瓊脂糖凝膠電泳和SDSPAGE凝膠電泳2

1、凝膠電泳凝膠電泳分離長(zhǎng)度分離長(zhǎng)度 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳200bp近近50kb 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 5500bp 分辨率高分辨率高 采用不同濃度的凝膠可以分辨采用不同濃度的凝膠可以分辨DNA分子的范圍分子的范圍 2021-6-2112015/5/6 DNA/RNA的瓊脂糖凝膠檢測(cè)的瓊脂糖凝膠檢測(cè) 2021-6-2122015/5/6 一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理 電泳是現(xiàn)在用于分離和純化DNA/RNA片段的最常 用技術(shù)。當(dāng)制備好的一塊“膠”即一塊包含電解質(zhì)的 多孔支持介質(zhì)并把它置于靜電場(chǎng)中，DNA/RNA分子將 向陽極移動(dòng)，這是因?yàn)镈NA/RNA分子沿其雙螺旋骨架 兩側(cè)帶有

2、富含負(fù)電荷的磷酸根殘基。 當(dāng)DNA/RNA長(zhǎng)度增加時(shí)，來自凝膠的阻力就會(huì)增加， 不同長(zhǎng)度的DNA/RNA片段就會(huì)出現(xiàn)不同的遷移率。因 而就可依據(jù)DNA/RNA分子的大小使其分離 2021-6-2132015/5/6 含不同量瓊脂糖的凝膠的分離范圍含不同量瓊脂糖的凝膠的分離范圍 凝膠中的瓊脂糖含量凝膠中的瓊脂糖含量%(W/V)DNA/RNA分子的分離范圍分子的分離范圍(kb) 0.3560 0.6120 0.70.810 0.90.57 1.20.46 1.50.23 20.12 2021-6-2142015/5/6 核酸染料核酸染料 1. 溴化乙錠（溴化乙錠（EB）是一種為芳香族類染料，當(dāng)）是

3、一種為芳香族類染料，當(dāng)DNA樣樣 品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，瓊脂糖凝膠中的品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，瓊脂糖凝膠中的EB就插就插 入入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物，使分子中形成熒光絡(luò)合物，使DNA發(fā)射的熒光發(fā)射的熒光 增強(qiáng)幾十倍，電泳后就可直接紫外燈照射下檢測(cè)瓊脂增強(qiáng)幾十倍，電泳后就可直接紫外燈照射下檢測(cè)瓊脂 糖中的糖中的DNA。 2. Godview吖啶橙類核酸低毒染料目前尚未發(fā)現(xiàn)具有吖啶橙類核酸低毒染料目前尚未發(fā)現(xiàn)具有 致癌性。致癌性。 3. Genegreen花青素母體為基礎(chǔ)，苯環(huán)改良成鏈?zhǔn)浇Y(jié)花青素母體為基礎(chǔ)，苯環(huán)改良成鏈?zhǔn)浇Y(jié) 構(gòu)的油性大分子，目前認(rèn)為的最低毒的核酸綠色染料。構(gòu)的油性大分子，目前

4、認(rèn)為的最低毒的核酸綠色染料。 備注：一般將核酸染料加入備注：一般將核酸染料加入loading buffer中可以減少中可以減少 污染及減少用量（污染及減少用量（1ml loading buffer ：10ul染料）。染料）。 2021-6-215 2015/5/6 電泳緩沖液的組成電泳緩沖液的組成 1. Tris乙酸（乙酸（TAE） 2. Tris硼酸（硼酸（TBE） 3. Tris磷酸（磷酸（TPE） 其濃度約為其濃度約為50mmoL/L，PH為為7.57.8,這些緩沖液這些緩沖液 均含有均含有EDTA。這些緩沖液通常配制成濃縮液，貯存。這些緩沖液通常配制成濃縮液，貯存 于室溫于室溫。 20

5、21-6-216 2015/5/6 常用的電泳緩沖液的配制常用的電泳緩沖液的配制 緩沖液緩沖液使用液使用液濃貯存液（每升）濃貯存液（每升） Tris乙酸乙酸 （TAE） 1：0.04moL/L Tris乙酸乙酸 0.001moL/L EDTA 50：242g Tris堿堿 57.7mL 冰乙酸冰乙酸 100mL 0.5moL/L EDTA (PH8.0) Tris磷酸磷酸 （TPE） 1：0.09moL/L Tris磷酸磷酸 0.002moL/L EDTA 10：108g Tris堿堿 15.5mL 85%磷酸磷酸 40mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0) Tris硼酸硼酸 （TBE

6、） 0.50.045moL/L Tris硼酸硼酸 0.001moL/L EDTA 5：54g Tris堿堿 27.5g硼酸硼酸 20mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0) 2021-6-2172015/5/6 加樣緩沖液加樣緩沖液 緩沖液類型緩沖液類型 6緩沖液緩沖液貯存溫度貯存溫度 I 0.25%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán) 0.25%二甲苯青二甲苯青FF 40%（W/V）蔗糖水溶液）蔗糖水溶液 4 II 0.25%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán) 0.25%二甲苯青二甲苯青FF 15%聚蔗糖水溶液聚蔗糖水溶液 室溫室溫 III 0.25%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán) 0.25%二甲苯青二甲苯青FF 30%甘油水溶液甘油水溶液 4 I

