惡性腫瘤病人外周血免疫指標(biāo)的流式細(xì)胞儀檢測(cè)及免疫治療前后免疫功能變化的研究其它醫(yī)學(xué)論文

1、sdgsdgs成都分行東風(fēng)浩蕩合法規(guī)和法規(guī)和土壤突然圖騰【摘要】目的探討應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(fcm)檢測(cè)惡性腫瘤病人外周血淋巴細(xì)胞多項(xiàng)免疫指標(biāo)的變化及該指標(biāo)對(duì)惡性腫瘤免疫治療前后的臨床價(jià)值。方法采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)50例惡性腫瘤病人和31例健康人的外周血cd3、cd4、cd8等八項(xiàng)免疫指標(biāo)變化，并且對(duì)其中10例病人應(yīng)用免疫制劑治療前后對(duì)抗原表達(dá)的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果惡性腫瘤病人免疫功能紊亂：(1)細(xì)胞免疫和體液免疫功能低下；(2)活化t淋巴細(xì)胞明顯增多(p0.01)；(3)接受免疫治療的病人治療前后差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。結(jié)論用流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞抗原為臨床觀察腫瘤病人的免疫狀態(tài)提供有效的依

2、據(jù)，免疫治療可激活t淋巴細(xì)胞而改善免疫功能?！娟P(guān)鍵詞】惡性腫瘤；流式細(xì)胞儀；淋巴細(xì)胞；cd；免疫治療【abstract】objectivetoexploretheapplicationofflowcytometryforthechangesofmultipleimmuneindexesinperipheralbloodofmalignanttumorpatientsandtheclinicvalueoftheindexesfortheimmunotherapyofmalignanttumor.methodsflowcytometrywasemployedfordeterminingeighti

3、ndexes，includingcd3、4、8，et.of50malignanttumorpatientsand31healthypersons.furthermore，theresultsbeforeandafterimmunotherapyof10patientswerecompared.resultsimmunefunctionofmalignanttumorpatientsisgenerallydisordered.1.boththecellimmunityandthebodyfluidimmunityarelow.2.thelevelofactivetlymphocytesaregr

4、eatlyhighwiththecontrol(p0.01).3.forthetencaseswhoreceivedimmunotherapy，whichhavestatisticdifferencecomparedbythatbeforethecourse(p0.01).conclusiondetermininglymphocytesantigensbyflowcytometryprovidesaneffectivebasisforevaluatingtheimmunefunctionoftumorpatientsinclinic.immunotherapycanbeactivetlymph

5、ocytesoastoimproveimmunefunction.【keywords】flowcytometry；malignanttumor；lymphocyte；clusterofdifferentiation(cd)；immunotherapy惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫系統(tǒng)密切相關(guān)。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)的方法，檢測(cè)t淋巴細(xì)胞表面抗原(cd3、cd4、cd8)，b淋巴細(xì)胞表面抗原(cd19、cd20)，nk細(xì)胞表面抗原(cd16+56)在惡性腫瘤病人外周血中的表達(dá)，并檢測(cè)活化t、b、nk淋巴細(xì)胞的免疫指標(biāo)(cd3/hla-dr、cd3/cd25)的變化，探討淋巴細(xì)胞在腫瘤中的表達(dá)狀況及其意義

6、，并進(jìn)一步分析惡性腫瘤病人免疫治療前后的免疫功能改變，以致使我們更深一層認(rèn)識(shí)腫瘤在細(xì)胞水平的免疫功能。1資料與方法1.1研究對(duì)象2003年8月2004年5月本院腫瘤科病房50例惡性腫瘤病人，均經(jīng)病理確診，其中肺癌23例，肝癌6例，乳癌4例，胃癌5例，胰腺癌2例，淋巴瘤4例，結(jié)腸癌3例，鼻咽癌1例，腎癌2例。男28例，女22例，年齡2965歲，平均57歲。其中10例(肺癌6例，淋巴瘤4例)年齡2953歲，平均41歲，經(jīng)免疫增強(qiáng)劑(高聚生4ml靜滴，每日1次，共3個(gè)月；白介素30萬(wàn)u皮下注射，每周2次，共3個(gè)月)治療一療程(3個(gè)月)后，復(fù)查一次。對(duì)照組31例為健康體檢者，男18例，女13例，年齡3

