抗菌藥物篩選的實驗方法與技術(shù)

1、v 一個新的化合物或分離提取有效成分是否有抗菌作用，需一個新的化合物或分離提取有效成分是否有抗菌作用，需 要藥理實驗來證實，首先采用體外實驗方法，觀察試驗物要藥理實驗來證實，首先采用體外實驗方法，觀察試驗物 對細(xì)菌有無殺滅作用或抑制作用，體外實驗的重要性在于對細(xì)菌有無殺滅作用或抑制作用，體外實驗的重要性在于 方法簡便，用藥量少，短時間內(nèi)能判斷藥物抗菌的廣度和方法簡便，用藥量少，短時間內(nèi)能判斷藥物抗菌的廣度和 強度，為深入體外實驗和體內(nèi)藥效研究提供數(shù)據(jù)。強度，為深入體外實驗和體內(nèi)藥效研究提供數(shù)據(jù)。 v 體外實驗是篩選抗菌藥物或測試新藥抗菌性能的重要環(huán)節(jié)。體外實驗是篩選抗菌藥物或測試新藥抗菌性能的

2、重要環(huán)節(jié)。 藥物對細(xì)菌代謝的影響、可以使細(xì)胞呼吸量減低，或酶系藥物對細(xì)菌代謝的影響、可以使細(xì)胞呼吸量減低，或酶系 統(tǒng)受到抑制等，因而出現(xiàn)細(xì)菌不生長或部分抑制，可借以統(tǒng)受到抑制等，因而出現(xiàn)細(xì)菌不生長或部分抑制，可借以 判斷藥物對細(xì)菌有無抗菌作用，或抗菌范圍。體外實驗是判斷藥物對細(xì)菌有無抗菌作用，或抗菌范圍。體外實驗是 細(xì)菌與藥物直接接觸，沒有機體諸因素參與，故體外和體細(xì)菌與藥物直接接觸，沒有機體諸因素參與，故體外和體 內(nèi)實驗的結(jié)果不一定完全一致，需兩方面綜合分析進行評內(nèi)實驗的結(jié)果不一定完全一致，需兩方面綜合分析進行評 價。價。 一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?1，掌握培養(yǎng)基的制備、，掌握培養(yǎng)基的制備、

3、 高壓蒸氣滅菌、菌種培高壓蒸氣滅菌、菌種培 養(yǎng)、接種等微生物培養(yǎng)養(yǎng)、接種等微生物培養(yǎng) 技術(shù)；技術(shù)； 2，掌握化合物抗菌、抑，掌握化合物抗菌、抑 菌活性篩選技術(shù)；菌活性篩選技術(shù)； 3，掌握微孔板法、抑菌，掌握微孔板法、抑菌 圈法抗菌最小濃度測試圈法抗菌最小濃度測試 等基本操作技術(shù)。等基本操作技術(shù)。 4，學(xué)會使用各種儀器設(shè)學(xué)會使用各種儀器設(shè) 備備 。 實驗中使用的儀器設(shè)備：實驗中使用的儀器設(shè)備： 1，手提式高壓蒸汽滅菌鍋；，手提式高壓蒸汽滅菌鍋； 2，超凈工作臺；，超凈工作臺； 3，各種移液器；，各種移液器； 4，細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱；，細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱； 5，微生物培養(yǎng)搖床；，微生物培養(yǎng)搖床； 6，酶標(biāo)

4、儀；，酶標(biāo)儀； 二、微生物培養(yǎng)基的配制、滅菌與培養(yǎng)二、微生物培養(yǎng)基的配制、滅菌與培養(yǎng) 培養(yǎng)基是指利用人工方法將適培養(yǎng)基是指利用人工方法將適 合微生物生長繁殖成積累代謝合微生物生長繁殖成積累代謝 產(chǎn)物的各種營養(yǎng)物質(zhì)混合配制產(chǎn)物的各種營養(yǎng)物質(zhì)混合配制 而成的營養(yǎng)基質(zhì)。主要用于微而成的營養(yǎng)基質(zhì)。主要用于微 生物的分離、培養(yǎng)、鑒定以及生物的分離、培養(yǎng)、鑒定以及 菌種保藏等方面。菌種保藏等方面。 培養(yǎng)基一般應(yīng)含有微生物生長培養(yǎng)基一般應(yīng)含有微生物生長 繁殖所需要的碳源、氮源、能繁殖所需要的碳源、氮源、能 源、無機鹽、生長因子和水等源、無機鹽、生長因子和水等 營養(yǎng)成分。營養(yǎng)成分。 此外，為了滿有微生物生長繁

5、此外，為了滿有微生物生長繁 殖或積累代謝產(chǎn)物的要求，還殖或積累代謝產(chǎn)物的要求，還 必須控制培養(yǎng)基的必須控制培養(yǎng)基的pHpH。 培養(yǎng)基可分為天然培養(yǎng)基、合成培培養(yǎng)基可分為天然培養(yǎng)基、合成培 養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基。養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基。 按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可將培養(yǎng)基按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可將培養(yǎng)基 分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和 液體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基。 固體培養(yǎng)基是指在液體培養(yǎng)基中加固體培養(yǎng)基是指在液體培養(yǎng)基中加 入一定量的凝固劑入一定量的凝固劑( (常加常加1.5%-2%1.5%-2%的的 瓊脂瓊脂) )經(jīng)融化冷凝而成。經(jīng)融化冷凝而成。 半固體培養(yǎng)這是指在液體培養(yǎng)基中