7、V 0.25%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán) 40%（W/V蔗糖水溶液）蔗糖水溶液） 4 V （堿性加樣緩沖液）（堿性加樣緩沖液） 300m moL/L NaoH 6 mmoL/L EDTA 18%聚蔗糖水溶液聚蔗糖水溶液 015%溴甲酚綠溴甲酚綠 025%二甲苯青二甲苯青FF 4 2021-6-2182015/5/6 1. 加樣緩沖液可以增大樣品密度，以確保加樣緩沖液可以增大樣品密度，以確保DNA均勻進(jìn)均勻進(jìn) 入樣品孔內(nèi)，還可以使樣品呈現(xiàn)顏色，從而使加樣操入樣品孔內(nèi)，還可以使樣品呈現(xiàn)顏色，從而使加樣操 作更為便利。作更為便利。 2. 溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的速率約為二甲苯青溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的速率約為

8、二甲苯青FF 的的2.2倍倍, 溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的速率約與長(zhǎng)溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的速率約與長(zhǎng) 300bp的雙鏈線性的雙鏈線性DNA相同相同,而二甲苯青而二甲苯青FF在瓊脂糖在瓊脂糖 凝膠中移動(dòng)的速率則與凝膠中移動(dòng)的速率則與4kb雙鏈線性雙鏈線性DNA相同。相同。 2021-6-2192015/5/6 DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)記 1. DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)記通常叫作 DNA Marker, 2. 本實(shí)驗(yàn)使用MarkerIII，分別由200 bp、500 bp、800 bp、1200 bp、2000 bp、3000 bp和4500 bp的7條DNA 條帶組成，DNA Marker不僅可以作為凝膠中

9、DNA片 段長(zhǎng)度的一個(gè)標(biāo)記，還可以作為電泳的對(duì)照。 2021-6-2110 2015/5/6 二、實(shí)驗(yàn)方法二、實(shí)驗(yàn)方法 1、50TAE的稀釋：如制備的稀釋：如制備50mL 1TAE，取，取1mL 50TAE加入加入49mL水定容至水定容至50mL。 2、制備、制備1%的瓊脂糖膠液：取的瓊脂糖膠液：取0.2g瓊脂糖溶于瓊脂糖溶于20mL TAE中，在短時(shí)間里加熱瓊脂糖全部熔化，使溶液中，在短時(shí)間里加熱瓊脂糖全部熔化，使溶液 冷卻至冷卻至60。 2021-6-21112015/5/6 2021-6-2112 2015/5/6 3、用于、用于RNA電泳的電泳槽用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙電泳的電

10、泳槽用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙 醇干燥后灌滿醇干燥后灌滿3% 的的H2O2溶液，于室溫放置溶液，于室溫放置10分鐘，然后用分鐘，然后用 DEPCSDW沖洗電泳槽，梳子同樣處理。沖洗電泳槽，梳子同樣處理。 4、在制膠槽中放好梳子。將融化的瓊脂糖凝膠導(dǎo)入膠槽中。室溫、在制膠槽中放好梳子。將融化的瓊脂糖凝膠導(dǎo)入膠槽中。室溫 冷卻冷卻15-20min 5、將溫?zé)岘傊堑谷肽z床中，凝膠的厚度在、將溫?zé)岘傊堑谷肽z床中，凝膠的厚度在35mm之間，凝固之間，凝固 1520min。 基本參數(shù)（北京六一）：基本參數(shù)（北京六一）： 外型尺寸（外型尺寸（LWH）：）：31015090mm 凝膠板規(guī)格凝膠板規(guī)格

11、(LW)：6060mm；12060mm；60120mm；120120mm 試樣格：試樣格：11+25齒齒(1.0mm厚厚)；6+13齒齒,8+18齒齒(1.5mm厚厚)；2+3齒齒(2.0mm厚厚) 緩沖液總?cè)萘浚杭s緩沖液總?cè)萘浚杭s650ml 重量：重量：1Kg2021-6-2113 2015/5/6 6、在凝膠完全凝固之后，小心垂直移去梳子，將膠床放在電泳槽、在凝膠完全凝固之后，小心垂直移去梳子，將膠床放在電泳槽 內(nèi)，加樣孔一側(cè)靠近陰極（黑極）。內(nèi)，加樣孔一側(cè)靠近陰極（黑極）。 7、向電泳槽中注入適量的、向電泳槽中注入適量的TAE緩沖液，通常緩沖液高于膠面緩沖液，通常緩沖液高于膠面1cm。

12、8、分別將、分別將DNA/RNA樣品與加樣緩沖液混合樣品與加樣緩沖液混合,用移液槍將樣品加入用移液槍將樣品加入 加樣孔。加樣孔。 9、正確連接電泳槽和電源，設(shè)定穩(wěn)壓為、正確連接電泳槽和電源，設(shè)定穩(wěn)壓為140V，電流一般為，電流一般為50mA。 10、電泳結(jié)束后，在紫外觀測(cè)儀上進(jìn)行觀察。、電泳結(jié)束后，在紫外觀測(cè)儀上進(jìn)行觀察。 2021-6-2114 2015/5/6 三、注意事項(xiàng)與實(shí)驗(yàn)技巧三、注意事項(xiàng)與實(shí)驗(yàn)技巧 1. 制膠和加樣過程中要防治氣泡的產(chǎn)生。制膠和加樣過程中要防治氣泡的產(chǎn)生。 2. 紫外光對(duì)人眼有害，觀察時(shí)加蓋玻璃罩，觀察時(shí)間不宜太長(zhǎng)。紫外光對(duì)人眼有害，觀察時(shí)加蓋玻璃罩，觀察時(shí)間不宜太

