試驗總結(jié)細胞培養(yǎng)方法

1、、培養(yǎng)細胞常用配置 培養(yǎng)基 的配置：基礎(chǔ)培 養(yǎng)基 500ml+胎牛血清 50ml+雙抗 5ml 凍存液的配置： 10 % DMSO + 90% 依次比例酌量配置。超凈工作臺常規(guī)配置 移液器 1 套（、l20、l200、l1ml），酒精燈 1 盞，液器 1 臺，斜架 1 臺，酒 精噴壺 1 個，酒精棉球缸 1 個，污缸 1 個， 常規(guī)耗材：培養(yǎng)瓶（ 50 2），定量移液管（ 5ml、10ml），槍頭（ 1ml、200、l 10）l，培養(yǎng)皿， 6/24/48/96 孔板，醫(yī)用脫脂棉球，凍存管 所需試劑：培養(yǎng)基，胎牛血清，雙抗， DMSO，胰酶， 75%酒精 實驗前準備： 所需的各項高壓后的耗材及污

2、物缸放于超凈工作臺內(nèi)， 用酒精噴壺 噴灑實驗臺面，并關(guān)閉工作臺打開紫外燈照射 30min后開始實驗操作。 培養(yǎng)基及 胰酶恢復(fù)常溫后使用，可 37水浴 5-10min二、細胞復(fù)蘇步驟：1. 紫外消毒 30min 后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作 者的雙手。2. 培養(yǎng)液（ DMEM），恒溫水浴箱 37預(yù)熱 20min，備用。超凈臺內(nèi)準備一支 15ml 離心管備用。3. 將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺面內(nèi)，點燃酒精燈，再將 瓶口對準在酒精燈上消毒 2-3 次，旋開瓶蓋后需再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4. 從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入 37水浴中，快速搖晃，直至凍

3、存液 融化至黃豆粒大小后迅速取出。5. 將細胞懸液移入 15ml 離心管，緩慢加入 4ml 培養(yǎng)液，離心（1000r/min ，5min）。6. 取出 2個培養(yǎng)皿并做好標記（復(fù)蘇日期等），提前加入 5-10ml 培養(yǎng)液；離心 結(jié)束后用 1ml 培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞后分別加入培養(yǎng)皿內(nèi)。7. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒 2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面， 取出實 驗試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺。8. 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)注意事項：1. 取細胞的過程中注意帶好防凍手套。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液 氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。2. 凍存液的問題：凍存液的配置已是常識

4、，在這里不作詳述，但二甲基亞砜 （DMSO）對細胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作 用較大，因此，必須在 1-2min 內(nèi)使凍存液完全融化。如果復(fù)蘇溫度太慢，會造 成細胞的損傷，二甲基亞砜（ DMSO）最好選擇進口產(chǎn)品。3. 離心前須加入少量培養(yǎng)液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量 培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。4. 離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后 分裝到培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，第二天換液。因為離心的目的是兩個，去除DMSO，去除死細胞，這個是標準流程，但對一般人來說，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時間，轉(zhuǎn) 的不夠活細胞沉底的少， 細

5、胞就全被扔掉了， 轉(zhuǎn)過了活細胞會受壓過大， 死亡。 此外在操作過程中容易污染， 所以不推薦。 另一種說法為細胞懸液中含有二甲基 亞砜（ DMSO），DMSO 對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液體前倒 凈，且一定倒干凈。5. 凍存細胞解凍時 1ml 細胞液要加 10ml15m 培養(yǎng)液6. 復(fù)蘇細胞分裝的問題：復(fù)蘇 1管細胞一般可分裝到 2-3 只培養(yǎng)皿中，分裝過多， 細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁。7. 加培養(yǎng)基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是 DMSO 的 濃度，從如果你加培養(yǎng)基的太少， 那么 DMSO的濃度就會比較大， 就會影響細胞 生長，從以前的資料來看， DMS

6、O 的濃度在小于 %的時候?qū)σ话慵毎麤]有什么影 響，還有一個說法是 1。所以如果你的凍存液的濃度是 10DMSO 的話那么 加 10ml 以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度8. 原理：在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成 冰晶，能導(dǎo)致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、 PH改變、 蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢 的凍結(jié)條件下，能使細胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細胞。貯存在 130以下的低溫 中能減少冰晶的形成。 細胞復(fù)蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的 5 0，細胞仍能生長，活力受損不大。 目前常用的保護劑為二甲亞砜

