質(zhì)粒DNA的提取純化與鑒定

1、質(zhì)粒DN如勺提取、純化與鑒定姓名 宿智新科目 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院學(xué)號(hào) 201100140155班級(jí) 11 級(jí)生工 2 班 第 8 組質(zhì)粒 DNA的提取、純化與鑒定 摘要：本實(shí)驗(yàn)利用堿變法從大腸桿菌 DH5 ( E.coli DH5 )中提取 pUC19質(zhì)粒， 旨在學(xué)習(xí)并掌握質(zhì)粒 DNA提取的原理、純化和檢測(cè)方法及瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。 同時(shí)通過(guò)對(duì)質(zhì)粒 DNA的提取、純化過(guò)程及電泳圖譜的分析，探討堿變法提取高 質(zhì)量質(zhì)粒 DNA的關(guān)鍵步驟及影響所提質(zhì)粒純度和量的相關(guān)因子。 關(guān)鍵詞：堿變法 質(zhì)粒 電泳 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?. 學(xué)習(xí)并掌握凝膠電泳進(jìn)行 DNA的分離純化的實(shí)驗(yàn)原理。2

2、. 學(xué)習(xí)并掌握凝膠的制備及電泳方法。3. 學(xué)習(xí)并掌握凝膠中 DNA的分離純化方法。4. 掌握堿變性提取發(fā)的原理及各種試劑的作用。5. 掌握堿變性法提取質(zhì)粒 DNA的方法。 實(shí)驗(yàn)原理：1. 質(zhì)粒 DNA的提取堿變性提取法：提取和純化質(zhì)粒 DNA的方法很多，目前常用的有：堿變性提取法、煮沸 法、羥基磷灰石柱層析法、 EB-氯化銫密度梯度離心法和 Wizard 法等。其中， 堿變性提取法最為經(jīng)典和常用， 適于不同量質(zhì)粒 DNA的提取。 該方法操作簡(jiǎn) 單，易于操作，一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。提取質(zhì)粒 DNA純度高，可直接用于酶 切、序列測(cè)定及分析。 EB-氯化銫密度梯度離心法，主要適合于相對(duì)分子質(zhì) 量與染色

3、體 DNA相近的質(zhì)粒，具有純度高、步驟少、方法穩(wěn)定，且得到的質(zhì) 粒 DNA多為超螺旋構(gòu)型等優(yōu)點(diǎn)，但提取成本高，需要超速離心設(shè)備。少量提 取質(zhì)粒 DNA還可用沸水浴法、 Wizard 法等，沸水浴法提取的質(zhì)粒 DNA中常 含有 RNA，但不影響限制性核酸內(nèi)切酶的消化、亞克隆及連接反應(yīng)等。堿變性法提取質(zhì)粒 DNA一般包括三個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞以擴(kuò)增質(zhì) 粒；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒 DNA。在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體 DNA以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，質(zhì)粒 DNA以共價(jià)閉合環(huán) 狀形式存在。細(xì)胞破碎后，染色體 DNA和質(zhì)粒 DNA均被釋放出來(lái)，但兩者變 性與復(fù)性所依賴(lài)的溶液 pH 值不同。在 pH值高達(dá) 1

4、2.0 的堿性溶液中，染色 體 DNA氫鍵斷裂， 雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性； 共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA的大部分 氫鍵斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈不完全分離。當(dāng)用 pH 值 4.6 的 KAc(或 NaAc)高鹽 溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時(shí)， 變性的質(zhì)粒 DNA可恢復(fù)原來(lái)的共價(jià)閉合環(huán)狀超 螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中； 但染色體 DNA不能復(fù)性， 而是與不穩(wěn)定的大分子 RNA、蛋白質(zhì) -SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見(jiàn)的白色絮狀沉淀。這種沉 淀通過(guò)離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒 DNA分離。溶于上清的質(zhì)粒 DNA，可 用無(wú)水乙醇和鹽溶液， 減少 DNA分子之間的同性電荷相斥力， 使之凝聚而形 成沉淀。由于 DNA與