13、長(zhǎng)。 3. EB具有強(qiáng)誘變性，可致癌。必須戴手套操作，嚴(yán)格注意防護(hù)。具有強(qiáng)誘變性，可致癌。必須戴手套操作，嚴(yán)格注意防護(hù)。 4. 加樣時(shí)，加樣時(shí)，Tip頭不宜插入樣品孔太深，也不要穿破膠孔壁，否頭不宜插入樣品孔太深，也不要穿破膠孔壁，否 則樣品滲漏或則樣品滲漏或DNA帶型不整齊。帶型不整齊。 5. 配膠和灌電泳槽需使用同一批緩沖液。因?yàn)榕淠z和灌電泳槽需使用同一批緩沖液。因?yàn)閜H 或離子強(qiáng)度很或離子強(qiáng)度很 小的差別也會(huì)在凝膠前部造成紊亂，影響小的差別也會(huì)在凝膠前部造成紊亂，影響DNA 片段的泳動(dòng)。片段的泳動(dòng)。 6. 梳板的選用梳板的選用 一般每個(gè)制膠模具均配有多個(gè)齒型不同的梳板，一般每個(gè)制膠模具均

14、配有多個(gè)齒型不同的梳板， 梳齒寬厚，形成的點(diǎn)樣容積較大，用于梳齒寬厚，形成的點(diǎn)樣容積較大，用于DNA 片段回收實(shí)驗(yàn)等；片段回收實(shí)驗(yàn)等； 相反，梳齒窄而薄，形成的點(diǎn)樣容積就較小，用于相反，梳齒窄而薄，形成的點(diǎn)樣容積就較小，用于PCR產(chǎn)物、產(chǎn)物、 酶切產(chǎn)物鑒定等。一般來說，上樣量小時(shí)盡量選擇薄的梳板制酶切產(chǎn)物鑒定等。一般來說，上樣量小時(shí)盡量選擇薄的梳板制 膠，此時(shí)電泳條帶致密清晰，便于結(jié)果分析。膠，此時(shí)電泳條帶致密清晰，便于結(jié)果分析。 2021-6-2115 2015/5/6 四、跑出好看的電泳圖四、跑出好看的電泳圖 1. 凝膠一定要加熱熔解完全，均勻，可以對(duì)著光亮的地方看看清凝膠一定要加熱熔解完

15、全，均勻，可以對(duì)著光亮的地方看看清 澈不清澈澈不清澈 ； 2. 一般情況下，梳子越薄而長(zhǎng)，條帶越好看一般情況下，梳子越薄而長(zhǎng)，條帶越好看 ； 3. 上樣量不宜過多，會(huì)造成條帶的相互擠壓；上樣量不宜過多，會(huì)造成條帶的相互擠壓； 4. 如果點(diǎn)樣孔多余，將樣點(diǎn)到中間，盡量避免邊緣效應(yīng)如果點(diǎn)樣孔多余，將樣點(diǎn)到中間，盡量避免邊緣效應(yīng) ，中間，中間 電場(chǎng)比較均勻電場(chǎng)比較均勻 ； 5. 做膠的緩沖液和跑膠的緩沖液濃度應(yīng)該一致；做膠的緩沖液和跑膠的緩沖液濃度應(yīng)該一致； 6. 加樣時(shí)不要太快，讓其自然沉底，均勻分布在電泳孔內(nèi)加樣時(shí)不要太快，讓其自然沉底，均勻分布在電泳孔內(nèi) ； 7. 電泳開始時(shí)可以采用低電壓使其

16、跑出孔后，再調(diào)高電壓。電泳開始時(shí)可以采用低電壓使其跑出孔后，再調(diào)高電壓。 2021-6-2116 2015/5/6 SDS-PAGE凝膠電泳凝膠電泳 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 二二 2021-6-2117 SDS-PAGE凝膠電泳凝膠電泳 1.1.實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 2.2.實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 3.3.注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 4.SDS-PAGE的優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn) 5.SDS-PAGE的缺點(diǎn)的缺點(diǎn) 6.6.實(shí)驗(yàn)常見問題及處理實(shí)驗(yàn)常見問題及處理 7.7.小技巧小技巧 2021-6-2118 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 l基本原理基本原理 l分類分類 l分離范圍分離范圍 2021-6-2119 丙丙烯烯酰胺酰胺 N,N-亞甲基雙亞甲基雙