7、（ DMS）O 和 甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。三、培養(yǎng)液的更換1. 紫外消毒 30min 后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作 者的雙手。2. 培養(yǎng)液（ DMEM），恒溫水浴箱 37預(yù)熱 20min，備用。3. 將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺面內(nèi)，點燃酒精燈，再 將瓶口對準在酒精燈上消毒 2-3 次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4. 將培養(yǎng)皿蓋內(nèi)口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進污缸5拿出 1支高壓后的 5ml 定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上， 再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身 2-3 次，懸空進

8、入培養(yǎng)基瓶內(nèi)吸取 5-10ml 培養(yǎng)基再懸空移入培養(yǎng)皿內(nèi)，將培養(yǎng)皿蓋在酒精燈上消毒 2-3 次后蓋上。6. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒 2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面， 取出實 驗試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺。7. 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)每天定時觀察細胞生長情況，一般 72-96h 后，細胞生長密度大于 90%，即可進 行細胞的傳代。四、細胞傳代1. 紫外消毒 30min 后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作 者的雙手。2. 培養(yǎng)液，胰酶，恒溫水浴箱 37預(yù)熱 20min，備用。3. 將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺面內(nèi)，點燃酒精燈， 再將瓶口對準在酒精

9、燈上消毒 2-3 次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分 別放于酒精燈的兩側(cè)。4. 將培養(yǎng)皿蓋內(nèi)口朝上放在架子上， 將培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進污缸。 取 1ml 移液器快速移動在酒精燈上消毒 1-2 次，然后再裝上槍頭吸取 1-2ml 胰酶液，懸 空沿皿壁加入培養(yǎng)皿內(nèi)。5. 將培養(yǎng)皿來回傾倒使胰酶浸沒整個皿底的細胞層，計時越 1-3min（消化時間 根據(jù)細胞不同時間不同） ，對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙， 并 有 1-2 個細胞脫落，鏡下觀察到細胞都變圓時為胰酶消化的最適時機。 （若看到 成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度； 若看不到針孔樣縫隙和細胞脫落， 或鏡 下細胞多有菱角

10、則需繼續(xù)消化）。用移液器將胰酶吸凈。6. 吸取 1ml 培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿內(nèi)，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復(fù)沖洗 培養(yǎng)瓶壁 5-8 次，使貼壁細胞完全脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打 2-3 次，使細胞盡 可能處于單個懸浮狀態(tài)。7. 取 1 或 2 個新的培養(yǎng)皿，然后將細胞培養(yǎng)基均勻的分到 2 或 3 個培養(yǎng)瓶內(nèi)（注 意原來傳代時使用的培養(yǎng)瓶可繼續(xù)傳代使用），進行 1 傳 2 或 1 傳 3 的培養(yǎng)。8. 拿出 1 支高壓后的 5ml 定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上， 再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身 2-3 次，懸空進入培養(yǎng)基皿內(nèi)吸取 5-10ml 培養(yǎng)基懸空移入每個培養(yǎng)皿內(nèi)，

11、將培養(yǎng)皿蓋在酒精燈上消毒 2-3 次蓋上， 在皿蓋上做好實驗標記。9. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒 2-3 次后擰緊， 熄滅酒精燈， 整理實驗臺面， 取出實 驗試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺。10. 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。注意整個培養(yǎng)箱底托盤內(nèi)一定要放高壓后的 水，且定期更換確保無菌。每天定時觀察細胞生長情況，一般 72-96h 后，細胞生長密度大于 90%，即可進 行細胞的傳代或保株。五、細胞株的保存 原理：細胞凍存最常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法， 主要采用加適量保護劑的緩慢 冷凍法凍存細胞。 細胞在不加任何保護劑的情況下直接冷凍， 細胞內(nèi)外的水分會 很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應(yīng)。如細胞

12、脫水使局部電解質(zhì)濃度增高， pH 值改變，部分蛋白質(zhì)由于上述原因而變性，引起細胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)紊亂，溶 酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶， 使細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)成分造成破壞， 線粒體腫 脹，功能丟失， 并造成能量代謝障礙。 胞膜上的類脂蛋白復(fù)合體也易破壞引起細 胞膜通透性的改變， 使細胞內(nèi)容物丟失。 如果細胞內(nèi)冰晶形成較多， 隨冷凍溫度 的降低，冰晶體積膨脹造成細胞核 DNA空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷， 而致細胞死 亡。因此， 細胞冷凍技術(shù)的關(guān)鍵是盡可能地減少細胞內(nèi)水分， 減少細胞內(nèi)冰晶的 形成。采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿 透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通

