細(xì)胞與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實驗：7基因組DNA提取與PCR擴(kuò)增技術(shù)

1、基因組DNA提取與PCR擴(kuò) 增技術(shù) 基因組DNA提取 目目 的的 v基因組DNA的制備是基因分析的前提。 v本實驗要求掌握基因組DNA提取的基本方法。 原原 理理 核內(nèi)DNA 真核細(xì)胞，以核蛋白體形式存在 線粒體DNA 裸露，不與組蛋白結(jié)合 DNA 真核細(xì)胞基因組DNA提取 裂解：使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程 純化：去除體系中的其他成分、多糖、脂類及其他不需要 的核酸（RNA）等生物大分子的過程 原原 理理 基因組DNA純化試劑盒：在高鹽的狀態(tài)下， DNA純化樹脂UltraPureTM專一性地吸附DNA；而 在低鹽或水溶液狀態(tài)下，DNA被洗脫下來。 器材與試劑器材與試劑 v臺式高速離心

2、機(jī)、水浴恒溫箱、移液槍、塑料離 心管等 v試劑盒（純化樹脂、GN結(jié)合液、漂洗液、無水乙 醇、離心純化柱 ）、超純水 操操 作作 1、培養(yǎng)細(xì)胞（Hela）一瓶，PBS洗滌一次。 2、加入PBS 0.5 ml，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至2ml 離心管（細(xì)胞刮、吸管） 3、向細(xì)胞懸液中加入1ml純化樹脂（使用前充分混勻），顛倒混勻5-6次，室 溫3min。其間要顛倒混勻1次，5000r/min離心3sec收集沉淀；(吸水紙) 4、用1mlGN結(jié)合液將純化樹脂懸浮，顛倒混勻， 5000r/min離心3sec，收 集沉淀； 6、用0.5ml漂洗液漂洗純化樹脂2次，顛倒混勻， 5000r/min離心3sec，收 集

3、沉淀； 7、用0.8ml無水乙醇懸浮，裝入離心純化柱，12000r/min離心1min，棄乙 醇液； 8、空柱再12000r/min離心1min，進(jìn)一步棄乙醇液； 9、取離心好的純化柱套入一干凈的1.5ml離心管中，加入50ul 超純水于純化 樹脂上（不能粘在管壁上），室溫下放置3min，12000r/min離心2min。 10、將離心管內(nèi)的超純水重新吸出，仍加至純化樹脂上（不能粘在管壁上） ，室溫下放置2min,12000r/min離心2min。 核酸濃度測定核酸濃度測定 DNA、RNA所含有的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵具 有吸收紫外光的性質(zhì)，吸收高峰在260nm處，所 以，可用紫外分光光度法

4、測定DNA的濃度。 v一般情況下，純凈的DNA OD260/OD280比值約為1.8。 若樣品中含蛋白質(zhì)，則比值下降，必要時需重新抽提。 vDNA用TE溶解，可增加DNA的穩(wěn)定性，便于長期保存。 （也可用超純水代替，如雜交時不能用TE，可能是與緩 沖體系相沖突） 注意事項注意事項 PCR擴(kuò)增技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR） 又稱PCR擴(kuò)增技術(shù)，是一種高效、快速、特異的 體外DNA聚合程序。 原理：體外模擬DNA的體內(nèi)復(fù)制過程。 簡述為： 在微量離心管中加入適量緩沖液，加入微量模板 DNA，四種脫氧核苷酸（dNTP），和耐熱Taq聚 合酶及兩個合成

5、的DNA引物（上游、下游），有 Mg2+存在。 實驗原理 實驗原理 v 加熱使模板DNA在高溫下（94）變性，雙鏈解鏈，這是 所謂變性階段。 v 降低溶液溫度，使合成引物在低溫（56）與模板DNA互 補(bǔ)退火形成部分雙鏈，這是所謂退火階段。 v 溶液反應(yīng)溫度升至72，在Taq酶作用下，以四種dNTP 為原料，引物為復(fù)制起點，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和 退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。 v 如此反復(fù)，在同一反應(yīng)體系中可重復(fù)高溫變性、低溫復(fù)性 和DNA合成這一循環(huán)，使產(chǎn)物DNA重復(fù)合成，并且在重復(fù) 過程中，前一循環(huán)的產(chǎn)物DNA可作為后一循環(huán)的模板DNA 而參與DNA的合成，使產(chǎn)物DNA的量按

6、2n方式擴(kuò)增。經(jīng)過 2535個循環(huán)，DNA擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)106109。 實驗?zāi)康?v 本實驗以所提取的全基因組DNA為模板，以線粒 體基因上一段核苷酸為靶目的片段，擴(kuò)增出 924bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。通過本次實驗，學(xué)習(xí)并掌握 PCR 反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)。 器材和試劑 器材器材 PCR擴(kuò)增儀，臺式離心機(jī)，加樣槍及槍頭等 器材與試劑器材與試劑 試劑試劑 1、Taq聚合酶Mix：Taq DNA 聚合酶、dNTP 、Mg2 2、引物： Primer 1(上游):5-ATGGCAAGCCAACGCCACTT-3 Primer 2(下游):5-CGTGGTTACTAGCACAGAGAGTTC-3 3、無菌d3H2O 4、模板DNA：為本次實驗所提取的全基因組 DNA 和病人基因組DNA 操作操作 v超純水 10.5ul v引物1 0.5ul v引物2 0.5ul v模板DNA 1ul vTaq酶等 12.5ul 混勻后，瞬時離心后，放入PCR儀 總體積25ul 操作操作 PCR擴(kuò)增條件擴(kuò)增條件的設(shè)定的設(shè)定： 設(shè)置PCR擴(kuò)增儀的熱蓋溫度為100 v預(yù)變性：945min v循環(huán)： 94變性30s 56退火30s 30個循環(huán) 72延伸40s v末次延伸