17、丙烯酰胺丙烯酰胺 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 四甲基乙二胺四甲基乙二胺( (TEMED) ) 過硫酸胺過硫酸胺(AP) 激活作用激活作用 激活作用激活作用 共聚合共聚合 2021-6-2120 基本原理之一基本原理之一 l陰離子去污劑陰離子去污劑SDS破壞蛋白質(zhì)分子之間破壞蛋白質(zhì)分子之間 及與其它物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)及與其它物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì) 變性而改變其原有的構(gòu)象，并同蛋白質(zhì)分子充變性而改變其原有的構(gòu)象，并同蛋白質(zhì)分子充 分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)- -SDS復(fù)合物。復(fù)合物。 l強(qiáng)還原劑巰基乙醇強(qiáng)還原劑巰基乙醇打開蛋白質(zhì)分子內(nèi)的打開蛋白質(zhì)分子內(nèi)的

18、 二硫鍵使這種結(jié)合更加充分。二硫鍵使這種結(jié)合更加充分。 2021-6-2121 基本原理之二基本原理之二 l結(jié)合了結(jié)合了SDS的蛋白質(zhì)在水溶液中的形狀類似于長(zhǎng)的蛋白質(zhì)在水溶液中的形狀類似于長(zhǎng) 橢圓棒，不同的蛋白質(zhì)橢圓棒，不同的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物其橢圓棒的短復(fù)合物其橢圓棒的短 軸長(zhǎng)度恒定，而長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度則與軸長(zhǎng)度恒定，而長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度則與蛋白質(zhì)分子量蛋白質(zhì)分子量的的 大小成正比。大小成正比。 l這樣的蛋白質(zhì)這樣的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在電場(chǎng)作用下，其遷移復(fù)合物在電場(chǎng)作用下，其遷移 率便不再受蛋白質(zhì)原有的凈電荷及形狀等因素的率便不再受蛋白質(zhì)原有的凈電荷及形狀等因素的 影響，而主要取決于其分子量大小這一因

19、素。根影響，而主要取決于其分子量大小這一因素。根 據(jù)這一特點(diǎn)，就可以將各蛋白組分按分子量大小據(jù)這一特點(diǎn)，就可以將各蛋白組分按分子量大小 分開。分開。 2021-6-2122 分類分類 PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連連 續(xù)系統(tǒng)續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)不連續(xù)系統(tǒng)兩大類. 連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中, ,緩沖液緩沖液pH值及凝值及凝 膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主 要靠電荷和分子篩效應(yīng)要靠電荷和分子篩效應(yīng)。 2021-6-2123 2021-6-2124 不連續(xù)系統(tǒng)不連續(xù)系統(tǒng) l不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液

20、離子成分，pH， 凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆 粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩電荷效應(yīng)，分子篩 效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶，因而其分離條帶 清晰度及分辨率均較前者佳。清晰度及分辨率均較前者佳。 2021-6-2125 濃縮膠濃縮膠 l濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小， 孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過 大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的 區(qū)帶。區(qū)帶。 分離膠

21、分離膠 l孔徑較小孔徑較小,通過選擇合適的凝膠濃度通過選擇合適的凝膠濃度,可以可以 使樣品很好的分離使樣品很好的分離. 2021-6-2126 lSDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于用于灌膠的聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于用于灌膠的聚聚 丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度。在沒有交聯(lián)劑的情況下聚合的。在沒有交聯(lián)劑的情況下聚合的 丙烯酰胺形成毫無價(jià)值的粘稠溶液，而經(jīng)雙丙烯酰胺交聯(lián)丙烯酰胺形成毫無價(jià)值的粘稠溶液，而經(jīng)雙丙烯酰胺交聯(lián) 后凝膠的剛性和抗張強(qiáng)度都有所增加，并形成后凝膠的剛性和抗張強(qiáng)度都有所增加，并形成SDS-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 復(fù)合物必須通過的小孔。這些小孔的孔徑隨復(fù)合物必須

22、通過的小孔。這些小孔的孔徑隨 “雙丙烯酰雙丙烯酰 胺丙烯酰胺胺丙烯酰胺” 比率的增加而變小比率的增加而變小，比率接近，比率接近 1：20 時(shí)孔時(shí)孔 徑達(dá)到最小值。徑達(dá)到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按聚丙烯酰胺凝膠大多按“雙丙烯酰雙丙烯酰 胺丙烯酰胺胺丙烯酰胺”為為1：29 配制，試驗(yàn)表明它能分離大小相配制，試驗(yàn)表明它能分離大小相 差只有差只有3% 的蛋白質(zhì)。的蛋白質(zhì)。 分離范圍分離范圍 2021-6-2127 變性膠變性膠濃縮膠濃縮膠 10%8 ml5%4ml (2 cm) H2O3.2 mlH2O3.2 ml 30% 丙烯酰胺2.7 ml30% 丙烯酰胺0.67 ml 1.5M Tris

23、HClPH8.82 ml1 M TrisHClPH8.81 ml 10% SDS100 l10% SDS50 l 10% AP50 l10% AP25 l TEMED5 lTEMED5 l 2021-6-2128 活性膠活性膠 6%8 ml H2O4.2 ml 30% 丙烯酰胺1.67 ml 1.5M TrisHClPH8.82.02 ml 10% AP100 l TEMED10 l 膠的配制方法膠的配制方法 l凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，而孔徑又是灌凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，而孔徑又是灌 膠時(shí)所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對(duì)濃度的函數(shù)。膠時(shí)所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對(duì)濃度的函數(shù)。 用用51