13、透性，且對細胞無明顯毒性。慢 速冷凍方法又可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外， 減少胞內(nèi)形成冰結(jié)晶的機會， 從而 減少冰晶對細胞的損傷。實驗步驟： 選擇處于對數(shù)生長期的細胞， 在凍存前一天最好換液。 將多個培養(yǎng)瓶中的細胞培 養(yǎng)液去掉，用 % 胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管 吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細胞， 使其成為均勻分散的細胞懸液。 懸浮生產(chǎn)細 胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心 （1000r/min ，10 分鐘） 。加 入凍存管中，再加入 1ml 配置好的凍存液后放入梯度降溫盒， 放入-80 冰箱中。1. 紫外消毒 30min 后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺正常工

14、作狀態(tài)，用酒精消毒操作 者的雙手。2. 培養(yǎng)液，胰酶，二甲基亞砜 DMS，O 胎牛血清（解凍），梯度降溫盒恢復(fù)常溫， 恒溫水浴箱 37預(yù)熱 20min，備用。3. 將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺面內(nèi)，點燃酒精燈， 再將瓶口對準在酒精燈上消毒 2-3 次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分 別放于酒精燈的兩側(cè)。4. 將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒 2-3 次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋 2-3次， 蓋放于酒精燈右側(cè)后將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進污缸， 在酒精燈消毒 2-3 次瓶 口，豎直放好。取 1ml 移液器快速移動在酒精燈上消毒 1-2次，然后再裝上槍頭 吸取胰酶液，懸空移入

15、培養(yǎng)瓶內(nèi)。5. 將培養(yǎng)皿蓋內(nèi)口朝上放在架子上， 將培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進污缸。 取 1ml 移液器快速移動在酒精燈上消毒 1-2 次，然后再裝上槍頭吸取 1-2ml胰酶液，懸 空沿皿壁加入培養(yǎng)皿內(nèi)。6. 將培養(yǎng)皿來回傾倒使胰酶浸沒整個皿底的細胞層，計時越 1-3min（消化時間 根據(jù)細胞不同時間不同） ，對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙， 并 有 1-2 個細胞脫落，鏡下觀察到細胞都變圓時為胰酶消化的最適時機。 （若看到 成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度； 若看不到針孔樣縫隙和細胞脫落， 或鏡 下細胞多有菱角則需繼續(xù)消化）。用移液器將胰酶吸凈。6. 吸取 1ml 培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿，

16、并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復(fù)沖洗培 養(yǎng)瓶壁 5-8 次，使貼壁細胞完全脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打 2-3 次，使細胞盡可 能處于單個懸浮狀態(tài)。7. 將懸浮細胞吸入 15ml 離心管內(nèi)，加入 4ml 培養(yǎng)基離心 1000r/min ，5min8. 預(yù)先配制凍存液： 10 % DMSO + 90%。按需要配置一定數(shù)量備用9. 棄去培養(yǎng)基，用凍存液進行重懸混勻后， 將 1ml 含有細胞的凍存液移入凍存管 內(nèi)，擰緊瓶蓋，做好實驗標記。10. 將培養(yǎng)基， 胰酶瓶口和瓶蓋消毒 2-3 次后擰緊，熄滅酒精燈， 整理實驗臺面， 取出實驗試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺。8. 將凍存管先放于 4冰箱 30mi

17、n 后拿出放置 -20冰箱過夜，次日再放于 -80 的冰箱內(nèi) 3-4 天，最后存放于 -196 的液氮灌內(nèi)長期保存?；蛑苯臃湃胩荻冉禍?盒內(nèi)，放入 -80 冰箱內(nèi)過夜后最后存放于液氮罐內(nèi)。（梯度降溫盒內(nèi)為甲醇， 使用 5 次需要更換，每次使用需做好標記，使用前需恢復(fù)常溫）六、細胞轉(zhuǎn)染RNA干擾( RNA interference, RNAi ):是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈 RNA(double-stranded RNA，dsRNA) 誘發(fā)的、同源 mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象?；虺聊?，主要有轉(zhuǎn)錄前水平 的基因沉默 (TGS)和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默 (PTGS)兩類:TGS 是指由于

18、DNA修 飾或染色體異染色質(zhì)化等原因使基因不能正常錄 ;PTGS是啟動了細胞質(zhì)內(nèi)靶 mRNA序列特異性的降解機制。有時轉(zhuǎn)基因會同時 導(dǎo)致 TGS和 PTGS。由于使用 RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達，(長度超過三 十的 dsRNA會引起干擾素毒性) 所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳 染性疾病及惡性腫瘤的治療領(lǐng)域。病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、等外源隨機整合到基因組內(nèi)，并利用宿主細胞進 行轉(zhuǎn)錄時，常產(chǎn)生一些 dsRNA。對這些 dsRNA迅即產(chǎn)生反應(yīng)。作用機制1) 其胞質(zhì)中的 Dicer 將 dsRNA切割成多個具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段 RN(A大 約 2123 bp )，即