7、650歲，平均43歲，其中年齡和性別構(gòu)成比與病人組差異無(wú)顯著性(p0.05)。1.2材料與儀器小鼠抗人單克隆抗體cd4/cd8/cd3、cd19、cd20、cd3/cd16+56、cd3/hla-dr、cd3/cd25及同型對(duì)照、紅細(xì)胞裂解液(optilysec)均為法國(guó)immunotech公司出品。流式細(xì)胞儀(epicsxlmcl)是美國(guó)beckmancoulter公司生產(chǎn)。1.3研究方法使用直接免疫熒光標(biāo)記全血溶血法，流式細(xì)胞儀測(cè)定腫瘤病人外周血淋巴細(xì)胞表面抗原表達(dá)。1.3.1淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記取熒光標(biāo)記單克隆抗體cd4/cd8/cd3、cd3/cd16+56、cd3/hla-dr、cd3/

8、cd25、cd19、cd20各10l放入試管中，分別加入外周全血100l，室溫避光孵育15min。并作同型對(duì)照。1.3.2溶血加入optilysec500l，混勻，室溫避光10min。1.3.3洗滌離心(1500r/min)5min，棄去上清液，加入pbs液1ml，混勻。重復(fù)洗滌1次。1.3.4重懸加入1mlpbs，混勻，制成單細(xì)胞懸液。1.3.5檢測(cè)上機(jī)，每個(gè)樣品檢測(cè)5000個(gè)以上細(xì)胞，用fcm軟件分析，計(jì)算淋巴細(xì)胞中各標(biāo)記細(xì)胞的百分率。最后所有數(shù)據(jù)應(yīng)用spss進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果對(duì)50例惡性腫瘤病人與31例健康體檢者進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞表面抗原fcm檢測(cè)，做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見表1。對(duì)10例

9、腫瘤病人在免疫治療前后淋巴細(xì)胞表面抗原和活化t淋巴細(xì)胞抗原的表達(dá)進(jìn)行了fcm測(cè)定，發(fā)現(xiàn)cd4+、cd3+、cd4/cd8比值、cd3+/cd16+56+、cd3+/hla-dr+、cd3-/hla-dr+治療前均較治療后有顯著性升高(p0.01)，見表2。表1病人組與對(duì)照組淋巴細(xì)胞表面抗原及t淋巴細(xì)胞活化抗原表達(dá)的比較(%，xs)注：與對(duì)照組相比，*p0.01，*p0.05表210例腫瘤病人免疫治療前后淋巴細(xì)胞表面抗原和活化t細(xì)胞抗原表達(dá)的變化(xs)注：與治療后相比，*p0.013討論腫瘤不是一個(gè)簡(jiǎn)單的疾病過程，腫瘤免疫更是一個(gè)復(fù)雜的過程。惡性腫瘤病人往往免疫功能狀態(tài)紊亂和低下，而免疫狀態(tài)在

10、一定程度上可預(yù)示著腫瘤的發(fā)展和預(yù)后1。由于腫瘤免疫過程復(fù)雜特異蛋白少，或是腫瘤細(xì)胞或蛋白樣物質(zhì)掩蓋了腫瘤抗原，使目前檢查手段和蛋白分離方法尚不能檢出腫瘤抗原。而通過實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物和對(duì)人類惡性腫瘤病人大量研究表明：免疫系統(tǒng)的所有有效應(yīng)成分均對(duì)消除腫瘤細(xì)胞、控制腫瘤生長(zhǎng)有作用，發(fā)揮免疫功能的淋巴細(xì)胞約占白細(xì)胞總量的20%，可分為t、b細(xì)胞、nk細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。通常采用單克隆抗體來(lái)分析細(xì)胞表面抗原分子，并對(duì)其分化群(簇，clustersofdifferentiation)進(jìn)行了定義，用cd來(lái)描述白細(xì)胞表面抗原的不同成分。這樣通過對(duì)惡性腫瘤病人相應(yīng)免疫指標(biāo)(cd分子)的檢測(cè)，可對(duì)惡性腫瘤病人的