5、RNA性質(zhì)類(lèi)似，乙醇沉淀 DNA的同時(shí)，也伴隨著 RNA沉 淀，可利用 RNase A 將 RNA降解。質(zhì)粒 DNA溶液中的 RNase A 以及一些可溶姓名 宿智新科目 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院學(xué)號(hào) 201100140155班級(jí) 11 級(jí)生工 2 班 第 8 組性蛋白，可通過(guò)酚 / 氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒 DNA。2. 凝膠電泳進(jìn)行 DNA分離純化：電泳 (electrophoresis) 是帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向著與其電荷相反的電極方 向移動(dòng)的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定 pH 條件下，可以解離成帶電荷的離 子，在電場(chǎng)中會(huì)向相反的電極移動(dòng)。凝膠是支持電泳介質(zhì)

6、，它具有分子篩效 應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場(chǎng)中，其中的電離子會(huì)發(fā)生移動(dòng)，移動(dòng)的速度可 因電離子的大小形態(tài)及電荷量的不同而有差異。 利用移動(dòng)速度差異， 就可以 區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。凝膠電泳技術(shù)操作簡(jiǎn)單而迅速，分辨率高，分辨范圍廣。此外，凝膠中 DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠 (ethidium bromide ， EB) 或 SYBR Gold染色直接觀察到，甚至含量少至 20pg 的雙鏈 DNA在紫外激發(fā) 下也能直接檢測(cè)到。需要的話，這些分離的 DNA條帶可以從凝膠中回收，用 于各種各樣目的的實(shí)驗(yàn)。

7、分子生物學(xué)中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖 (agarose) 和聚丙烯酰胺凝膠。 這兩種凝膠能灌制成各種形狀、 大小和孔徑， 也能以許多不同的構(gòu)型和方位 進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠分辨率高， 使用于較小分子核酸 (5 500bp)的分 離和蛋白質(zhì)電泳。它的分辨率非常高，長(zhǎng)度上相差 1bp 或質(zhì)量上相差 0.1% 的 DNA都可以彼此分離， 這也是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行 DNA序列分析 的分子基礎(chǔ)。雖然它能很快地進(jìn)行電泳，并能容納較大的 DNA上樣量，但是 與瓊脂糖凝膠相比， 在制備和操作上繁瑣。 瓊脂糖是從海藻中提取的長(zhǎng)鏈狀 多聚物，由 -D-吡喃半乳糖與 3,6- 脫水-L- 吡喃半乳糖組成，

8、相對(duì)分子質(zhì) 量為 104-10 5。瓊脂糖加熱至 90左右，即可溶化形成清亮、透明的液體， 澆在模版上冷卻后形成凝膠，其凝固點(diǎn)為 40-45 。瓊脂糖凝膠相對(duì)于聚丙 烯酰胺凝膠分辨率低，但它的分離范圍更大 (50 至百萬(wàn) bp) ，小片段 DNA(50-20000bp)最適合在恒定輕度和方向的電場(chǎng)中水平方向的瓊脂糖凝膠 內(nèi)電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測(cè)定DNA的相對(duì)分子質(zhì)量，分離經(jīng)限制酶水解的 DNA片段，進(jìn)一步純化 DNA等。瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而帶 有負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。 DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移率主要取 決于 6

9、個(gè)因素：樣品 DNA分子的大小、 DNA分子的構(gòu)象、瓊脂糖濃度、電泳 所用電場(chǎng)、緩沖液和溫度。主要儀器和材料試劑：1. 儀器和材料： 恒溫振蕩培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機(jī)，旋渦振蕩器，水浴鍋， 1.5mL 離心管， 50mL離心管，不同型號(hào)的吸頭，微量移液器，微波爐，電泳儀，制膠槽，電泳 槽，梳子，錐形瓶，電子天平，手套，紫外燈， Eppendorf 管等。菌體： E.coli DH5受體菌，具有 Ampr 標(biāo)記的質(zhì)粒 pUC19。姓名 宿智新科目 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院學(xué)號(hào) 201100140155班級(jí) 11 級(jí)生工 2 班 第 8 組2. 實(shí)驗(yàn)試劑：LB培養(yǎng)基，抗生素（