24、5%的丙烯酰胺所灌制凝膠的線性分離范圍的丙烯酰胺所灌制凝膠的線性分離范圍 如下表：如下表： 丙烯酰胺濃度丙烯酰胺濃度（%）線性分離范圍線性分離范圍（kD） 151243 101668 7.53694 5.057212 雙丙烯酰胺丙烯酰胺摩爾比為雙丙烯酰胺丙烯酰胺摩爾比為 1：29。 2021-6-2129 上樣緩沖液之一上樣緩沖液之一 上樣緩沖液上樣緩沖液(SDS-PAGE loading buffer)是一種以是一種以 溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)為染料，為染料，5倍濃縮的倍濃縮的SDS-PAGE凝膠電泳上樣凝膠電泳上樣 緩沖液，用于常規(guī)的緩沖液，用于常規(guī)的SDS-PAGE蛋白電泳樣品上樣。蛋白電泳樣品上樣

25、。 本產(chǎn)品分為本產(chǎn)品分為還原型和非還原型還原型和非還原型兩種，還原型上兩種，還原型上 樣緩沖液中的巰基可使蛋白分子的鏈內(nèi)二硫鍵和鏈樣緩沖液中的巰基可使蛋白分子的鏈內(nèi)二硫鍵和鏈 間二硫鍵斷裂，使通過二硫鍵連接的各亞單位彼此間二硫鍵斷裂，使通過二硫鍵連接的各亞單位彼此 分離，在電泳凝膠上顯現(xiàn)多個(gè)蛋白條帶，選購和使分離，在電泳凝膠上顯現(xiàn)多個(gè)蛋白條帶，選購和使 用時(shí)請(qǐng)務(wù)必注明，仔細(xì)區(qū)分。用時(shí)請(qǐng)務(wù)必注明，仔細(xì)區(qū)分。 2021-6-2130 上樣緩沖液上樣緩沖液 之二之二 l注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 還原型上樣緩沖液中含一定量的還原型上樣緩沖液中含一定量的DTT（二（二 硫蘇糖醇）硫蘇糖醇）或巰基乙醇，有輕微刺激

26、性氣味，或巰基乙醇，有輕微刺激性氣味， 較易區(qū)分；較易區(qū)分； 含巰基的試劑有一定的毒性，為了安全和含巰基的試劑有一定的毒性，為了安全和 健康，應(yīng)穿健康，應(yīng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。 2021-6-2131 上樣緩沖液上樣緩沖液 之三之三 使用說明使用說明 1.1.按每按每4 l蛋白樣品加入蛋白樣品加入1l蛋白上樣緩沖液的比蛋白上樣緩沖液的比 例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液(5X)。 2. 100或沸水浴加熱或沸水浴加熱35min，以充分變性蛋，以充分變性蛋 白。白。 3. 冷卻到室溫后取上清直接上樣到冷卻到室溫后取上清直接上樣到SDS

27、-PAGE膠膠 加樣孔內(nèi)即可。加樣孔內(nèi)即可。 4. 通常電泳時(shí)染料到達(dá)膠的底端附近（通常電泳時(shí)染料到達(dá)膠的底端附近（0.5 1cm)即可停止電泳。即可停止電泳。 2021-6-2132 增加樣品密度以保證蛋白質(zhì)沉入加樣孔增加樣品密度以保證蛋白質(zhì)沉入加樣孔 內(nèi)，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的內(nèi)，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油甘油 或蔗糖或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。，這樣可以增加樣品的比重。 上樣緩沖液中的甘油非常重要，起增加上樣緩沖液中的甘油非常重要，起增加 粘度的作用，這可以阻止樣品從梳樣孔中擴(kuò)粘度的作用，這可以阻止樣品從梳樣孔中擴(kuò) 散出來到電泳緩沖液中。散出來到電泳緩沖液中。 指示劑

28、檢測(cè)電泳的行進(jìn)過程指示劑檢測(cè)電泳的行進(jìn)過程，一般加入，一般加入 泳動(dòng)速率較快的溴酚藍(lán)指示電泳的前沿泳動(dòng)速率較快的溴酚藍(lán)指示電泳的前沿 。 上樣緩沖液上樣緩沖液 之四之四 2021-6-2133 單純的固定液一般難以達(dá)到這些要求，因此在實(shí)單純的固定液一般難以達(dá)到這些要求，因此在實(shí) 驗(yàn)中使用兩種混和的固定液。驗(yàn)中使用兩種混和的固定液。Carnoy固定液（甲醇固定液（甲醇: : 冰乙酸冰乙酸= =3:l）每次使用前需臨時(shí)配制每次使用前需臨時(shí)配制，長(zhǎng)時(shí)間放置影，長(zhǎng)時(shí)間放置影 響固定效果，固定時(shí)間響固定效果，固定時(shí)間15min至至24 h，冰箱、室溫均，冰箱、室溫均 可。可。 甲醇甲醇/冰醋酸固定液冰醋

