4751.茶葉提取物抗補體活性初步研究 論文

1、畢 業(yè) 論 文（設計）題 目 茶葉提取物抗補體活性初步研究 指導老師 專業(yè)班級 生物技術(shù)及應用0701 姓 名 學 號 2010年 5 月 30 日摘要 在8種植物提取物中篩選出一種有較好抗補體活性成分植物（茶葉），然后再對該植物進行活性成分濃度與抗補體活性效果關(guān)系研究，以便為茶多酚新用途提供參考。研究主要利用超聲波對植物抗補體活性成分提取制備，再運用抗補體溶血活性檢測方法篩選與檢測具有抗補體活性成分植物和抗補體活性效果；研究結(jié)果表明，8種植物中杭白菊和綠茶具有較好的抗補體活性成分，粗提物溶血活性ch50檢測值分別為0.152、0.535mg/ml，對茶多酚分離提純后三個成分98%茶多酚（eg

2、cg為45%）、egcg及咖啡堿的溶血活性ch50檢測值分別為0.353、0.451mg/ml，咖啡堿沒有抗補體活性效果；由此可以初步得出茶多酚為較好的抗補體活性成分，但抗補體活性效果的主導成分不是egcg，而且粗提物抗補體活性更好。關(guān)鍵詞：茶多酚；抗補體活性；溶血活性檢測；茶葉；清熱解毒目 錄引言.11材料.21.1實驗材料.21.2實驗試劑.21.3實驗儀器.22方法.22.1八種植物提取物制備.22.2茶葉抗補體活性成分分離.22.3補體經(jīng)典途徑的溶血活性(ch50)測定.22.3.1溶液配制.32.3.2補體制備及效價測定.32.3.3藥物經(jīng)典途徑抗補體活性測定. 33.結(jié)果與分析.3

3、3.1八種植物提取效果的比較.43.2八種植物抗補體初步篩選.43.3茶葉抗補體活性測定結(jié)果.44. 結(jié)果與討論.5參考文獻.7引言補體系統(tǒng)是人體重要的免疫防御系統(tǒng)之一。補體系統(tǒng)的正常激活在消滅外來微生物、清除肌體內(nèi)損傷或死亡的細胞和組織以及維持機體的平衡中起著重要的作用。與補體激活相關(guān)的疾病如心肌死、腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、sars等，均是發(fā)病群體數(shù)量巨大、危害性強的疾病。目前臨床上廣泛使用的糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑雖然對某些與補體過度激活相關(guān)的疾病有一定治療作用，但由于該類藥并非專一的補體抑制劑，選擇性差，長期應用會降低機體的防御機能，產(chǎn)生多種副作用和并發(fā)癥。因此臨床上急需高效低毒專一的新型補

4、體抑制劑。國內(nèi)外已完成部分天然產(chǎn)物的篩選，發(fā)現(xiàn)自然界中廣泛存在的某些多糖、黃酮、甾類掃萜類化合物具有顯著的抗補體活性。本文將對幾種天然產(chǎn)物類抗補體活性成分的測定1。自然界中廣泛存在具有抗補體作用的活性成分，直接從植物中研究開發(fā)天然補體抑制成分的成本低，且大多數(shù)活性成分作為藥用植物的一部分可以直接被機體消化吸收，因此天然產(chǎn)物中高教低毒的新型補體抑制劑的研究與開發(fā)受到國內(nèi)外學著的廣泛關(guān)注。 茶葉中含有大量的茶多酚，茶多酚是茶葉中具有生物活性的重要成分之一，是一類存在于茶葉中的多羥基酚性化合物的混合物。研究表明，茶多酚不僅是一種天然的無毒抗氧化劑，也是一種理想的天然藥物，具有多種保健功能和藥理作用，

5、可以清除自由基，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗紫外線照射、防治心血管病、除臭、延緩衰老、抗齲護齒、抗腫瘤、多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)和抗輻射等作用。杭白菊為“浙八味”之一。其作為一常用藥具有疏風清熱、平肝明目的功效，用于風熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花?，F(xiàn)代藥理學研究證明，杭白菊主要含有黃酮類化合物、揮發(fā)油、綠原酸、維生素等成分，其中杭白菊總黃酮2。豆腐柴具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降血脂、抗腫瘤等功能清熱解毒、消腫止血等功效，民間常用來治療蛇毒咬傷、無名腫毒、創(chuàng)傷出血等。不僅僅是以上這幾種植物，從文獻中得知麥冬、溫郁金、這些“浙八味”還有蘆薈、鴨趾草、艾草等植物，均具有清涼解毒，抗自由基等作用。1材料