10、氨芐青霉素） ，溶液，溶液，溶液， RNase A母 液，TE緩沖液，飽和酚，氯仿 /異戊醇混合液，酚 /氯仿/ 異戊醇（ PCI）混合液， 預(yù)冷無(wú)水乙醇， TAE 電泳緩沖液（ 10），上樣緩沖液（ 6），瓊脂糖，溴化乙 錠（EB）,DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物 DNA Marker /Hind ，5mol/L pH 5.2 的醋 酸鈉。實(shí)驗(yàn)方法菌體培養(yǎng)1配制 40mL液體 LB 培養(yǎng)基（加入 5%葡萄糖）、 100mL固體 LB 培養(yǎng)基、并準(zhǔn)備足量的移液 管、200l微量移液器頭、1000l 微量移液器頭、50mL離心管、1.5mL 離心管，滅菌備用。（1） 注意無(wú)菌操作（2） 挑了單菌落的接

11、 種環(huán)要在三角瓶的液 避接面處研輾，瞬間 可看到菌體進(jìn)入培養(yǎng) 液造成的局部渾濁。2向液體 LB培養(yǎng)基移取 32l 氨芐青霉素，混 合均勻。3將提前活化的 E.coli DH5受體菌，接種 于液體 LB培養(yǎng)基中。將錐形瓶放入恒溫震 蕩培養(yǎng)箱中， 37， 160r/min 培養(yǎng)過(guò)夜至 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期。質(zhì)粒DNA的提取1稱(chēng)量 50mL離心管重量 W1，取30mL 菌液于已稱(chēng)重的 50mL離心管中， 配平后 7000r/min 離心 5min 。W1=13.46g2棄上清，向離心管中加入 5mL溶液 ，渦旋振蕩， 7000r/min 離心 5min。注意溶液要懸滴 5次。3棄上清并稱(chēng)重 W2，求 W=W

12、2-W1。W2=14.47g W=1.01g4按照 1.0mL/100mg 菌體的量加入 溶液，充分渦旋振蕩，置于冰 面上 10min 。加入溶液后 , 蓋好離心管 , 振蕩 至液體中無(wú)白色菌體絲狀物既已 振蕩均勻。5再按照 2.0mL/100mg 菌體的量加 入溶液，溫和顛倒混勻， （ 置 于冰面上 10min 。）（1） 可觀察到溶液變清亮透明粘 稠如蛋清狀。（2） 注意加入溶液時(shí)搖勻一定要輕柔，劇烈會(huì)導(dǎo)致基因組 DNA 斷裂；靜置時(shí)間也不能過(guò)長(zhǎng)，因 為基因組 DNA在堿性條件下會(huì)慢 慢斷裂。6然后再按照 1.5mL/100mg 菌體的 量加入溶液，溫和顛倒混勻， 置于冰面上 15min

13、。(1) 溶液出現(xiàn)白色絮狀沉淀(蛋 白質(zhì) SDS復(fù)合物、細(xì)胞碎片和其 他大分子成分)(2) 冰浴的目的是降低 DNA酶的 活性, 防止質(zhì)粒 DNA被降解。7平衡后 12000r/min 離心 15min 。取 上清至新 50mL離心管內(nèi)，記錄體 積。(1) 上清液中含大量 RNA、斷裂的 DNA片段和質(zhì)粒 DNA。(2) 此時(shí)沉淀不實(shí)，寧愿少吸上 清，也不要帶入沉淀，因?yàn)閹?的沉淀在之后操作中無(wú)法去除。加入兩倍體積的冰乙醇，混勻后 在 -20 環(huán)境下保存 30min 。取出 后12000r/min 離心 15min ，棄上 清。加入冰乙醇沉淀 DNA。加入 5mL70%乙醇， 12000r/

