Inoue法制備超級感受態(tài)細(xì)胞

1、Inoue法制備超級感受態(tài)細(xì)胞越干凈越好，越冷越好將洗干凈的瓶子（500ml三角燒瓶）用Milli-Q水浸泡2-3小時，倒去燒瓶 中的水并將燒瓶倒扣在吸水紙上 2-3分鐘。用Milli-Q水配置250ml LB液體培養(yǎng) 基。咼壓火菌。準(zhǔn)備兩盒1.5mlEP管，每盒中放置兩張吸水紙，共約兩百個。咼壓火菌。于早晨7-8點鐘小搖菌種，挑取單菌落于5mlMilli-Q水配置且滅菌的LB液 體培養(yǎng)基（無抗性）中，37C培養(yǎng)12小時以上（0D600大于1.5）。可以用一 個新的50ml進(jìn)口離心管（costa, BD等品牌都可以）來搖細(xì)菌。晚上10點鐘左右，按1: 100大搖細(xì)菌。超靜臺內(nèi)吸取2.5ml小搖

2、細(xì)菌于 高壓滅菌的250ml培養(yǎng)基（無抗性）中，18-22C, 200rpm搖過夜。第二天上午測量細(xì)菌 0D600值。Top10,Jm109等生長速度快的細(xì)菌約在上 午9點左右0D600達(dá)到0.55左右，DH5a則要到下午4-6點鐘（新手可以多搖 幾瓶細(xì)菌，梯度接菌，如1: 50, 1: 100, 1: 200等，哪瓶到了用哪瓶，其它 的可以狠心倒掉）。將0D600達(dá)到0.55的細(xì)菌置于冰上10min （0D600在0.4-0.8之間都可以， 對結(jié)果影響不大）。4C, 4000rpm, 10min集菌（用新的50ml進(jìn)口離心管）。超靜臺內(nèi)棄上清，將管倒扣在事先滅好的吸水紙上，巨大力向下?lián)舸颍M

3、 可能去掉剩余LB每管倒入10ml預(yù)冷的Inoue轉(zhuǎn)化緩沖液，擰緊蓋子。在冰上來回滑動重懸 細(xì)菌（重懸的時間與向下?lián)舸虻牧Χ群蛠砘鼗瑒拥乃俣认嚓P(guān)，這兩者于感受態(tài) 效率沒有直接關(guān)系）。超靜臺內(nèi)向每管倒入約30ml預(yù)冷的Inoue轉(zhuǎn)化緩沖液，來回顛倒混勻。4C, 4000rpm, 10min集菌。超靜臺內(nèi)棄上清，將管倒扣在事先滅好的吸 水紙上（換一張吧，別用剛才那張），巨大力向下?lián)舸颍M可能去掉剩余緩沖 液。每管倒入 10ml 預(yù)冷的 Inoue 轉(zhuǎn)化緩沖液，擰緊蓋子。在冰上來回滑動重懸 細(xì)菌。超靜臺內(nèi)向每管加入750DMS Q輕輕來回混勻（記住要輕輕）。置于冰 上 10min。將冰浴的感受態(tài)細(xì)胞分裝到事先滅菌后并放到 -20或4C的EP管中，一個 一個丟到液氮罐里，然后凍到-80 （分裝的體積是愛分多少分多少，建議 100 gl 每管，傳說液氮速凍可以提高 5 倍的感受態(tài)效率）。按人品的好壞，感受態(tài)效率在 108-107不等。溶液配置：0.5M PIPES100mlPIPES15.1狎5M KOH調(diào)pH到6.7,然后用0.45卩謚勺濾膜過濾除菌。（PIPES以乎有PIPES酸和PIPES鹽之分，如果你配好溶液后，測量的 pH大 于6.7,千萬不要驚慌，可以用 HCI調(diào)回到6.7,不影響結(jié)果的）Inoue 轉(zhuǎn)化緩沖液 1000mlMnCl2.4H2O10.88gCaCl2.2H2