29、酸固定液 2021-6-2134 甲醇甲醇/冰醋酸固定液冰醋酸固定液 甲醇甲醇：有固定、硬化和脫水的作用?？梢怨潭ò椎鞍住?球蛋白、核蛋白，但對(duì)核蛋白固定效果較差(親和力小 且易自溶)。甲醇固定的特點(diǎn)是殺死快，滲透力強(qiáng)，對(duì) 組織收縮較大(可收縮20左右)，可使材料變硬。 冰醋酸冰醋酸：純醋酸在溫度稍變低時(shí)即形成冰晶，所以又 稱為冰醋酸。常用0.30.5的濃度作為固定液。冰醋 酸對(duì)材料有膨脹作用，對(duì)核蛋白固定好，可與水、酒精、 氯仿混合。 2021-6-2135 電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、 脫色后的凝膠照片脫色后的凝膠照片 圖1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)與待測(cè)樣品電泳圖譜 9

30、4 000 62 000 43 000 31 000 20 100 14 400 注：膠槽1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白；膠槽2、3樣品蛋白 考馬斯亮藍(lán)染色考馬斯亮藍(lán)染色 常用染色方法常用染色方法 銀染法銀染法 金屬離子染色法金屬離子染色法 以考馬斯亮藍(lán)染色為例以考馬斯亮藍(lán)染色為例 蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到 平衡測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍為平衡測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍為01000gmL，是一種常用，是一種常用 的微量蛋白質(zhì)快速測(cè)定方法。的微量蛋白質(zhì)快速測(cè)定方法。 2021-6-2136 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 試劑配制試劑配制 (1) 30%丙烯酰胺（丙烯酰

31、胺（Acr）：）：稱Acr30g，甲叉雙 丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸餾水至100ml，過濾 后置棕色瓶中。 4，12月 （2）10%SDS（十二烷基磺酸鈉） （3）1.5mol/L Tris-HCl緩沖液緩沖液(pH8.9)： 稱取Tris 18.2g, 加入50ml水,用1mol/L鹽酸調(diào) pH8.8,最后用蒸餾水定容至100ml。 2021-6-2137 （4）1.0mol/LTris-HCl緩沖液緩沖液(pH6.8): 稱取Tris12.1g,加入50ml水，用1mol/L 鹽酸調(diào)pH6.8,最后用蒸餾水定容至100ml （5）0.05mol/LTris-HCl緩沖液緩沖液(pH8

32、.0)： 稱取Tris0.6g,加入50ml水，用1mol/L鹽酸 調(diào)pH8.0,最后用蒸餾水定容至100ml （）TEMED（四甲基乙二胺） 2021-6-2138 （）（）上樣緩沖液上樣緩沖液： SDS（100mg）+巰基乙醇（巰基乙醇（0.1ml）+ 溴酚藍(lán)溴酚藍(lán) （2mg）+甘油（甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl （2ml），最后定容至），最后定容至10ml （）固定液：（）固定液：50%甲醇甲醇454ml，冰乙酸，冰乙酸46ml混勻混勻 （）染色液：（）染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)稱取考馬斯亮藍(lán)R250 0.125g，加，加 上述固定液上述固定液250ml，過

33、濾后備用，過濾后備用 2021-6-2139 （1）脫色液：）脫色液： 冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至 1000ml （1）電極緩沖液）電極緩沖液 （內(nèi)含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸緩沖液pH8.3）：稱Tris6.0g， 甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸餾水使其溶解 后定容至1000ml 2021-6-2140 （1212）高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒）高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒: : 兔磷酸化酶兔磷酸化酶B MW=97,400 B MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 MW=66,200MW=66,200 兔肌動(dòng)蛋白兔肌動(dòng)蛋白

34、MW=43,000MW=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000 MW=31,000 胰蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑 MW=20,100MW=20,100 雞蛋清溶菌酶雞蛋清溶菌酶 MW=14,400MW=14,400 置置-20-20保存，使用前室溫融化，沸水浴中加熱保存，使用前室溫融化，沸水浴中加熱3-3- 5 5分鐘后上樣。分鐘后上樣。 （1313）樣品：兔血清）樣品：兔血清 2021-6-2141 .聚膠前準(zhǔn)備聚膠前準(zhǔn)備 (1) 配制配制10過硫酸銨溶液過硫酸銨溶液(需每天新鮮配需每天新鮮配 制制)。 (2) 將單體儲(chǔ)存液、緩沖液、水按照一定比將單體儲(chǔ)存液、緩沖液、水按照一

35、定比 例配制成凝膠溶液。例配制成凝膠溶液。 (3) 將灌膠裝置準(zhǔn)備好。將灌膠裝置準(zhǔn)備好。 (4) 待凝膠溶液平衡至室溫待凝膠溶液平衡至室溫(2325)后，真后，真 空脫氣空脫氣15 min。 2021-6-2142 1）.安裝膜具 將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干, , 將凡士林均將凡士林均 勻的涂在兩側(cè)的封條上，用封條將玻璃板勻的涂在兩側(cè)的封條上，用封條將玻璃板 封好。封好。 稱取稱取2g2g瓊脂糖加瓊脂糖加100ml100ml蒸餾水，慢慢的煮蒸餾水，慢慢的煮 開（煮的過程中要不斷攪拌），將煮好的開（煮的過程中要不斷攪拌），將煮好的 ( (無氣泡無氣泡) )瓊脂糖倒入支膠架三