6、1.1實驗材料麥冬、溫郁金、鴨趾草，購于杭州新城醫(yī)院；杭白菊、綠茶、蘆薈，購于下沙物美超市；豚鼠，新西蘭兔，上海復旦大學實驗動物部提供：1.2實驗試劑bbs、2%srbc、巴比妥、溶血素、30%的酒精。1.3實驗儀器微波提取器（njl07-3，實驗室專用微波爐）；低溫高速離心機(jonan mr22i型， jouan公司，法國)；酶標儀(well scan mk3，thermo labsystems公司，芬蘭)；恒溫振蕩器(wmzk 8002，上海醫(yī)用儀器廠)；冷凍干燥器(freezedryerl8型，labconco公司，美國；2方法2.1八種植物提取物制備3稱取綠茶250g用微波真空提取（

7、80-90，時間:30min，料液比1:10）提取兩次合并濾液抽濾用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成膏狀放到干凈的鋁盒真空干燥。豆腐柴、麥冬、溫郁金、杭白菊、蘆薈、艾草、鴨趾草，7種提取方法同綠茶提取方法相同。2.2 茶葉抗補體活性成分分離4稱取綠茶500克30%酒精超聲提取兩次，每次30分鐘過濾離心孔徑0.45m微孔濾膜過濾截留分子量5000及1000超濾膜過濾濃縮大孔樹脂吸附不用濃度的酒精溶液洗脫濃縮、凍干茶多酚固體檢測。2.3 補體經(jīng)典途徑的溶血活性(ch50)測定2.3.1溶液配制5,6 巴比妥緩沖液配制：先配制出5倍濃縮巴比妥緩沖液(5bbs)。使用時稀釋成巴比妥緩沖液(bbs)。2羊紅細胞(srb

8、c)配制：取綿羊血2ml，用bbs洗滌，800r/min，離心3min，重復3次后，再3000r/min。離心10min壓積，然后用bbs配成2%srbc。1:1000溶血素配制：用bbs配制成1:1000溶血素溶液。綠茶溶液配制：稱取茶多酚4mg，用bbs超聲溶解成1:1溶液(5mg/ml)，加bbs對倍稀釋配成1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128共8個濃度的供試品溶液。2.3.2補體制備及效價測定7,9豚鼠股動脈取血約10ml，4放置1h凝固后，800r/min，離心5min，取血清，加入以bbs洗滌后的2%srbc約2ml，混勻后，800r/min，離心5mi

9、n，取上清液作為補體分裝，-70冷凍保存?zhèn)溆?。補體經(jīng)典溶血系統(tǒng)的建立：取補體(豚鼠血清)0.1ml，加入bbs配制成1:10溶液，用bbs對倍稀釋成1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640和1:1280溶液。取1:1000溶血素、各濃度補體及2%srbc各0.1ml溶于0.3mlbbs中，混勻，37水浴30min后，在5000r/min，4條件下離心10min分別取上清0.2ml ，在405nm測定吸光度。實驗同時設置全溶血組(0.1ml2%srbc溶于0.5ml三蒸水中)。以三蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標準，計算溶血率。以補體稀釋度為x 軸，溶血百分率為y軸作圖。選

10、擇達到高溶血率的最低補體濃度作為確保體系能正常溶血所需的臨界補體濃度。2.3.3藥物經(jīng)典途徑抗補體活性測定10,11 取確定的臨界濃度的補體與供試品混勻，按照表1加入適量bbs、溶血素和2 % srbc。37水浴30min 后，5000r/min，4條件下離心10min后分別取每管上清液0.2ml，用酶標儀在405nm下測定吸光度。實驗同時設置8種提取物對照組，補體組和全溶血組。3. 結(jié)果與分析3.1八種植物提取效果比較 通過八種植物的提取過程中發(fā)現(xiàn)有的提取物很粘（如溫郁金）不容易過濾，有的干燥后的質(zhì)量不是大，在對比之下要選著，容易過濾，干燥后質(zhì)量較大的。提取物干燥后的質(zhì)量比較如表3.1。表3

11、.1 八種植物提取物干燥后的質(zhì)量比較植物名稱鋁盒重量（g）干燥后鋁盒重量（g）提取物質(zhì)量（g） 豆腐柴37.853044.31296.4599麥冬46.311551.69575.3842溫郁金46.238057.784611.5466杭白菊16.551722.40485.8531蘆薈34.879235.09041.7888綠茶34.302038.02293.7209艾草37.69840.12382.4258鴨趾草33.848235.98392.1357對比表格中得出溫郁金、豆腐柴、麥冬、綠茶的提取物重量較大，但是考慮到溫郁金、豆腐柴、麥冬這三種濃縮液較粘，不易過濾。3.2八種植物抗補體活性初步