11、預(yù)后進(jìn)行判斷并指導(dǎo)治療和觀察轉(zhuǎn)歸57。3.1t淋巴細(xì)胞及表面抗原(cd4、cd8、cd3)與腫瘤的關(guān)系大量研究工作已證實(shí)，宿主對(duì)機(jī)體內(nèi)發(fā)生的腫瘤組織有自發(fā)性抵抗現(xiàn)象，而且以細(xì)胞免疫為主8。眾所周知，機(jī)體的細(xì)胞免疫由t淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，t淋巴細(xì)胞的主要功能是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)抗原引起的所有免疫應(yīng)答，并清除細(xì)胞表面抗原或細(xì)胞內(nèi)微生物的效應(yīng)作用。t淋巴細(xì)胞進(jìn)一步分化為輔助性t淋巴細(xì)胞(th，cd4+/cd3+)和細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ts，cd8+/cd3+)，對(duì)于抗原刺激的應(yīng)答，輔助性t淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。細(xì)胞因子可促進(jìn)t淋巴細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的增殖和分化。mcmichael認(rèn)為9t淋巴細(xì)胞作為細(xì)胞免

12、疫調(diào)節(jié)的中心樞紐，th和ts細(xì)胞之間的平衡是通過cd4+和cd8+細(xì)胞之間的百分比表達(dá)出來(lái)的，其值下降表示免疫狀態(tài)受抑制。目前研究還發(fā)現(xiàn)，cd4+細(xì)胞在協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞中起著重要作用18，cd4+細(xì)胞數(shù)減少可使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸10，11。亦有學(xué)者認(rèn)為機(jī)體發(fā)生腫瘤時(shí)，在腫瘤局部的微環(huán)境發(fā)生免疫功能紊亂，表現(xiàn)為局部的cd8+亞群增高或降低，或識(shí)別腫瘤抗原上發(fā)生障礙，但惡性腫瘤病人的免疫功能直到很晚才發(fā)生12。對(duì)于大多數(shù)腫瘤細(xì)胞來(lái)說(shuō)，腫瘤細(xì)胞表達(dá)cd8+而不是cd4+，cd4+不能辨認(rèn)腫瘤細(xì)胞，而是依賴于抗原提呈細(xì)胞，如果相關(guān)的腫瘤抗原被巨噬細(xì)胞提呈(dc)，則對(duì)cd4特異性激活后才分泌淋巴因子

13、激活ctl細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和b細(xì)胞，產(chǎn)生其他淋巴因子和淋巴毒素和腫瘤壞死因子，腫瘤壞死因子可溶解腫瘤細(xì)胞。本文通過對(duì)50例惡性腫瘤病人和31例健康人進(jìn)行外周血fcm檢測(cè)，腫瘤組cd3、cd4+/cd3+、cd4/cd8比值明顯低于對(duì)照組，腫瘤組cd8+/cd3+明顯高于對(duì)照組，這表明惡性腫瘤病人的細(xì)胞免疫明顯低下(p0.05或p0.01)。3.2b淋巴細(xì)胞及表面抗原(cd19、cd20)與腫瘤的關(guān)系腫瘤的體液免疫是b細(xì)胞及抗體依賴的殺傷作用。b細(xì)胞表面免疫球蛋白與腫瘤抗原結(jié)合，處理和遞呈腫瘤抗原，從而誘導(dǎo)t細(xì)胞對(duì)腫瘤的應(yīng)答。b細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體是多克隆異源性抗體。cd20是一非免疫球蛋白產(chǎn)物，參與

14、細(xì)胞激活，是b細(xì)胞的特異性標(biāo)志，前b細(xì)胞至活化b細(xì)胞時(shí)表達(dá)這一分子。而cd19作為全b細(xì)胞表面標(biāo)志性抗原，是b細(xì)胞活化的共受體13，在b細(xì)胞活化后消失，在外周血中正常分布為815。通過對(duì)cd19與cd20的檢測(cè)，可在一定程度上反映出機(jī)體體液免疫功能狀態(tài)14。本文對(duì)50例腫瘤病人的cd19、cd20進(jìn)行檢測(cè)，其中惡性腫瘤病人組cd19與cd20明顯低于健康對(duì)照組(p0.01)，表明腫瘤體液免疫也明顯受抑制，與文獻(xiàn)報(bào)道一致15。3.3nk細(xì)胞及表面抗原(cd16、cd56)與腫瘤的關(guān)系nk細(xì)胞是正常機(jī)體中對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高度細(xì)胞毒性作用的淋巴樣細(xì)胞，是一種廣譜的殺傷細(xì)胞，對(duì)阻止腫瘤生長(zhǎng)起重要作用。n