36、分之二高度，瓊脂糖倒入支膠架三分之二高度， 快速將兩側(cè)封好的玻璃板插入瓊脂糖中，快速將兩側(cè)封好的玻璃板插入瓊脂糖中， 注意注意凹槽朝外凹槽朝外，用夾子固定好，用夾子固定好，待凝固待凝固后后 灌膠。灌膠。 2021-6-2143 2）制備SDS聚丙烯酰胺凝膠 制備分離膠制備分離膠 30%30%丙烯酰胺丙烯酰胺5ml + 5ml + 分離膠緩沖液分離膠緩沖液 5ml5ml +10%SDS 0.2ml +10% +10%SDS 0.2ml +10%過硫酸銨過硫酸銨 0.2ml + 0.2ml + 蒸蒸 餾水餾水 9.6 ml9.6 ml；混勻后加入；混勻后加入8ul TEMED,8ul TEMED,

37、立即混勻立即混勻 （不能有氣泡），灌入安裝好的垂直板中，灌膠（不能有氣泡），灌入安裝好的垂直板中，灌膠 時(shí)要?jiǎng)蛩儋N壁流入，防止氣泡產(chǎn)生。灌至離槽沿時(shí)要?jiǎng)蛩儋N壁流入，防止氣泡產(chǎn)生。灌至離槽沿 3cm3cm處，處，立即立即在膠面上用移液管加入在膠面上用移液管加入1-2cm1-2cm的蒸餾的蒸餾 水，靜置，待凝膠聚合后（約水，靜置，待凝膠聚合后（約30min30min），去除水），去除水 相，然后用相，然后用吸水紙吸干殘余的水吸水紙吸干殘余的水。 2021-6-2144 制備濃縮膠制備濃縮膠 30%30%丙烯酰胺丙烯酰胺 1.32ml + 1.32ml + 濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液 1ml1ml +

38、10%SDS 0.08ml +10% AP 0.08ml + +10%SDS 0.08ml +10% AP 0.08ml + 蒸餾水蒸餾水 5.6 5.6 mlml；混勻后加入；混勻后加入8ul TEMED,8ul TEMED,立即混勻（不能有氣立即混勻（不能有氣 泡），灌入垂直板至離槽沿泡），灌入垂直板至離槽沿0.5cm0.5cm處，插入梳子處，插入梳子 （不能混入氣泡），靜置，待凝膠聚合后，加入（不能混入氣泡），靜置，待凝膠聚合后，加入 電泳緩沖液，拔去梳子。電泳緩沖液，拔去梳子。 2021-6-2145 先用刀片先用刀片將瓊脂糖剝離開，再將玻璃板從架子上將瓊脂糖剝離開，再將玻璃板從架子上

39、 取出，再用夾子固定在電泳槽內(nèi)（注意凹槽朝取出，再用夾子固定在電泳槽內(nèi)（注意凹槽朝 內(nèi)），將電泳緩沖液倒入電泳槽內(nèi)。內(nèi)），將電泳緩沖液倒入電泳槽內(nèi)。 3)3). .樣品預(yù)處理樣品預(yù)處理 取取0.5ml0.5ml樣品加入樣品加入0.5ml0.5ml上樣緩沖液，置沸水上樣緩沖液，置沸水 中煮中煮5 5分鐘。分鐘。 4)4). .上樣上樣 第一個(gè)孔內(nèi)加第一個(gè)孔內(nèi)加20ul20ul標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 其他每孔加入其他每孔加入20ul20ul樣品。上樣時(shí)要將移液槍頭樣品。上樣時(shí)要將移液槍頭 垂直插入孔內(nèi)且要緩慢勻速推入樣品。垂直插入孔內(nèi)且要緩慢勻速推入樣品。 2021-6-2146 垂直板垂直

40、板 電泳裝置電泳裝置 加樣加樣 樣品遷樣品遷 移方向移方向 2021-6-2147 5)5). .電泳電泳 接通電源，將電壓調(diào)至接通電源，將電壓調(diào)至80V80V、50mA50mA。當(dāng)溴酚蘭進(jìn)入分。當(dāng)溴酚蘭進(jìn)入分 離膠后，把電壓提高到離膠后，把電壓提高到150V150V、80mA80mA，電泳至溴酚蘭距離膠，電泳至溴酚蘭距離膠 底部底部1-2cm1-2cm處，停止電泳。處，停止電泳。 6)6). .固定固定 取下凝膠，置于培養(yǎng)皿中的固定液中，輕輕振搖取下凝膠，置于培養(yǎng)皿中的固定液中，輕輕振搖1010分分 鐘，倒去固定液。鐘，倒去固定液。 7)7). .染色脫色染色脫色 培養(yǎng)皿中倒入培養(yǎng)皿中倒入5

41、0-6050-60度預(yù)熱的染色液浸沒凝膠，約度預(yù)熱的染色液浸沒凝膠，約4040 分鐘后回收染色液，用清水沖洗掉膠上多余的染色液。倒分鐘后回收染色液，用清水沖洗掉膠上多余的染色液。倒 入脫色液，脫色入脫色液，脫色2 2小時(shí)，期間換脫色液小時(shí)，期間換脫色液2-32-3次。次。 2021-6-2148 電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭， 大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一 個(gè)帶孔膠粒。個(gè)帶孔膠粒。 混合樣品混合樣品 帶孔膠帶孔膠 按分子按分子 大小分離大小分離 電泳方向電泳方向 電泳電泳 小分子小分子 大

