14微生物學(xué)《-DNA的復(fù)制和修復(fù) 》2

1、第十三章 DNA的復(fù)制和修復(fù) 第一節(jié) DNA的復(fù)制 (DNA replication) DNA復(fù)制的幾個(gè)原則： 1 . 半保留復(fù)制(Semiconservative ) DNA復(fù)制時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而成兩股單鏈，各 自作為模板，合成新的互補(bǔ)鏈。子代細(xì)胞出現(xiàn)的DNA 雙鏈，其中一條單鏈?zhǔn)菑挠H代完整地接受過來，另一 條單鏈?zhǔn)切潞铣傻?，這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。 1958年，M.Meselson和F.W.Stahl用同位素標(biāo)記和密度 梯度離心的方法首次證明了這種復(fù)制機(jī)制。 The Meselson- Stahl experiment was designed to distinguish betw

2、een two alternative DNA replication mechanisms . 1963年，Cairns用放射自顯影的方法，第一次觀 察到完整的正在復(fù)制的大腸桿菌的DNA，證明大腸 桿菌的DNA是一個(gè)環(huán)狀分子，以半保留的方式進(jìn)行 復(fù)制。 A C B DNA的半保留復(fù)制可以說明DNA在代謝上的 穩(wěn)定性。經(jīng)過許多代的復(fù)制后，DNA的結(jié)構(gòu)仍然 可以保持完整，這與它的遺傳功能是相符的。 2. DNA復(fù)制有固定的起點(diǎn)，而且通常 是雙向復(fù)制 原核生物的DNA和質(zhì)粒DNA屬于環(huán)狀雙鏈 DNA，具有一個(gè)固定的復(fù)制起點(diǎn)，從該起點(diǎn)開始， 雙向等速度地復(fù)制。復(fù)制過程中，在電鏡下可以看 到一個(gè)形如眼

3、睛的結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)制眼，它類似于希 臘字母，所以這種復(fù)制方式又稱為復(fù)制。 Replication of a circular chromosome produces a structure resembling the Greek letter theta (), and shows that both strands are replicated at the same time . Addition of 3H thymidine for a short period just before the reaction is stopped allows a distinction to be

4、 made between unidirectional and bidirectional replication. 真核生物的DNA是線狀雙鏈DNA，有多個(gè)復(fù)制 起點(diǎn)，在每個(gè)復(fù)制起點(diǎn)上雙向、等速度地進(jìn)行復(fù)制。 3. DNA復(fù)制的方向?yàn)? 3 ，是半不連續(xù) 的 子鏈DNA的復(fù)制方向都是5 3 ，所以母鏈的 讀鏈方向是3 5。 (前導(dǎo)鏈) (后續(xù)鏈) (岡崎片段) 一、DNA的聚合反應(yīng) 從大腸桿菌中提取的DNA聚合酶，能在具 備 底物：4種dNTP 模板：一條單鏈DNA 引物：一小段與模板配對(duì)的DNA或RNA， 具備3-OH Mg2+ 的條件下，使4種 dNTP聚合起來。新加上的dNTP 與引

5、物的3 -OH作用，形成3, 5-磷酸二酯鍵，且 所加上的核苷酸要與模板上的堿基互補(bǔ)配對(duì)，合成 方向是從53。 DNA聚合酶催化聚合酶催化DNA鏈的延長(zhǎng)鏈的延長(zhǎng) DNA聚合酶 二、與DNA聚合有關(guān)的酶 DNA聚合酶 原核生物DNA聚合酶 DNA聚合酶 (Pol )由大腸桿菌的polA基因編 碼的一條多肽鏈，分子量為109KD，每個(gè)大腸桿菌中 約有400個(gè)Pol 分子，它催化脫氧核苷酸聚合的速 度為1000個(gè)/分。 Pol 具有的功能： 按53方向延長(zhǎng)核苷酸鏈的功能； 35外切酶的功能； 53外切酶的功能； 該外切酶功能的特點(diǎn)是切去的核苷酸是正確配對(duì) 的，這種功能在DNA的復(fù)制中引物的切除及DN