14、min 離 心5min ，棄上清，室溫干燥(1) 如果鈉鹽濃度高，會(huì)影響之后 的酶切反應(yīng)等，所以要進(jìn)行洗滌。 同時(shí)，若乙醇濃度過(guò)低，則會(huì)使 DNA溶解損耗。(2) 標(biāo)記好 DNA沉淀位置 , 以便下 一步的溶解。(3) 離心時(shí)注意沉淀物位置。8取出離心管， 加入 1mLTE溶液得到 粗提物，加入 RNase A液，使溶液 濃度為 150g/mL， 37保存 60-120min 。(1)TE 溶液的作用： pH 緩沖液， 為 DNA提供穩(wěn)定的生理狀態(tài)，呈 弱堿性，有利于保護(hù)堿基對(duì)。同 時(shí)含有 EDTA是二價(jià)陽(yáng)離子的螯合 劑，抑制 DNA酶作用。(2)RNase ：去除 DNA沉淀中殘留 的 RN

15、A?？颇?分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 學(xué)號(hào) 201100140155第 8 組姓名 宿智新山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院班級(jí) 11 級(jí)生工 2 班質(zhì)粒DNA的純化1取500 l 粗提物于 1.5mL離心管中，加 入等體積的飽和酚， 混勻，7000r/min 離心5min, 取上層到另一潔凈離心管 中。苯酚是強(qiáng)的蛋白阻斷劑， 可使蛋白 變性2轉(zhuǎn)移上清(體積 V1)至新管，加入等 V1的酚：氯仿：異戊醇溶液，混勻， 7000r/min 離心5min, 取上層到另一潔 凈離心管中。氯仿也是蛋白阻斷劑， 但強(qiáng)度弱于 苯酚，其主要作用是將同水以極小 比例互溶的苯酚萃取出來(lái)。 如果不 加氯仿，殘留的苯酚會(huì)阻礙酶切

16、反 應(yīng)等，且水飽和酚的密度略輕于 水，苯酚相位于上層， 不利于獲得 含質(zhì)粒的水相，加入氯仿后可以增 加比重，使得酚/ 氯仿始終在下層， 方便水相的回收3轉(zhuǎn)移上清(體積 V2)至新管，加入等 V2的氯仿：異戊醇溶液，混勻， 7000r/min 離心5min, 取上層到另一潔 凈離心管中。異戊醇可起消除抽提過(guò)程中出現(xiàn) 的泡沫，有利于分層更明顯。41 轉(zhuǎn)移上清(體積 V3)至新管，加入 10V3的3MN aAc溶液(pH5.2)，再加入 2V4 1(V4=V3+10 V 3)的冰乙醇，混勻，-20 保存 30min以上，取出后 12000r/min 離心15min。收集沉淀 DNA。5在沉淀中，加入

17、 200l 70% 乙醇， 12000r/min 離心 1min，可將離心管倒 置于紙巾上凈上清。(1) 注意不打散沉淀小心倒去上清 液。(2) 離心時(shí)注意離心管中沉淀物的 位置。(3) 盡量用大量程的槍一次吸盡上 清。6取出離心管，向一只離心管中加入 25 l TE 溶液，溶解沉淀后，轉(zhuǎn)移入另 一只離心管中，再取 25l TE 溶液加 入第一只離心管中，溶解后再移入另 一只離心管中，得到 50l 純化質(zhì)粒注意小心溫和振蕩?？颇?分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院學(xué)號(hào) 201100140155班級(jí) 11 級(jí)生工 2 班 第 8 組山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名 宿智新DNA。學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院學(xué)號(hào) 201

18、100140155班級(jí) 11 級(jí)生工 2 班 第 8 組DNA純度檢測(cè)1取40mLTA(E1)于300mL錐形瓶中，加入0.4g 瓊脂糖，放入微波爐內(nèi)使其熔化， 60時(shí)倒入 準(zhǔn)備好的制膠槽中。制膠時(shí)，膠液溫度過(guò)高， 會(huì)使模具變性，影響膠孔 大小和膠形狀，從而間接 影響加樣量和跑條帶。膠 液溫度過(guò)低，會(huì)凝固，所 以在膠液冷卻至 5060 左右倒膠。2取 5.0 l 純化 DNA加入 1.0 l 上樣緩沖液， 混合，進(jìn)行點(diǎn)樣。注意加樣時(shí)槍尖應(yīng)恰好置于液面下凝膠點(diǎn)樣孔 上方，不可刺穿凝膠，也 要防止將樣品溢出孔外。3點(diǎn)樣完畢后， 100V，200mA條件下電泳 30min。4電泳完畢后， 進(jìn)行 EB