6、半固體培養(yǎng)這是指在液體培養(yǎng)基中 加入加入0.80.8-1-1左右的瓊脂，經(jīng)融左右的瓊脂，經(jīng)融 化冷凝而成?；淠伞?液體培養(yǎng)基是指培養(yǎng)基中不加凝固液體培養(yǎng)基是指培養(yǎng)基中不加凝固 劑瓊脂，培養(yǎng)基呈液體狀態(tài)。劑瓊脂，培養(yǎng)基呈液體狀態(tài)。 （一）基本原理（一）基本原理 v正確掌握培養(yǎng)基的配制方法是從事微生物學(xué)實驗正確掌握培養(yǎng)基的配制方法是從事微生物學(xué)實驗 工作的重要基礎(chǔ)。由于微生物種類及代謝類型的工作的重要基礎(chǔ)。由于微生物種類及代謝類型的 多樣性，因而用于培養(yǎng)微生物培養(yǎng)基的種類也很多樣性，因而用于培養(yǎng)微生物培養(yǎng)基的種類也很 多，它們的配方及配制方法雖各有差異。多，它們的配方及配制方法雖各有差異。

7、v但一般培養(yǎng)基的配制程序卻大致相同，例如器皿但一般培養(yǎng)基的配制程序卻大致相同，例如器皿 的準(zhǔn)備，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培的準(zhǔn)備，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培 養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及接菌等基本養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及接菌等基本 環(huán)節(jié)大致相同。環(huán)節(jié)大致相同。 （二）實驗過程（二）實驗過程 1 1，液體及固體培養(yǎng)基的配制過，液體及固體培養(yǎng)基的配制過 程程 一般培養(yǎng)基的組成一般培養(yǎng)基的組成 牛肉膏牛肉膏 0.5g0.5g 蛋白胨蛋白胨 1g1g NaCl 0.5g NaCl 0.5g 瓊脂瓊脂 1.5-2g1.5-2g 水水 100ml100ml pH 7.2 pH

8、7.2 液體培養(yǎng)基不加瓊脂即可。液體培養(yǎng)基不加瓊脂即可。 (1)(1)稱量及溶化稱量及溶化 分別稱取蛋白胨、分別稱取蛋白胨、 NaClNaCl、牛肉膏置于另一小燒杯中，進、牛肉膏置于另一小燒杯中，進 行稱量。然后加入少量蒸餾水于小燒行稱量。然后加入少量蒸餾水于小燒 杯中，加熱融化。杯中，加熱融化。 (2)(2)調(diào)調(diào)pH pH 待溶液冷至室溫時，用待溶液冷至室溫時，用 0.1mol/L NaOH0.1mol/L NaOH溶液調(diào)溶液調(diào)pHpH至至7.27.2。 (3)(3)定容定容 將溶液倒入量筒中，補充將溶液倒入量筒中，補充 水量至所需體積。水量至所需體積。 (4)(4)固體培養(yǎng)基加入所需量的瓊

9、脂，固體培養(yǎng)基加入所需量的瓊脂， 加熱融化，補充失水。加熱融化，補充失水。 (5)(5)分裝、加塞、包扎。分裝、加塞、包扎。 (6)(6)高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌100 Pa100 Pa滅菌滅菌20 min20 min 2 2，培養(yǎng)基的分裝，培養(yǎng)基的分裝 液體培養(yǎng)基裝入試管培養(yǎng)液體培養(yǎng)基裝入試管培養(yǎng) 基的量視試管大小及需要基的量視試管大小及需要 而定，若所用試管大小為而定，若所用試管大小為 1515150 mm150 mm時，液體培養(yǎng)時，液體培養(yǎng) 基可分裝至試管高度基可分裝至試管高度1/41/4 左右為宜（約左右為宜（約5ml5ml）；）； 分裝團體培養(yǎng)基時，在瓊分裝團體培養(yǎng)基時，在瓊 脂完全

10、融化后，應(yīng)趁熱分脂完全融化后，應(yīng)趁熱分 裝于試管中分裝量為管高裝于試管中分裝量為管高 1/5(1/5(約約4-5ml)4-5ml)。 3 3，棉塞的制作及試管、錐形瓶，棉塞的制作及試管、錐形瓶 的包扎的包扎 （1 1）試管棉塞的制作）試管棉塞的制作 制棉塞時，應(yīng)選用大小、制棉塞時，應(yīng)選用大小、 厚薄適中的普通棉花一快，鋪厚薄適中的普通棉花一快，鋪 展于左手拇指和食指如成的圓展于左手拇指和食指如成的圓 孔上，用右手食指將棉花從中孔上，用右手食指將棉花從中 央壓入團孔中制成棉塞，然后央壓入團孔中制成棉塞，然后 直接壓入試管或錐形瓶口。直接壓入試管或錐形瓶口。 將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或蓋將裝好培養(yǎng)基

