃度;期胞計數(shù)阪淋巴細胞濃度濃度(細胞數(shù)/mL)二四個大方格內細胞數(shù)/4 X 10 42、 細胞凍存:小牛血清的凍存培養(yǎng)液;20%10或甘油、10%DMSO配制含1 (2)取對數(shù)生長
2、期的細胞, 用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來, 懸浮生長的細胞則直接將細胞移至 15ml 離心管中、;( 3)離心 1000rpm,5min;(4)去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液,加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液, 用吸管輕輕吹打使細胞均勻, 計數(shù),調節(jié)凍存液中細胞的最終密度為 5X 106/ml1X 107/ml;( 5) 將細胞分裝入凍存管中,每管 1 1.5 ml; (6)在凍存管上標明細胞的名稱,凍存時間及操作者;7. 凍存:標準的凍存程序為降溫速率-1-2C/ min ;當溫度達-25C以下時,可 增至-5C-10C/min ;到-100C時,則可迅速浸入液氮中。也可將裝 有細胞的凍存管放入-
3、20C冰箱2h,然后放入-80 C冰箱中過夜,取 出凍存管,移入液氮容器內。3、細胞復蘇:(1)從液氮容器中取出凍存管,直接浸入 37C溫水中,并不時搖動 令其盡快融化。(2)從37C水浴中取出凍存管,打開蓋子,用吸管吸出細胞懸液, 加到離心管并滴加 10倍以上培養(yǎng)液,混勻;( 3)離心, 1000rpm, 5min;( 4)棄去上清液,加入含 10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞,計數(shù),調整細胞密度,接種培養(yǎng)瓶,37 C培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng);( 5)次日更換一次培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。、注意事項: 4(1)從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍 存,但最好為對數(shù)生長期細胞。在凍存前一天最好換一次
4、培養(yǎng)液; ( 2)將凍存管放入液氮容器或從中取出時,要做好防護工作,以免 凍傷;(3)凍存和復蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。(4)細胞分層液應避光4 C下保存,取出后逐漸升至室溫后混勻, 方可使用,避免細菌污染。( 5)稀釋血液可降低紅細胞的凝集,提高淋巴細胞售貨量,但是如 果要保留血漿成分作為其他實驗用時, 則不能稀釋血液, 以免影響血 漿成分。5、所需材料:(1)儀器:凈化工作臺、離心機、恒溫水浴箱、冰箱(4C、-20C、 -80C)、倒置相差顯微鏡、 培養(yǎng)箱、液氮冰箱( 2)玻璃器皿:吸管(彎頭、直頭)、培養(yǎng)瓶、玻璃瓶( 250ml、 100ml)、 廢液缸(3)塑料器皿: 吸頭、槍頭、膠塞、 移液管( 10ml)、 15ml 離心凍存管(12ml)其他物品:微量加樣槍、 紅血球計數(shù)板、記號筆 、醫(yī)用橡皮膏、移 液槍( 5)試劑 :D-Hanks 液、小牛血清
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