6、A損傷 的修復(fù)中起著重要作用。 正常的堿基互補(bǔ)配對(duì) 由于互變異構(gòu)等導(dǎo) 致的不正常配對(duì) DNA 聚合酶的35外切酶的校對(duì)作用 DNA 的53外切酶 功能可以切除 一段與模板配 對(duì)的DNA或 RNA鏈，同時(shí) 又可以合成一 段新的DNA單 鏈，表現(xiàn)為 “切口位移”。 用枯草桿菌蛋白酶將Pol 水解成大、小兩個(gè)片 段，大片段有聚合酶和35外切酶的功能，又稱為 Klenow片段。 DNA聚合酶聚合酶的空間構(gòu)型的空間構(gòu)型 DNA聚合酶( Pol)也需要模板、引物、底 物和Mg2+，合成方向也是53,也具有35外切 酶功能，但沒有53外切酶功能。它只在無Pol 和Pol的 時(shí)候才發(fā)揮聚合酶作用,每個(gè)大腸桿菌

7、中 有約40個(gè)酶分子。 DNA聚合酶 (Pol)在大腸桿菌中的量只有 Pol的1/20，但活性比Pol高40倍以上，每分鐘 能催化105個(gè)核苷酸的聚合，是大腸桿菌中真正負(fù) 責(zé)合成DNA的聚合酶，由多種亞基組成。 E.coli中三種中三種DNA聚合酶的比聚合酶的比 較較 E.coliDNA聚合酶聚合酶的亞基組成及主要功能的亞基組成及主要功能 E.coli DNA聚合酶-亞基形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)圍繞著DNA雙鏈。 真核生物的DNA聚合酶 真核生物中發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有、四種。 -DNA聚合酶的活性與DNA合成的活躍程度有時(shí) 相的相關(guān)，負(fù)責(zé)真核生物DNA中后隨鏈的合成； -DNA聚合酶存在于細(xì)胞核，最適pH

8、為堿性，有 最強(qiáng)的外切酶活性，被認(rèn)為與損傷的修復(fù)有關(guān)。 -DNA聚合酶存在于線粒體，參與線粒體DNA的 復(fù)制。 -DNA聚合酶是多亞基酶，有35外切酶活性， 負(fù)責(zé)真核生物DNA中前導(dǎo)鏈的合成。 復(fù)制的保真性 DNA聚合酶對(duì)模板的依賴性，是子鏈與母鏈 能準(zhǔn)確配對(duì)，使遺傳信息延續(xù)、傳代的保證。要確 保DNA復(fù)制的保真性，至少依賴三種機(jī)理： 遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律； 聚合酶在復(fù)制延長(zhǎng)中對(duì)堿基的選擇作用； 復(fù)制中出錯(cuò)時(shí)有及時(shí)的校對(duì)功能。 DNA連接酶(ligase) 因?yàn)镈NA聚合酶不能將3-OH和5-PO32-連 接起來，所以不能形成閉合、連續(xù)的子鏈。 DNA連接酶是能催化一條DNA鏈的3-OH和

9、另一條DNA鏈的5-PO32-之間形成磷酸二酯鍵的酶， 但連接的都是堿基互補(bǔ)基礎(chǔ)上的雙鏈中的單鏈缺口， 它并沒有連接單獨(dú)存在的DNA單鏈或RNA單鏈的能 力，也沒有連接超過兩個(gè)堿基以上的缺口的能力。 常用的DNA連接酶有兩種： 大腸桿菌的DNA連接酶： 能催化粘性末端的連接； T4DNA連接酶： 既能催化粘接，也能催化平頭連接； 連接反應(yīng)的能量來源： 細(xì)菌的DNA連接酶以NAD作為能量來源； 動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體的DNA連接酶以ATP為能量來源； DNA連接酶的作用機(jī)理連接酶的作用機(jī)理 DNA引物酶(primase） 因?yàn)镈NA聚合酶不能起始合成新的DNA鏈，所以 需要合成一段引物提供3-OH。