11、并塞好棉塞或蓋 好管帽的試管捆成好管帽的試管捆成捆，外面捆，外面 包上一層牛皮紙。用鉛筆注明包上一層牛皮紙。用鉛筆注明 培養(yǎng)基名稱及配制日期。滅菌培養(yǎng)基名稱及配制日期。滅菌 待用。待用。 4 4，培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基的滅菌 高壓蒸汽滅菌是微生物學(xué)實驗、發(fā)酵工業(yè)高壓蒸汽滅菌是微生物學(xué)實驗、發(fā)酵工業(yè) 生產(chǎn)、以及外科手術(shù)器械等方面最常用的生產(chǎn)、以及外科手術(shù)器械等方面最常用的 一種滅菌方法。一種滅菌方法。 （1 1）打開滅菌鍋蓋，加適量水；）打開滅菌鍋蓋，加適量水； （2 2）將待滅菌物品放入滅菌桶內(nèi)。（）將待滅菌物品放入滅菌桶內(nèi)。（3 3） 將蓋上的軟管插入滅菌桶的槽內(nèi)，加蓋，將蓋上的軟管插入滅菌桶的

12、槽內(nèi)，加蓋， 上下螺栓口對齊，均勻旋緊螺栓，使鍋密上下螺栓口對齊，均勻旋緊螺栓，使鍋密 閉。閉。 （4 4）打開放汽閥，加熱，自鍋內(nèi)開始產(chǎn)）打開放汽閥，加熱，自鍋內(nèi)開始產(chǎn) 生蒸汽后再關(guān)緊放汽閥，待壓力逐漸上升生蒸汽后再關(guān)緊放汽閥，待壓力逐漸上升 至所需溫度時，控制熱源，維持所需壓力至所需溫度時，控制熱源，維持所需壓力 和溫度，并開始計時和溫度，并開始計時20 min20 min后停止加熱。后停止加熱。 （5 5）待壓力降至接近）待壓力降至接近0 0時，慢慢打開放汽時，慢慢打開放汽 閥閥( (排汽口排汽口) )，開蓋，立即取出滅菌物品。，開蓋，立即取出滅菌物品。 5 5，斜面和平板的制作，斜面和

13、平板的制作 將巳滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基將巳滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基 的試管，趁熱置于木棒上的試管，趁熱置于木棒上 ，使成適當(dāng)斜度，凝固后，使成適當(dāng)斜度，凝固后 即成斜面即成斜面( (圖圖1-3)1-3)斜面長斜面長 度不超過試管長度度不超過試管長度1/21/2為為 宜。宜。 平板的制作平板的制作 6 6，斜面培養(yǎng)基接種，斜面培養(yǎng)基接種 斜面培養(yǎng)基接種法斜面培養(yǎng)基接種法 一般不用作分離培一般不用作分離培 養(yǎng)，僅使細(xì)菌繁殖養(yǎng)，僅使細(xì)菌繁殖 為菌種傳代或觀察為菌種傳代或觀察 其某些生化特性之其某些生化特性之 用。用。 (1)(1)接種滅菌接種滅菌 (2)(2)開開 啟棉塞啟棉塞 (3)(3)管口滅管口滅 菌菌

14、 (4)(4)挑起菌苔挑起菌苔 (5)(5)接種接種 (6)(6)塞好棉塞好棉 塞。塞。 7 7 ， 液液 體體 培培 養(yǎng)養(yǎng) 基基 接接 種種 法法 三、微量稀釋法體外抗菌實驗三、微量稀釋法體外抗菌實驗 v連續(xù)稀釋法（試管稀釋法）通常用于測定微生物連續(xù)稀釋法（試管稀釋法）通常用于測定微生物 的最小抑菌濃度（的最小抑菌濃度（MICMIC），即將微生物的濃度按），即將微生物的濃度按 幾何級數(shù)或數(shù)學(xué)級數(shù)進行遞減稀釋，然后將不同幾何級數(shù)或數(shù)學(xué)級數(shù)進行遞減稀釋，然后將不同 濃度的微生物混入含試驗菌的液體培養(yǎng)基或固體濃度的微生物混入含試驗菌的液體培養(yǎng)基或固體 培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后，能抑制試驗菌生長的最低培養(yǎng)

15、基中，經(jīng)培養(yǎng)后，能抑制試驗菌生長的最低 濃度，即為該微生物的最小抑菌濃度。濃度，即為該微生物的最小抑菌濃度。 v微量稀釋法微量稀釋法 此種方法常用于測定細(xì)菌對藥物敏此種方法常用于測定細(xì)菌對藥物敏 感性或新藥對細(xì)菌的抗菌活性試驗。一般應(yīng)用感性或新藥對細(xì)菌的抗菌活性試驗。一般應(yīng)用9696 孔微量稀釋板，孔底呈孔微量稀釋板，孔底呈U U型，每孔容量為型，每孔容量為0.20-0.20- 0.30ml0.30ml。本法操作較便，用培養(yǎng)基量少，可作大。本法操作較便，用培養(yǎng)基量少，可作大 批量藥敏試驗。批量藥敏試驗。 ( (一）實驗過程一）實驗過程 （1 1）實驗菌的準(zhǔn)備。）實驗菌的準(zhǔn)備。 選取大腸桿菌選取