19、染色，用凝膠成像儀拍 照，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。溴化乙錠是一種強(qiáng)致突 變劑，應(yīng)嚴(yán)格戴手套操 作！姓名 宿智新科目 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告注意事項(xiàng)1) 擴(kuò)大培養(yǎng)菌體時(shí)， 挑了單菌落的接種環(huán)要在三角瓶的液避接面處研輾， 瞬間 可看到菌體進(jìn)入培養(yǎng)液造成的局部渾濁。2) 沉淀菌體的量不要貪多， 適宜即可， 菌體過(guò)多，可能會(huì)導(dǎo)致溶液無(wú)法混勻， 細(xì)胞裂解不充分。3) 加入溶液重懸要充分， 如果細(xì)胞沒(méi)有完全散開(kāi)懸浮， 將會(huì)影響溶液裂解 細(xì)胞，最終導(dǎo)致提取產(chǎn)物中含較多的蛋白質(zhì)，染色體 DNA等雜質(zhì)。4) 加入溶液時(shí)搖勻一定要輕柔， 劇烈會(huì)導(dǎo)致基因組 DNA斷裂；靜置時(shí)間也不 能過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)榛蚪M DNA在堿性條

20、件下會(huì)慢慢斷裂。5) 使用離心機(jī)時(shí)，樣品放置要對(duì)稱(chēng)平衡，否則會(huì)嚴(yán)重?fù)p害離心機(jī)的使用壽命。6) 制膠時(shí)，膠液溫度過(guò)高，會(huì)使模具變性，影響膠孔大小和膠形狀，從而間接 影響加樣量和跑條帶。膠液溫度過(guò)低，會(huì)凝固，所以在膠液冷卻至5060左右倒膠。7) 注意加樣時(shí)槍尖應(yīng)恰好置于凝膠點(diǎn)樣孔中， 不可刺穿凝膠， 也要防止將樣品 溢出孔外。跑多個(gè)樣時(shí)，應(yīng)依次快速點(diǎn)樣，否則時(shí)間一久，樣品會(huì)彌散掉！姓名 宿智新科目 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院學(xué)號(hào) 201100140155班級(jí) 11 級(jí)生工 2 班 第 8 組8) DNA分子在高于其等電點(diǎn)的 pH 溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)，點(diǎn) 樣孔

21、在負(fù)極。注意使電泳槽中緩沖液沒(méi)過(guò)瓊脂糖凝膠2mm為宜。9) EB是一種強(qiáng)致突變劑，應(yīng)嚴(yán)格戴手套操作！實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖質(zhì)粒 DNA純度檢測(cè)凝膠成像結(jié)果凝膠電泳拍照結(jié)果標(biāo)注：1 號(hào)泳道： DNA mar k/eHrind 2 號(hào)泳道：線性的 pUC19 質(zhì)粒 DNA3 號(hào)泳道：超螺旋狀態(tài)的 pUC19 質(zhì)粒 DNA4 至 15泳道： 1至 12組的 pUC19質(zhì)粒 DNA16 泳道：加葡萄糖培養(yǎng)的線性的 pUC19 質(zhì)粒山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名宿智新學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院班級(jí) 11 級(jí)生工 2 班科目分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)號(hào) 201100140155第 8 組DNA17 泳道：隔夜菌株培養(yǎng)的線性的 pUC19 質(zhì)粒D

22、NA18號(hào)泳道：未加 RNase A的線性的 pUC19質(zhì) 粒 DNA 以上帶是 DNA出現(xiàn)處 以上帶是線性的 pUC19 質(zhì)粒 DNA 出現(xiàn)處 處是 RNA 出現(xiàn)處 處是點(diǎn)樣槽， 其中的光斑則是代表蛋白質(zhì)各帶光斑由上向下分別代表的分子量由大 到小，各光斑的亮度則表示該物質(zhì)含量的高 低，越亮則代表濃度越高分析理論上堿變法提取質(zhì)粒 DNA 瓊脂糖凝膠電泳可能出現(xiàn)條帶情況如下 （按離 點(diǎn)樣孔遠(yuǎn)近排序 ,即電泳速度快慢排序） ：1. RNA：沒(méi)有完全裂解除去的 RNA淺條帶；觀察處各組均有 RNA殘留, 但是倆 都不是很多。2. cccDNA：共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA,即所要提取的 pUC19質(zhì)粒超