10、催化RNA引物形成的酶就是RNA引物酶，本質(zhì)上 屬于以DNA為模板的RNA聚合酶，但與催化轉(zhuǎn)錄的 RNA聚合酶有本質(zhì)的不同：引物酶在模板的起始部位 催化互補(bǔ)堿基的聚合，形成10-60個(gè)核苷酸長(zhǎng)的RNA的 引物片段。 DNA解螺旋酶(helicase) DNA在復(fù)制之前，須先排除核苷酸之間的氫 鍵作用和疏水性基團(tuán)的相互作用，將雙鏈解開， DNA解螺旋酶就是一類通過水解ATP獲得能量，在 復(fù)制叉處解開DNA雙鏈的酶。每解開一對(duì)雙鍵， 要消耗2個(gè)ATP的2個(gè)高能鍵。 DNA解螺旋酶首先同DNA的單鏈部分結(jié)合， 再按復(fù)制叉移動(dòng)方向向雙鏈部分延伸，DNA helicase和Rep蛋白(解螺旋酶的一種)協(xié)

11、同作用， 前者結(jié)合在滯后鏈的模板上(即在方向53母鏈上 隨復(fù)制叉方向移動(dòng))，后者結(jié)合在前導(dǎo)鏈的模板上。 DNA單鏈結(jié)合蛋白(DNA SSB) DNA解螺旋酶解開的雙鏈由DNA單鏈結(jié)合蛋白來 穩(wěn)定，DNA SSB的特性就是能專一性地同DNA分子中 已解開的單鏈區(qū)結(jié)合，阻止復(fù)性和DNA被核酸酶降解。 SSB同DNA結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 (topisomerase ) DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶可以將共價(jià)閉環(huán)的超螺旋 DNA解開成松弛態(tài)的閉合環(huán)狀DNA，反應(yīng)機(jī)理是先 切開雙鏈DNA的一條鏈，使鏈的末端螺旋向擰松超 螺旋的方向轉(zhuǎn)動(dòng)，然后再將切口連接起來，所以兼 有水解酶和連接酶的功能。每作用

12、一次，使負(fù)超螺 旋數(shù)目+1。 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 (topisomerase) 與DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶相反，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 能在DNA中引入負(fù)超螺旋，作用機(jī)理是在ATP提供能 量下，水解切斷DNA的兩條鏈，兩條鏈的斷口同時(shí)饒 過切口，然后再重新形成磷酸二酯鍵。每作用一次可 使超螺旋數(shù)目2。 三種能催化形成磷酸二酯鍵的酶的比較 提供3-OH 提供5-P 結(jié)果 DNA聚合酶 引物或延長(zhǎng)中的新鏈 游離的dNTP 形成(dNMP)n+1 DNA連接酶 復(fù)制中不連續(xù)的兩條單鏈 形成連續(xù)的鏈 DNA拓?fù)涿?切斷并整理后的單鏈或雙鏈 改變拓?fù)錉顟B(tài) 三、 DNA的復(fù)制過程 E.coli 復(fù)制的起始位點(diǎn)(oriC

13、) 要開始復(fù)制，至少需要以下的蛋白質(zhì)因子： DnaA蛋白 ：識(shí)別oriC，在特定部位解開雙鏈 DnaB蛋白： 即解螺旋酶 DnaC蛋白： 幫助DnaB在起始位點(diǎn)的結(jié)合 HU: 類似組蛋白的蛋白質(zhì)，啟動(dòng)復(fù)制的起 始 引物酶 ： 合成RNA引物 SSB： 結(jié)合單鏈DNA DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶： 釋放DNA解鏈產(chǎn)生的超螺旋 1. 復(fù)制的起始 E. 中中 DNA 復(fù)復(fù) 制制 的的 起起 始始 coli 在解鏈酶、SSB和拓?fù)涿傅让讣暗鞍?質(zhì)因子的共同作用下，DNA雙鏈解開成單 鏈。 復(fù)制的延長(zhǎng) 延長(zhǎng)階段同樣需要解螺旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶解開雙 鏈，需要SSB穩(wěn)定DNA單鏈，但前導(dǎo)鏈和滯后鏈的復(fù)制 是完全不同的。