16、大腸桿菌(Escherichia c o l i ) 、 金 黃 色 葡 萄 球 菌、 金 黃 色 葡 萄 球 菌 ( (Staphylicoccus aureus) )、白、白 色葡萄球菌色葡萄球菌( (Staphylococcus albus) )、蠟狀芽孢桿菌菌種、蠟狀芽孢桿菌菌種 在營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上傳在營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上傳 代培養(yǎng)一次后，再將其接種代培養(yǎng)一次后，再將其接種 至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中3737培培 養(yǎng)養(yǎng)6-12 h6-12 h，冰箱備用。，冰箱備用。 （2 2）抗菌化合物的初步篩）抗菌化合物的初步篩 選，按下表取選，按下表取9696孔培養(yǎng)板孔培養(yǎng)板 一塊，

17、進行編號，將一塊，進行編號，將4444種種 化合物（由有機化學(xué)研究化合物（由有機化學(xué)研究 所其他教師和研究生提供）所其他教師和研究生提供） 用用DMSODMSO或蒸餾水配制成或蒸餾水配制成 5050 mol/mlmol/ml，（也可用無菌，（也可用無菌 過濾器過濾后）放置在滅過濾器過濾后）放置在滅 菌的小離心管中。菌的小離心管中。 篩選實驗過程篩選實驗過程 （3 3）在超凈工作臺內(nèi)，酒精燈下）在超凈工作臺內(nèi)，酒精燈下 ，將液體培養(yǎng)的細(xì)菌菌種用培養(yǎng)液，將液體培養(yǎng)的細(xì)菌菌種用培養(yǎng)液 進行稀釋，稀釋度為進行稀釋，稀釋度為1 1：10001000或或 1:5001:500。用無菌的移液器（吸咀經(jīng)。用無

18、菌的移液器（吸咀經(jīng) 過滅菌處理）將稀釋的液體菌種過滅菌處理）將稀釋的液體菌種 198198 l l加入到除了加入到除了A1,B1A1,B1以外的孔內(nèi)以外的孔內(nèi) ，2 2 l l各種化合物溶液（各種化合物溶液（DMSODMSO配置配置 ），），A1,B1,C1,D1A1,B1,C1,D1加加200 200 l l培養(yǎng)液培養(yǎng)液 ，震蕩混合后，震蕩混合后3737培養(yǎng)培養(yǎng)12h-18h, 12h-18h, 用酶標(biāo)儀用酶標(biāo)儀630nm630nm側(cè)吸光度。側(cè)吸光度。DMSODMSO的的 最終濃度保持在最終濃度保持在1%1%。每個樣品設(shè)兩。每個樣品設(shè)兩 個平行孔。個平行孔。 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加樣安排孔細(xì)胞培

19、養(yǎng)板加樣安排 1 12 23 34 45 56 67 78 89 9101011111212 A A培養(yǎng)液培養(yǎng)液200200 l l樣品樣品1 12 23 34 45 56 67 78 89 910101111 B B培養(yǎng)液培養(yǎng)液200200 l l樣品樣品1 12 23 34 45 56 67 78 89 910101111 C C培養(yǎng)液培養(yǎng)液200200 l l樣品樣品12121313141415151616171718181919202021212222 D D培養(yǎng)液培養(yǎng)液200200 l l樣品樣品12121313141415151616171718181919202021212222

20、 E E菌對照菌對照(2(2 l DMSO)l DMSO)樣品樣品23232424252526262727282829293030313132323333 F F菌對照菌對照(2(2 l DMSO)l DMSO)樣品樣品23232424252526262727282829293030313132323333 G G菌對照菌對照(2(2 l DMSO)l DMSO)樣品樣品34343535363637373838393940404141424243434444 H H菌對照菌對照(2(2 l DMSO)l DMSO)樣品樣品343435353636373738383939404041414242

21、43434444 樣品濃度樣品濃度0.02mmol/ml 0.02mmol/ml 樣品分子量樣品分子量/100.mg /100.mg 用用DMSODMSO配成配成0.5ml0.5ml即可，每即可，每 次實驗用次實驗用2 2 l l，9696孔板的孔體積孔板的孔體積200200 l l，樣品的最終濃度為，樣品的最終濃度為200200 mol/Lmol/L，大，大 于該濃度則無價值。于該濃度則無價值。 試驗用樣品試驗用樣品 1.1.環(huán)丙沙星環(huán)丙沙星 2.2.2 2 ,4,4 ,3-,3-三羥基二苯甲酮三羥基二苯甲酮 3.3.2,4,42,4,4 - -三羥基二苯甲酮三羥基二苯甲酮 4.4.2,4,

22、22,4,2 - -三羥基二苯甲酮三羥基二苯甲酮 5.5.2,3,4,22,3,4,2 - -四羥基二苯甲酮四羥基二苯甲酮 6.6.2,3,4,32,3,4,3 - -四羥基二苯甲酮四羥基二苯甲酮 7.7.2,3,4,42,3,4,4 - -四羥基二苯甲酮四羥基二苯甲酮 8.8.2,4,22,4,2 ,4,4 - -四羥基二苯甲酮四羥基二苯甲酮 9.9.2,3,4,22,3,4,2 ,4,4 - -五羥基二苯甲酮五羥基二苯甲酮 10.10.丹皮酚丹皮酚 11.11.丹皮酚丹皮酚- -鎳（鎳（IIII）配合物）配合物 12.12.丹皮酚丹皮酚- -氧釩（氧釩（V V）配合物）配合物 13.13.