19、siRNA。2) siRNA在細胞內(nèi) RNA的作用下成正義鏈和，繼之由反義 siRNA 再與體內(nèi)一些 酶(包括內(nèi)切酶、 、解旋酶等)結(jié)合形成 RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物 (RNA-induced silencing complex ，RISC)。3) RISC與外源性基因表達的 mRNA的同源區(qū)進行特異性結(jié)合， RISC具有的功能， 在切割 mRN，A 切割位點即是與 siRNA中互補結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂 mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細胞針對這些 mRNA的降解反應(yīng)。4) siRNA不僅能引導(dǎo) RISC切割同源單鏈 mRN，A 而且可作為引物與靶 RNA結(jié)合 并在(RNA-dependen

20、t RNA polymerase ， RdRP)作用下合成更多新的 dsRNA， 新合成的 dsRNA再由 Dicer 切割產(chǎn)生大量的次級 siRNA，從而使 RNAi 的作用 進一步放大，最終將靶 mRNA完全降解。5) RNAi發(fā)生于除以外的所有真核生物細胞內(nèi)。 需要說明的是， 由于 dsRNA抑制 基因表達具有潛在高效性， 任何導(dǎo)致正常 dsRNA形成的情況都會引起不需要 的相應(yīng)。 所以正常機體內(nèi)各種基因有效表達有一套嚴密防止 dsRNA形成的機 制。iiiiiuiiiiaiiiiiiiiicompuyrorxary mHMATnuW、，：4XJ、LXdsRNAmRMA Cleavage

21、mRNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染原理：1. 脂質(zhì)體是磷脂分散在水中時形成的脂質(zhì)雙分子層， 又稱為人工生物膜。 最初， 人們只是運用脂質(zhì)體模擬生物膜，研究膜的構(gòu)造及功能，從而發(fā)現(xiàn)了膜的融 合及內(nèi)吞作用，因而可用作外源物質(zhì)進入細胞的載體 ?2. 陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷， 能與核酸的磷酸根通過靜電作用將 DNA 分子包 裹人內(nèi)，形成 DNA 一脂復(fù)合體 ，也能被表面帶負電荷的細胞膜吸附，再通 過膜的融合或細胞的內(nèi)吞作用，偶爾也通過直接滲透作用，將 DNA 傳遞進 入細胞，形成包涵體或進入溶酶體其中一小部分 DNA 能從包涵體內(nèi)釋放， 并進入細胞質(zhì)中 ，再進一步進入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達DNA轉(zhuǎn)染步驟1. 轉(zhuǎn)染前一天接種

22、細胞于 6 孔板， 150每孔， 2ml 無抗生素培養(yǎng)基每孔，第二 天轉(zhuǎn)染時細胞達到 90-95%每孔。2. 轉(zhuǎn)染前半小時換 Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基。3. A液： DNA 5ug 加入 245ul Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻。4. B液：脂質(zhì)體使用前輕輕混勻，脂質(zhì)體 10ul 加入 245ul Opti-MEM 無血清培 養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜止 5min。5. B液加入 A 液，用槍輕輕混勻，室溫靜止 20min。6. 將混合液均勻分散慢慢滴加到 6孔板細胞中， 邊滴加變前后左右十字交叉搖 晃。7. 孵箱 37培養(yǎng) 48h（轉(zhuǎn)染時間待定）。8. 第二天看細胞狀態(tài)來決定是否

23、換液。9. 同時設(shè)立細胞對照組，空白轉(zhuǎn)染組。siRNA轉(zhuǎn)染步驟1）轉(zhuǎn)染前一天接種細胞于 6 孔板（ 40x104），2ml 無抗生素培養(yǎng)基每孔，第二 天轉(zhuǎn)染時細胞達到 50-60%每孔。2）轉(zhuǎn)染前半小時換 Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基。3）A液： siRNA 5ul（共100pmol）加入 245ul Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混 勻。（ siRNA按照說明書稀釋）4）B液：脂質(zhì)體（RNAimax）使用前輕輕混勻，脂質(zhì)體10ul 加入245ul Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜止 5min。5）B液加入 A 液，用槍輕輕混勻，室溫靜止 20min。6）將混合液均勻分散慢慢滴加到 6孔板細胞中， 邊滴加變前后左右十字交叉搖 晃。7）孵箱 37培養(yǎng) 48h（轉(zhuǎn)染時間待定）。8）第二天看細胞狀態(tài)來決定是否換液。9）同時設(shè)立細胞對照組，空白轉(zhuǎn)染組。使用 RNAiMAX和AGS cell用于 siRNA在6孔板上進行轉(zhuǎn)染實驗1) 提前配制 GA