23、螺旋結(jié)構(gòu)；觀 察區(qū)域各組條帶亮度相差不多 ,因此產(chǎn)量相近 ,只有 9 號(hào)條帶幾乎觀察不到 , 對(duì)于九號(hào)后面會(huì)有專(zhuān)門(mén)的分析。各組也均有拖帶的現(xiàn)象 , 但都不是很明顯。 對(duì)于我們組 8 號(hào),個(gè)人還是比較滿(mǎn)意 ,畢竟第一次做 , 個(gè)人觀察產(chǎn)量估計(jì)是 180ng/ml 。3. ocDNA:質(zhì)粒的一條鏈斷裂，超螺旋松弛開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)。姓名 宿智新科目 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院學(xué)號(hào) 201100140155班級(jí) 11 級(jí)生工 2 班 第 8 組4. L DNA:DNA復(fù) 制中間體，即沒(méi)有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起。經(jīng)典的實(shí) 驗(yàn)教材一般認(rèn)為這條帶是線性結(jié)構(gòu)質(zhì)粒， 實(shí)際上, 這是一種誤解。

24、 正常情況 下, 堿法提取的質(zhì)粒很少有線性的 , 電泳一般不出現(xiàn)。 經(jīng)驗(yàn)也提示 , 只有一 個(gè)酶切位點(diǎn)的內(nèi)切酶切割質(zhì)粒時(shí) , 結(jié)果總是只有一條電泳條帶。 如果有線性 結(jié)構(gòu)質(zhì)粒 , 則不可能出現(xiàn)這種結(jié)果。 因?yàn)槿绻芯€性質(zhì)粒的話 , 單一酶切不 可能出現(xiàn)單一條帶。5. 染色體 DNA:如果在加入溶液后過(guò)渡振蕩，會(huì)產(chǎn)生這條帶，該帶泳動(dòng)得較 慢，是 20100Kb的大腸桿菌基因組 DNA片段, 即線上方區(qū)域 ,觀察各組條 帶均有白色暗斑 ,相對(duì)來(lái)說(shuō)我感覺(jué)我們組的 8號(hào)帶還是比較好的 ,而 5、7、16 號(hào)就比較明顯了。6. 如在點(diǎn)樣孔附近出現(xiàn)熒光， 則說(shuō)明提取的質(zhì)粒 DNA中含有較多的蛋白質(zhì)， 阻

25、礙了部分 DNA泳動(dòng)，形成熒光。觀察各組的點(diǎn)樣孔 ，5、7、11、12、 14、 16 號(hào)帶白色較明顯 ,很可能是蛋白質(zhì)去除不徹底 , 也可能是點(diǎn)樣時(shí)戳破了點(diǎn) 樣孔。我組是 8號(hào),相對(duì)來(lái)說(shuō)比較好 , 蛋白質(zhì)去除比較干凈。7. 第九組沒(méi)有提取出 pUC19的可能性分析：(1) 有的組得出了很好的結(jié)果， 作為對(duì)照，排出了菌體或?qū)嶒?yàn)方法本身等源頭 出現(xiàn)問(wèn)題，只能是自己實(shí)驗(yàn)操作出了問(wèn)題；(2) 電泳圖譜顯示出了 RNA 淺條帶，又 RNA 一直和質(zhì)粒 DNA 處于同一相， 所以不可能是將提取的質(zhì)粒誤丟；(3) 兩次電泳結(jié)果都一樣，排除點(diǎn)樣跑膠問(wèn)題；(4) 整個(gè)提取質(zhì)粒過(guò)程應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題。因?yàn)椋瑥膶?shí)際現(xiàn)象