23、丹皮酚丹皮酚- -銅（銅（IIII）配合物）配合物 14.14.丹皮酚丹皮酚- -鈷（鈷（IIII）配合物）配合物 15.15.丹皮酚丹皮酚- -錳（錳（IIII）配合物）配合物 16.16.丹皮酚丹皮酚- -鋅（鋅（IIII）配合物）配合物 17.17.苯甲基苯甲基-N-N-苯基亞胺苯基亞胺 18.18.3-3-羥基苯甲基羥基苯甲基-N-N-苯基亞胺苯基亞胺 19.19.4-4-羥基苯甲基羥基苯甲基-N-2,4-N-2,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺 20.20.2-2-羥基苯甲基羥基苯甲基-N-3,5-N-3,5-二苯基亞胺二苯基亞胺 21.21.3,4-3,4-二羥基苯甲基二羥基苯

24、甲基-N-N-苯基亞胺苯基亞胺 22.22.4-4-羥基苯甲基羥基苯甲基-N-3,4-N-3,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺 23. 4-23. 4-羥基羥基-3-3-甲氧基甲氧基-N-2,4-N-2,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺 24. 24. 苯甲基苯甲基-N-4-N-4-羥基苯基亞胺羥基苯基亞胺 25.25. 3,4-3,4-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-N-2,4-N-2,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺 26.26. 4-4-羥基苯甲基羥基苯甲基-N-4-N-4-羥基苯基亞胺羥基苯基亞胺 27.27. 3,5-3,5-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-N-3,4-N-3,4-二

25、甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺 28.28. 2,5-2,5-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-N-4-N-4-羥基苯基亞胺羥基苯基亞胺 29.29. 2,4-2,4-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-N-4-N-4-羥基苯基亞胺羥基苯基亞胺 30.30. 2,4-2,4-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-N-2,4-N-2,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺 31.31. 4-4-羥基苯甲基羥基苯甲基-N-3-N-3-羥基苯基亞胺羥基苯基亞胺 32.32. 3,5-3,5-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-N-2,4-N-2,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺 33.33. 4-4-羥基羥基-3-3-甲氧基甲氧基-N-

26、3,4-N-3,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺 34.34. 4-4-羥基苯甲基羥基苯甲基-N-4-N-4-甲基苯基亞胺甲基苯基亞胺 35.35. 4-4-羥基羥基-3-3-甲氧基苯甲基甲氧基苯甲基-N-4-N-4-甲基苯基亞胺甲基苯基亞胺 36.36. 3,5-3,5-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-N-4-N-4-甲基苯基亞胺甲基苯基亞胺 37.37. 2,4-2,4-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-N-4-N-4-甲基苯基亞胺甲基苯基亞胺 38.38. 4-4-磺酸基磺酸基-3-3 ,4,4 - -二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯 39.39. 4-4-磺酸基磺酸基-2-2 ,4,4 - -二羥基偶氮

27、苯二羥基偶氮苯 40.40. 4-4-硝基硝基-3-3 ,4,4 - -二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯 41.41. 4-4-硝基硝基-2-2 ,4,4 - -二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯 42.42. 4-4-硝基硝基-2-2 ,5,5 - -二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯 43.43. 4-4-溴溴-3-3 ,4,4 - -二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯 44.44. 對羥基苯甲酸甲酯對羥基苯甲酸甲酯 篩選數(shù)據(jù)分析篩選數(shù)據(jù)分析 測試的樣品中，測試的樣品中，1 1號樣為號樣為 市場上臨床使用的環(huán)丙沙市場上臨床使用的環(huán)丙沙 星，濃度為星，濃度為0.005mmol/L0.005mmol/L 。 其 他 樣 品 濃 度

28、 為。 其 他 樣 品 濃 度 為 0.02mmol/L0.02mmol/L。 實驗中，以培養(yǎng)基為空實驗中，以培養(yǎng)基為空 白白0%0%，以帶菌培養(yǎng)液為對，以帶菌培養(yǎng)液為對 照照100%100%。 如果酶標(biāo)儀如果酶標(biāo)儀630nm630nm測試的結(jié)果中，測試的結(jié)果中， 空白為空白為-0.2-0.2，空內(nèi)液體呈透明清，空內(nèi)液體呈透明清 澈，對照孔的值為澈，對照孔的值為+0.1-0+0.1-0.2 2。 如果測試樣品的值也同樣達到如果測試樣品的值也同樣達到- - 0.20.2，表明樣品在，表明樣品在200200 mol/Lmol/L具有具有 較好的抗菌活性。較好的抗菌活性。 如果測試樣品的值在對照孔和