12、篩選 在八種植物提取物的提取和干燥后，然后再對這幾種植物提取物進行抗補體活性進行分析，驚奇的發(fā)現(xiàn)只有綠茶和杭白菊具有抗補體活性，但是茶多酚的抗補體活性為0.152mg/ml，杭白菊的抗補體活性為0.535mg/ml，相比之下茶多酚的活性較為理想。3.3茶葉抗補體活性的測定結(jié)果在對綠茶提取進行分離檢測后得到：茶多酚含量為98%，egcg含量為45%。試驗的同時把粗提取的茶多酚和純的egcg還有咖啡堿也進行了抗體活性的檢測。結(jié)果如表3.2、3.3、3.4。表3.2茶多酚經(jīng)典途經(jīng)溶血實驗中所加各成分的體積(ml)分組bbs三蒸水補體茶多酚溶血素2%srbc茶多酚測定0.2- 0.10.3530.10

13、.1茶多酚對照0.5-補體組 0.3- 0.1-0.10.1全溶血組-0.5-0.1表3.3egcg經(jīng)典途經(jīng)溶血實驗中所加各成分的體積(ml)分組bbs三蒸水補體egcg溶血素2%srbcegcg測定0.2- 0.10.4510.10.1egcg對照0.5-補體組 0.3- 0.1-0.10.1全溶血組-0.5-0.1表3.4咖啡堿經(jīng)典途經(jīng)溶血實驗中所加各成分的體積(ml)分組bbs三蒸水補體咖啡堿溶血素2%srbc咖啡堿測定0.2- 0.1-0.10.1咖啡堿對照0.5-補體組 0.3- 0.1-0.10.1全溶血組-0.5-0.1從表格中得出茶多酚的egcg含量為43%，抗補體活性為0.3

14、53mg/ml，純的egcg是0.451mg/ml，咖啡堿則為0mg/ml次發(fā)現(xiàn)并不是egcg的含量越高抗體的活性越大。4 總結(jié)與討論在八種植物提取物中篩選出一種有較好抗補體活性成分植物（茶葉），然后再對該植物進行活性成分濃度與抗補體活性效果關(guān)系研究，以便為茶多酚新用途提供參考。研究主要利用超聲波對植物抗補體活性成分提取制備，再運用抗補體溶血活性檢測方法篩選與檢測具有抗補體活性成分植物和抗補體活性效果；研究結(jié)果表明，8種植物中杭白菊和綠茶具有較好的抗補體活性成分，粗提物溶血活性ch50檢測值分別為0.152、0.535mg/ml，對茶多酚分離提純后三個成分98%茶多酚（egcg為45%）、eg

15、cg及咖啡堿的溶血活性ch50檢測值分別為0.353、0.451mg/ml，咖啡堿沒有抗補體活性效果；由此可以初步得出茶多酚為較好的抗補體活性成分，但抗補體活性效果的主導成分不是egcg，而且粗提物抗補體活性更好。一開始總以為具有抗自由基、抗輻射、抗自由基的egcg在抗補體活性中占主導地位，試驗的結(jié)果推翻了原有的想法，而綠茶在本次試驗中得出被認為是具有較好的抗補體活，同時它的抗補體活性的具體跟什么有關(guān)，我的猜想是跟茶多酚的濃度、還是茶葉里面的其他有效成分有關(guān)，有待于具體研究，同時我也希望有人能對他的作用靶點和具體機制待進一步試驗闡明。自然界中廣泛存在有較強抗補體作用的活性成分，種類多樣，結(jié)構(gòu)各

16、異，直接從天然產(chǎn)物中開發(fā)的補體抑制劑還有成本低的優(yōu)點，但本文得出來了并不是所有的天然產(chǎn)物都具有抗補體活性，但有些植物確實具有較好的抗補體活性，此外，大多數(shù)活性成分作為藥用植物的一部分可以直接被機體消化吸收，說明從天然產(chǎn)物中開發(fā)出高效、低毒的補體抑制劑是可能的，預示著天然產(chǎn)物類補體抑制劑將有良好的應用前景。參考文獻1章蘊毅，張建文，陳道峰天然產(chǎn)物中的抗補體活性成分j中國天然藥物，2007，5(5)：322-3252馬榮粒，黃叢林茶用菊花研究進展j北方園藝，2009，102(8)：151-1543王文平，李琳野木瓜水溶性多糖的分離提取純化及其抗體活性研究j貴陽中醫(yī)學院學報，2008，31(1)：120-1234陳鶴立高效液相色譜法測定茶葉中茶多酚及咖啡堿含量j福建醫(yī)藥雜志，2006，8(1)：80-815王黔云，熊郁良眼鏡蛇毒高活性抗補體因子的體外溶血活性研究j中國藥理學通報，2009，19(8)：909-9136吳顏，吳甘霖半支連多糖抗補部體活性研究