14、 前導(dǎo)鏈的復(fù)制，可以由53方向，在引物上連 續(xù)進(jìn)行，直至復(fù)制終點(diǎn)。 在滯后鏈上，要先由引物酶分段合成RNA引物， 在各段引物上按53方向分別形成DNA片段(即岡崎 片段)至前一個(gè)岡崎片段的前方為止。引物酶和其他蛋 白質(zhì)因子共同組成引發(fā)體。 前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成實(shí)際上是由DNA聚合酶 二聚體催化同時(shí)完成的。 E.coliDNA聚合酶聚合酶二聚體的作用機(jī)理二聚體的作用機(jī)理 復(fù)制的終止 DNA聚合酶利用其53核酸外切酶的活性， 將岡崎片段的RNA引物水解，產(chǎn)生的空隙由后面的岡 崎片段繼續(xù)延伸填補(bǔ)，這個(gè)過程也由DNA聚合酶來 完成，延長(zhǎng)直至前一個(gè)片段的5-P，最后由DNA連接 酶將片段之間所剩的小缺口

15、通過形成磷酸二酯鍵連接 起來，成為真正連續(xù)的子鏈。 第二節(jié) DNA的損傷與修復(fù) DNA的突變和保守是對(duì)立統(tǒng)一的自然現(xiàn)象， 沒有突變，就沒有今天多種多樣的物種。 突變的分子基礎(chǔ) 突變就是DNA分子上堿基的改變，分為自發(fā) 突變和誘發(fā)突變。 突變的后果有以下四種： 致死性的； 使生物體功能喪失； 只改變基因型而無表現(xiàn)型的改變； 有益的突變。 根據(jù)DNA分子的改變，可把突變分為 點(diǎn)突變 DNA分子上一個(gè)堿基的變換，又分為 轉(zhuǎn)換（同型堿基的相互替換）和顛換（異 型堿基的相互替換）； 缺失 一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈從DNA分子上消失； 插入 一個(gè)原來沒有的堿基或一段原來沒有的核苷 酸鏈插入到DNA分子中間；

16、缺失和插入可以 引起移碼突變， 倒位 DNA鏈內(nèi)部重組，使其中一段方向反置，或 大片段的鏈在DNA分子內(nèi)遷移。 誘發(fā)突變的原因及突變類型 誘變因素 突變類型 物理因素 紫外線照射 形成胸腺嘧啶二聚體 離子輻射 打斷DNA分子的共價(jià)鍵 化學(xué)因素 5-溴尿嘧啶 使A-T對(duì)最終變成G-C對(duì) 羥胺 使G-C對(duì)最終變成A-T 對(duì) 亞硝酸鹽 使G-C對(duì)最終變成A-T對(duì) 氮芥類 使DNA鏈脫鳥嘌呤 復(fù)制 甲基化的甲基化的G使使DNA發(fā)生發(fā)生G-CA-T的突變的突變 二、 損傷的修復(fù) 光修復(fù) 紫外線引起相鄰嘧啶堿基 紫外線引起相鄰嘧啶堿基 之間形成二聚體。之間形成二聚體。 光光 復(fù)復(fù) 活活 酶酶 修修 復(fù)復(fù)

17、嘧嘧 啶啶 二二 聚聚 體體 切除修復(fù) 這是細(xì)胞具有的一種普遍的功能，對(duì)多種損傷 造成的DNA雙螺旋的不正常結(jié)構(gòu)均能加以去除。 1. 不配對(duì)的堿基的切除修復(fù) 2. 能正確配對(duì)的異常堿基的切除修復(fù) 3. 核苷酸的切除修復(fù) 重組修復(fù) 這是一種復(fù)制后修復(fù)，參與修復(fù)的酶系主要是重 組基因recA編碼的蛋白質(zhì)，它具有交換DNA鏈的能力。 recA、 recB、 聚合酶、 連接酶 SOS修復(fù) 當(dāng)細(xì)胞損傷至難以繼續(xù)復(fù)制的地步，單鏈缺口 很多時(shí)，會(huì)誘發(fā)這種應(yīng)急的修復(fù)方式。參與反應(yīng)的 有重組蛋白R(shí)ecA和調(diào)控蛋白LexA，還有校對(duì)功能 較差的DNA聚合酶，使復(fù)制能在損傷部位進(jìn)行， 但卻帶來了高的變異率。 第二節(jié) 在RNA指導(dǎo)下的DNA的合成 以RNA為模板，按照RNA中的核苷酸順序合成