29、空如果測試樣品的值在對照孔和空 白之間，表明樣品在高濃度有抗白之間，表明樣品在高濃度有抗 菌作用，請選取菌作用，請選取1111個抗菌效果較個抗菌效果較 好的樣品做下面的最小抑菌濃度好的樣品做下面的最小抑菌濃度 實驗。實驗。 篩選數(shù)據(jù)分析篩選數(shù)據(jù)分析 測試的樣品中，測試的樣品中，1 1號樣為號樣為 市場上臨床使用的環(huán)丙沙市場上臨床使用的環(huán)丙沙 星，濃度為星，濃度為0.005mmol/L0.005mmol/L 。 其 他 樣 品 濃 度 為。 其 他 樣 品 濃 度 為 0.02mmol/L0.02mmol/L。 實驗中，以培養(yǎng)基為空實驗中，以培養(yǎng)基為空 白白0%0%，以帶菌培養(yǎng)液為對，以帶菌培養(yǎng)

30、液為對 照照100%100%。 如果酶標(biāo)儀如果酶標(biāo)儀630nm630nm測試的結(jié)果中，測試的結(jié)果中， 空白為空白為-0.2-0.2，空內(nèi)液體呈透明清，空內(nèi)液體呈透明清 澈，對照孔的值為澈，對照孔的值為+0.1-0+0.1-0.2 2。 如果測試樣品的值也同樣達到如果測試樣品的值也同樣達到- - 0.20.2，表明樣品在，表明樣品在200200 mol/Lmol/L具有具有 較好的抗菌活性。較好的抗菌活性。 如果測試樣品的值在對照孔和空如果測試樣品的值在對照孔和空 白之間，表明樣品在高濃度有抗白之間，表明樣品在高濃度有抗 菌作用，請選取菌作用，請選取1111個抗菌效果較個抗菌效果較 好的樣品做下

31、面的最小抑菌濃度好的樣品做下面的最小抑菌濃度 實驗。實驗。 （4 4）最小抑菌濃度或）最小抑菌濃度或EC50EC50的測試的測試 v操作步驟與試管稀釋法相似，一般常用操作步驟與試管稀釋法相似，一般常用MHMH培養(yǎng)基，培養(yǎng)基， 根據(jù)上面篩選試驗選取出來的樣品，在微孔板孔根據(jù)上面篩選試驗選取出來的樣品，在微孔板孔 內(nèi)用微量移液器直接在微孔板孔內(nèi)作二倍稀釋，內(nèi)用微量移液器直接在微孔板孔內(nèi)作二倍稀釋， 然后接種稀釋菌液，其中留一列孔作為藥液對照，然后接種稀釋菌液，其中留一列孔作為藥液對照， 另一孔僅加培養(yǎng)基和菌液作為菌對照，試驗完畢另一孔僅加培養(yǎng)基和菌液作為菌對照，試驗完畢 后，用微量攪拌器震蕩混勻后

32、，置后，用微量攪拌器震蕩混勻后，置3737溫孵溫孵12-12- 18h18h，用酶標(biāo)儀，用酶標(biāo)儀630nm630nm側(cè)吸光度。側(cè)吸光度。 樣品稀釋后的濃度表樣品稀釋后的濃度表 A 培養(yǎng)液培養(yǎng)液200 l樣品樣品1， ，200 M234567891011 B 培養(yǎng)液培養(yǎng)液200 l樣品樣品1， ，100 M C 培養(yǎng)液培養(yǎng)液200 l樣品樣品1， ，50 M D 培養(yǎng)液培養(yǎng)液200 l樣品樣品1， ，25 M E 菌對照菌對照(2 l DMSO)樣品樣品1， ，12.5 M F 菌對照菌對照(2 l DMSO)樣品樣品1， ，6.25 M G 菌對照菌對照(2 l DMSO)樣品樣品1， ，3.

33、13 M H 菌對照菌對照(2 l DMSO)樣品樣品1， ，1.56 M （二）數(shù)據(jù)處理與分析（二）數(shù)據(jù)處理與分析 抗菌藥物的最小抗菌濃度測抗菌藥物的最小抗菌濃度測 試結(jié)果可能出現(xiàn)兩種形式：試結(jié)果可能出現(xiàn)兩種形式： 1 1，在某一個稀釋的樣品濃，在某一個稀釋的樣品濃 度，結(jié)果表現(xiàn)出細(xì)菌沒有生度，結(jié)果表現(xiàn)出細(xì)菌沒有生 長，菌液較清（可與空白培長，菌液較清（可與空白培 養(yǎng)基比），而下一個稀釋的養(yǎng)基比），而下一個稀釋的 樣品濃度，菌液中細(xì)菌生長樣品濃度，菌液中細(xì)菌生長 比較旺盛（可與含菌對照比比較旺盛（可與含菌對照比 ），那么，這個稀釋的樣品），那么，這個稀釋的樣品 濃度就為該樣品抗菌的最小濃度就