26、上看，得到的DNA粗沉淀為乳白色，其顏色和量都正常。從理論上分析，即使是加溶液沒(méi)有 充分懸浮， 或者是加溶液和時(shí)震蕩過(guò)于激烈， 那產(chǎn)物中也應(yīng)該會(huì)有質(zhì)粒 DNA ，只是帶有較多蛋白質(zhì)，染色體 DNA 等雜質(zhì)；(5) 最大的可能性是最后一步加 1/10V 3mol/L NaAc (pH5.2 )和2V 冰乙醇沉 淀純化后的 DNA 出了問(wèn)題，因?yàn)樯锨逡翰皇前醇榷砍桃淮涡晕〕鰜?lái)的， 當(dāng)時(shí)操作人也不清楚第二次吸取的上清體積，所以就大約估計(jì)為 350ul。可 能是體積估計(jì)誤差較大，所以加入 NaAc 和冰乙醇后， Na+和乙醇濃度都沒(méi) 有達(dá)到沉淀 DNA 的標(biāo)準(zhǔn)， DNA 沒(méi)有被沉淀！討論1. 酚具

27、有腐蝕性， 能損傷皮膚和衣物， 使用時(shí)應(yīng)小心。 皮膚如不小 心沾到酚，應(yīng)立即用堿性溶液、肥皂或大量清水沖洗。2. 本次實(shí)驗(yàn)中，原應(yīng)滅菌之前加入培養(yǎng)基內(nèi)的葡萄糖由于操作疏忽 而忘記加入，隨后按照老師指示配制 100mL 10%的葡萄糖溶液一起滅菌， 待滅菌后再將葡萄糖溶液加入培養(yǎng)基中。3. 為最大限度去除上清， 可在倒掉部分上清后， 再將離心管放入離 心機(jī)稍作離心，使殘留在管壁的液體集中到離心管底部，再用移液器移姓名 宿智新科目 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院學(xué)號(hào) 201100140155班級(jí) 11 級(jí)生工 2 班 第 8 組除液體。4. 為獲得高純度的質(zhì)粒 DNA，必須徹底去

28、除雜蛋白、 染色體 DNA和 RNA。在整個(gè)質(zhì)粒提取過(guò)程中出去染色體 DNA的關(guān)鍵步驟是加入溶液、 溶液的變性和復(fù)性環(huán)節(jié)， 應(yīng)控制好變性和復(fù)性的時(shí)機(jī)。 加入溶液時(shí)， 可劇烈震蕩，使菌體沉淀轉(zhuǎn)變成均勻的菌懸液，此時(shí)細(xì)胞尚未破裂，染 色體不會(huì)斷裂；加入溶液時(shí)，菌液變粘稠、透明，無(wú)菌塊殘留；加入 溶液時(shí)，會(huì)立即出現(xiàn)白色沉淀。加入溶液和溶液后，應(yīng)緩慢上下 顛倒離心管數(shù)次，切忌在旋渦振蕩器上劇烈振蕩，否則染色體DNA會(huì)斷裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，與質(zhì)粒DNA混合在一起，不利于質(zhì)粒 DNA提純。因此，操作時(shí)一定要緩慢柔和，采用上下顛倒的 方法，既要使試劑與染色體 DNA充分作用，又不破壞染色

29、體的結(jié)構(gòu)。5. 在純化 DNA加入冰乙醇的步驟中， 2 只離心管在加入的 DNA樣品 量相同的情況下， 出現(xiàn)了從-20 環(huán)境下取出后 2 只離心管內(nèi)液體體積相 差較多的情況，分析后發(fā)現(xiàn)量較少的 1 只離心管內(nèi)加入的各種試劑的量 是合適的?？赡艿脑颍涸谟靡埔浩饕迫”掖紩r(shí)下按力度太大，吸 入過(guò)多液體； 2 只離心管分別由 2 名組員加液，操作上可能出現(xiàn)個(gè)人 之間的誤差。6. 本次實(shí)驗(yàn)得到的質(zhì)粒 DNA較少，最主要原因是選擇了菌體生長(zhǎng) 較少的培養(yǎng)基，僅得到較少的粗提物，導(dǎo)致最終純化得到的質(zhì)粒DNA也較少。附注： 培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)試劑配方： 1. LB（Luria Broth ）培養(yǎng)基 LB 液體培養(yǎng)基：1%蛋白胨（typtone ），0.5%酵母粉（yeast extract