15、k細(xì)胞是不同于t、b淋巴細(xì)胞的淋巴細(xì)胞群，它們?cè)隗w內(nèi)相對(duì)較少，它們來(lái)源于骨髓的大顆粒細(xì)胞。它們不需預(yù)先致敏即能分泌細(xì)胞毒因子，從而殺傷腫瘤細(xì)胞16。雖然nk細(xì)胞無(wú)靶細(xì)胞特異性，但在缺乏抗體和adcc效應(yīng)時(shí)，它們表現(xiàn)幾種水平的靶細(xì)胞選擇性：首先，它們對(duì)腫瘤細(xì)胞比對(duì)大部分正常細(xì)胞更具毒性作用；其次，不同的nk細(xì)胞克隆對(duì)不同來(lái)源的腫瘤類群表現(xiàn)不同的細(xì)胞毒模式。nk細(xì)胞代表了宿主抵抗原發(fā)和轉(zhuǎn)移部位腫瘤生長(zhǎng)的第一道防線，并通過t細(xì)胞補(bǔ)充特異性抗腫瘤應(yīng)答。在某種意義上說(shuō)，nk能強(qiáng)烈殺傷腫瘤細(xì)胞。有研究表明，體外介導(dǎo)殺傷大多腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞亞群，90以上是激活的nk細(xì)胞17，18。nk細(xì)胞表面標(biāo)志主要是cd1

16、6和cd56，其中cd16一般表達(dá)于未成熟nk細(xì)胞表面，cd56于成熟nk細(xì)胞表面，二者有交叉。其表達(dá)水平與nk細(xì)胞的整體活性具有相當(dāng)?shù)淖饔?，其下降提示機(jī)體nk細(xì)胞作用受抑制，細(xì)胞免疫功能下降，不能有效發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞作用2。陸云等認(rèn)為19cd16或cd56細(xì)胞數(shù)與nk細(xì)胞活性相關(guān)性隨不同疾病及疾病不同階段而變化。張峻梅等20認(rèn)為，肺癌病人nk細(xì)胞數(shù)與正常對(duì)照無(wú)顯著性差異。本文對(duì)50例腫瘤病人和31例健康人的nk細(xì)胞即cd3+/cd16+56+進(jìn)行比較，惡性腫瘤病人nk細(xì)胞較對(duì)照組顯著升高(p0.01)。這并不說(shuō)明惡性腫瘤病人在細(xì)胞免疫和體液免疫降低時(shí)，nk細(xì)胞數(shù)量和活性增加。nk升高只是一種

17、假象，因?yàn)闇y(cè)定時(shí)t+b+nk的值應(yīng)在95105之間3，而t、b細(xì)胞值均降低，為了維持總淋巴細(xì)胞數(shù)量的恒定，nk的測(cè)定值升高，其實(shí)惡性腫瘤病人的nk細(xì)胞活性是降低的。3.4活化淋巴細(xì)胞及表面抗原(cd25、hla-dr)與腫瘤的關(guān)系靜止t淋巴細(xì)胞在接受刺激后可發(fā)生增殖活化而形成效應(yīng)細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞因子的分泌及細(xì)胞因子受體和粘附分子在細(xì)胞表面表達(dá)。t淋巴細(xì)胞活化需t細(xì)胞受體與相應(yīng)抗原結(jié)合為第一信號(hào)，同時(shí)又必須輔以第二信號(hào)即共刺激分子的結(jié)合，而t淋巴細(xì)胞的分裂增殖是以細(xì)胞因子與il-受體(il-2r)的結(jié)合為啟動(dòng)信號(hào)的，故可以通過檢測(cè)t淋巴細(xì)胞的cd3+/hla-dr+、cd3+/cd25+等活化抗