34、為該樣品抗菌的最小 濃度。這種化合物的抗菌作濃度。這種化合物的抗菌作 用可以稱為殺菌作用。用可以稱為殺菌作用。 如右表中紅色值中的樣品濃如右表中紅色值中的樣品濃 度就是最小抗菌濃度。度就是最小抗菌濃度。 培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2013-0.2013樣品樣品1 1值值-0.2094-0.2094樣品樣品2 2值值-0.2066-0.2066 培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2027-0.2027樣品樣品1 1值值-0.2102-0.2102樣品樣品2 2值值-0.2103-0.2103 培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2005-0.2005樣品樣品1 1值值-0.2068-0.2068樣品樣品2 2值值-0.211

35、2-0.2112 培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2106-0.2106樣品樣品1 1值值-0.2054-0.2054樣品樣品2 2值值-0.2022-0.2022 菌對照值菌對照值 0.21820.2182樣品樣品1 1值值-0.2028-0.2028樣品樣品2 2值值 0.20870.2087 菌對照值菌對照值 0.20680.2068樣品樣品1 1值值-0.2008-0.2008樣品樣品2 2值值 0.21120.2112 菌對照值菌對照值 0.21460.2146樣品樣品1 1值值 0.20230.2023樣品樣品2 2值值 0.20880.2088 菌對照值菌對照值 0.20330.2033樣

36、品樣品1 1值值 0.20360.2036樣品樣品2 2值值 0.20330.2033 2 2，實驗中，不同稀釋的樣，實驗中，不同稀釋的樣 品濃度的測試結(jié)果沒有上面品濃度的測試結(jié)果沒有上面 的現(xiàn)象，而是出現(xiàn)規(guī)律性的的現(xiàn)象，而是出現(xiàn)規(guī)律性的 上升。即，這種樣品測出的上升。即，這種樣品測出的 數(shù)據(jù)是隨著樣品濃度的下降數(shù)據(jù)是隨著樣品濃度的下降 而上升，可以根據(jù)其數(shù)據(jù)畫而上升，可以根據(jù)其數(shù)據(jù)畫 出一條細(xì)菌的生長曲線，如出一條細(xì)菌的生長曲線，如 果對照樣的值定為果對照樣的值定為100%100%，可，可 以從曲線上求出抑制以從曲線上求出抑制50%50%時時 樣品的濃度，所以，我們稱樣品的濃度，所以，我們稱

37、 這種這種 抗菌為抑菌作用，表抗菌為抑菌作用，表 明該化合物不能殺死細(xì)菌，明該化合物不能殺死細(xì)菌， 但可以抑制其生長。但可以抑制其生長。 培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2013-0.2013樣品樣品1 1值值-0.2194-0.2194樣品樣品2 2值值-0.2166-0.2166 培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2027-0.2027樣品樣品1 1值值-0.2082-0.2082樣品樣品2 2值值-0.1893-0.1893 培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2005-0.2005樣品樣品1 1值值-0.1694-0.1694樣品樣品2 2值值-0.1002-0.1002 培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2106-0.2106樣品

38、樣品1 1值值-0.1268-0.1268樣品樣品2 2值值 0.00220.0022 菌對照值菌對照值 0.21820.2182樣品樣品1 1值值-0.0428-0.0428樣品樣品2 2值值 0.05870.0587 菌對照值菌對照值 0.20680.2068樣品樣品1 1值值-0.0023-0.0023樣品樣品2 2值值 0.16120.1612 菌對照值菌對照值 0.21460.2146樣品樣品1 1值值 0.68040.6804樣品樣品2 2值值 0.20880.2088 菌對照值菌對照值 0.20330.2033樣品樣品1 1值值 0.13890.1389樣品樣品2 2值值 0.2

39、1330.2133 四、瓊脂擴散法四、瓊脂擴散法 v 此種方法包括紙片法，杯碟法挖洞法等，它們的共同此種方法包括紙片法，杯碟法挖洞法等，它們的共同 點均在平皿瓊脂內(nèi)加入適量測試細(xì)菌，按上述方法放置點均在平皿瓊脂內(nèi)加入適量測試細(xì)菌，按上述方法放置 適量藥液在菌層上，藥物在瓊脂四周擴散，經(jīng)孵育后，適量藥液在菌層上，藥物在瓊脂四周擴散，經(jīng)孵育后， 細(xì)菌生長受抑制，出現(xiàn)抑菌圈，測定抑菌圈直徑，能了細(xì)菌生長受抑制，出現(xiàn)抑菌圈，測定抑菌圈直徑，能了 解細(xì)菌對藥物的敏感程度。解細(xì)菌對藥物的敏感程度。 v 瓊脂擴散法可定性或初步判斷該化合物的抗菌能力，一瓊脂擴散法可定性或初步判斷該化合物的抗菌能力，一 般是將

40、化合物稀釋后，加如含試驗菌的混菌平板中，由般是將化合物稀釋后，加如含試驗菌的混菌平板中，由 于化合物在瓊脂培養(yǎng)基中的擴散作用，使化合物周圍的于化合物在瓊脂培養(yǎng)基中的擴散作用，使化合物周圍的 試驗菌不能生長，從而產(chǎn)生抑菌圈或抑菌帶。根據(jù)抑菌試驗菌不能生長，從而產(chǎn)生抑菌圈或抑菌帶。根據(jù)抑菌 圈或抑菌帶的大小來評價化合物抗菌作用的強弱。圈或抑菌帶的大小來評價化合物抗菌作用的強弱。 圖圖: :標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法 圖圖 ：鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線：鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線 雙碟、鋼管與抑菌圈位置圖雙碟、鋼管與抑菌圈位置圖S S：標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品T T：供試品：供試品 抑菌圈直徑抑菌圈直徑(mm)(mm) （一）濾紙片法實驗

41、過程（一）濾紙片法實驗過程 （1 1）試驗菌的準(zhǔn)備。在營養(yǎng)培養(yǎng)基接）試驗菌的準(zhǔn)備。在營養(yǎng)培養(yǎng)基接 種金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌種培養(yǎng)傳種金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌種培養(yǎng)傳 代依次后，再移種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，代依次后，再移種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中， 在在3737培養(yǎng)培養(yǎng)10-18h10-18h，取出備用。，取出備用。 （2 2）混菌平板的植被。用無菌吸管分別）混菌平板的植被。用無菌吸管分別 取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的肉湯培養(yǎng)取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的肉湯培養(yǎng) 物，在無菌平皿中各滴加物，在無菌平皿中各滴加4-54-5滴，再將已滴，再將已 溶化并冷卻至溶化并冷卻至4545的瓊脂培養(yǎng)基倒入平皿的瓊脂

42、培養(yǎng)基倒入平皿 中，每皿中，每皿20mL20mL，立即晃動平皿混勻，平放，立即晃動平皿混勻，平放 臺上，凝固后備用。臺上，凝固后備用。 （3 3）用記號筆在無菌平皿底部劃十字線，）用記號筆在無菌平皿底部劃十字線， 將平板分為四將平板分為四- -六個區(qū)，每一個區(qū)上標(biāo)注六個區(qū)，每一個區(qū)上標(biāo)注 加入藥品名稱。加入藥品名稱。 （4 4）用無菌鑷子取無菌濾）用無菌鑷子取無菌濾 紙片（直徑紙片（直徑6-8mm6-8mm），浸入），浸入 待測藥液（可以稀釋成待測藥液（可以稀釋成4-64-6 不同濃度），然后輕輕放不同濃度），然后輕輕放 入混菌平板對應(yīng)的區(qū)域中入混菌平板對應(yīng)的區(qū)域中 央，貼緊（如圖）。央，貼緊

43、（如圖）。 （5 5）將平皿放入）將平皿放入3737恒溫恒溫 箱中倒置培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)20h20h，然后觀，然后觀 察結(jié)果。察結(jié)果。 （6 6）用卡尺測量抑菌圈的）用卡尺測量抑菌圈的 直徑，以判斷微生物的抑直徑，以判斷微生物的抑 菌能力。菌能力。 效果評價效果評價 v抑菌圈直徑抑菌圈直徑15mm 15mm 高度敏感高度敏感 v抑菌圈直徑抑菌圈直徑10-15mm 10-15mm 中度敏感中度敏感 v抑菌圈直徑抑菌圈直徑10mm 10mm 低度敏感低度敏感 v無抑菌圈無抑菌圈 不敏感或耐藥不敏感或耐藥 四、實驗安排四、實驗安排 每周四上午，先進行抗菌藥物的篩選，然后進行培養(yǎng)基每周四上午，先進行抗菌

44、藥物的篩選，然后進行培養(yǎng)基 的配制、滅菌，斜面和液體試管培養(yǎng)的制作及接菌，為的配制、滅菌，斜面和液體試管培養(yǎng)的制作及接菌，為 第二天的實驗做準(zhǔn)備。第二天的實驗做準(zhǔn)備。 每周五上午，用酶標(biāo)儀進行抗菌藥物的測定，然后進行每周五上午，用酶標(biāo)儀進行抗菌藥物的測定，然后進行 最小濃度測試和瓊脂擴散法測試實驗。每周六上午最小濃度測試和瓊脂擴散法測試實驗。每周六上午9 9時，時， 用酶標(biāo)儀檢測最小抑菌濃度和抑菌圈測試。用酶標(biāo)儀檢測最小抑菌濃度和抑菌圈測試。 由指導(dǎo)教師預(yù)先進行細(xì)菌試管液體培養(yǎng)由指導(dǎo)教師預(yù)先進行細(xì)菌試管液體培養(yǎng)18-2018-20小時，為后小時，為后 續(xù)實驗做準(zhǔn)備。續(xù)實驗做準(zhǔn)備。 1 2 3 五、實驗注意事項五、實驗注意事項 實驗中，需要細(xì)心，要正確使用移液器實驗中，需要細(xì)心，要正確使用移液器1. 注意觀察，留意操作細(xì)節(jié)注意觀察，