18、原來(lái)監(jiān)測(cè)t淋巴細(xì)胞活化狀態(tài)。本文通過對(duì)50例惡性腫瘤病人和31例健康人cd3/hla-dr和cd3/cd25進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤病人cd3+/hla-dr+顯著降低(p0.01)，表明活化t細(xì)胞減少，但其中并不說(shuō)明沒有產(chǎn)生活化t細(xì)胞，而是因總t細(xì)胞減少而導(dǎo)致其數(shù)值降低；cd3+/hla-dr-升高，靜止t細(xì)胞則相應(yīng)增多(p0.05)；cd3-/hla-dr-顯著降低(p0.01)，表明活化b、nk細(xì)胞也減少；而cd3+/cd25+無(wú)顯著變化(p0.05)；體外的活化t淋巴細(xì)胞試驗(yàn)證明，許多細(xì)胞因子可增強(qiáng)hla-dr的表達(dá)，如ifn、il-1、tnf-2等，從而增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能和抗腫瘤效

19、應(yīng)21。本文對(duì)10例惡性腫瘤病人應(yīng)用白介素-和高聚生治療3個(gè)月后，所測(cè)活化t、b、nk淋巴細(xì)胞較治療前顯著升高(p0.01)，表明t、b、nk細(xì)胞開始活化，而cd3+/cd25+細(xì)胞無(wú)明顯增加，可能與白介素-治療病例較少有關(guān)。此外，本文檢測(cè)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)cd3+與cd3+/hla-dr+呈正相關(guān)性(r=0.49，p0.01)。3.5免疫治療與腫瘤的關(guān)系免疫既影響腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤的宿主也會(huì)發(fā)生免疫的改變，如果能使免疫低下的惡性腫瘤病人免疫功能得以調(diào)節(jié)，必然有利于腫瘤的控制。許多研究表明，患有腫瘤的個(gè)體可對(duì)腫瘤產(chǎn)生免疫抑制。隨著人們對(duì)人類腫瘤抗原分子的認(rèn)識(shí)，腫瘤細(xì)胞具有抗原性并能引起抗體免疫應(yīng)答是腫瘤免

20、疫治療的基礎(chǔ)。免疫治療作為癌癥治療方法的一種，主要通過宿主天然防御機(jī)制或天然哺乳動(dòng)物材料做藥物而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，生物療法是繼手術(shù)、放療、化療之后，已成為癌癥治療的第四種重要方法。本文結(jié)果提示惡性腫瘤病人的免疫功能存在缺陷，免疫治療可改善病人t淋巴細(xì)胞的數(shù)量和比例；同時(shí)，亦可直接刺激t淋巴細(xì)胞的活化，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞和體液免疫功能。體外試驗(yàn)中，il-2的使用提高了淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤的反應(yīng)性22，il-2用來(lái)刺激產(chǎn)生lak細(xì)胞，lak細(xì)胞可依一種非mhc限制方式識(shí)別新鮮腫瘤細(xì)胞，而不識(shí)別正常細(xì)胞2325，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本文對(duì)10例惡性腫瘤病人進(jìn)行高聚生、il-2免疫治療，并觀察治療前后各分子

21、的變化，其中cd4+/cd3+、cd3+、cd4/cd8比值、nk細(xì)胞(cd3+/cd16+56+)、活化t淋巴細(xì)胞(cd3+/hla-dr+)，活化b、nk細(xì)胞(cd3-/hla-dr+)較對(duì)照組均顯著性增高(p0.01)。這表明經(jīng)過免疫治療后，體內(nèi)腫瘤分泌的可溶性免疫抑制因子減少，機(jī)體通過t細(xì)胞的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致cd4+t細(xì)胞活性加強(qiáng)，調(diào)節(jié)激活了t、b、nk細(xì)胞的功能，從而改善了機(jī)體的細(xì)胞免疫功能?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1畢愛華，龔非力.醫(yī)學(xué)免疫學(xué).北京：人民軍醫(yī)出版社，1995，12-848.2gabrielintroductiontomedicalimmunologyusa，1991，583-58

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