42、分子大分子 2021-6-2149 夾在兩塊玻璃夾在兩塊玻璃 板之間的凝膠板之間的凝膠 電泳電泳 緩沖液緩沖液 電泳電泳 緩沖液緩沖液 加在槽中的經(jīng)加在槽中的經(jīng) SDS處理的樣品處理的樣品 分子量小分子量小 分子量大分子量大 電源電源 2021-6-2150 標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量 未未 知知 蛋蛋 白白 在一定的凝膠濃度下，在一定的凝膠濃度下， 多肽鏈分子量的對(duì)數(shù)與多肽鏈分子量的對(duì)數(shù)與 多肽鏈的相對(duì)遷移率成多肽鏈的相對(duì)遷移率成 線性關(guān)系，所以可以通線性關(guān)系，所以可以通 過標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽過標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽 鏈分子量鏈分子量。 相對(duì)遷移率相對(duì)遷移率 .結(jié)果處理結(jié)果處理 2021-6-

43、2151 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 1. 1.形成凝膠的試劑要有足夠的形成凝膠的試劑要有足夠的純度純度：丙烯酰胺是：丙烯酰胺是 形成凝膠溶液中的最主要成份，其純度的好壞形成凝膠溶液中的最主要成份，其純度的好壞 將直接影響凝膠的質(zhì)量，丙烯酰胺可能混有的將直接影響凝膠的質(zhì)量，丙烯酰胺可能混有的 影響凝膠形成的雜質(zhì)有：線性多聚丙烯酰胺、影響凝膠形成的雜質(zhì)有：線性多聚丙烯酰胺、 金屬離子等。金屬離子等。 2. 2. 注意不能隨便傾倒注意不能隨便傾倒單體溶液?jiǎn)误w溶液，應(yīng)加入過量的催，應(yīng)加入過量的催 化劑使其完全聚合成無毒性的聚丙烯酰胺后再化劑使其完全聚合成無毒性的聚丙烯酰胺后再 棄置。棄置。 2021-

44、6-2152 3. TEMED中混有氧化試劑后其自身極易中混有氧化試劑后其自身極易 被氧化而失去催化能力，另外被氧化而失去催化能力，另外TEMED的的 氧化產(chǎn)物氧化產(chǎn)物呈黃色呈黃色，以此可以鑒定，以此可以鑒定TEMED 的質(zhì)量。如果無法獲得無色透明的的質(zhì)量。如果無法獲得無色透明的 TEMED，只能適當(dāng)增加用量以保證聚膠，只能適當(dāng)增加用量以保證聚膠 速度。速度。 2021-6-2153 l4. 過硫酸銨過硫酸銨容易吸潮，由于它溶解于水后容易吸潮，由于它溶解于水后 很快降解失去催化能力，因此潮解后的過硫酸很快降解失去催化能力，因此潮解后的過硫酸 銨會(huì)漸漸失去活性。保存固體過硫酸銨應(yīng)密閉銨會(huì)漸漸失去

45、活性。保存固體過硫酸銨應(yīng)密閉 干燥。過硫酸銨溶液宜制膠當(dāng)天配制。另外在干燥。過硫酸銨溶液宜制膠當(dāng)天配制。另外在 配制凝膠溶液時(shí)過硫酸銨不易過量，否則會(huì)使配制凝膠溶液時(shí)過硫酸銨不易過量，否則會(huì)使 蛋白質(zhì)在電泳過程中被氧化蛋白質(zhì)在電泳過程中被氧化(主要指天然無變性主要指天然無變性 劑凝膠劑凝膠)。 2021-6-2154 5. 激活劑的用量激活劑的用量: 激活劑的濃度適當(dāng)與否激活劑的濃度適當(dāng)與否 不僅可以決定凝膠聚合的速度，也將影響凝膠不僅可以決定凝膠聚合的速度，也將影響凝膠 的質(zhì)量。增加過硫酸銨或的質(zhì)量。增加過硫酸銨或TEMED的用量，將的用量，將 使丙烯酰胺聚合鏈長(zhǎng)度縮短，凝膠會(huì)變得脆弱使丙烯

46、酰胺聚合鏈長(zhǎng)度縮短，凝膠會(huì)變得脆弱 而失去應(yīng)有的柔性。二者多至一定程度時(shí)，聚而失去應(yīng)有的柔性。二者多至一定程度時(shí)，聚 合鏈長(zhǎng)度過短，將不會(huì)形成肉眼可見的凝膠，合鏈長(zhǎng)度過短，將不會(huì)形成肉眼可見的凝膠， 這些短鏈多聚物呈溶液狀，只是其粘度較聚合這些短鏈多聚物呈溶液狀，只是其粘度較聚合 前高一些。前高一些。 2021-6-2155 6. 溫度的影響溫度的影響聚膠的最佳溫度為聚膠的最佳溫度為2325 ，需要注意灌膠前單體溶液，需要注意灌膠前單體溶液(通常置于通常置于4冰冰 箱箱)及玻璃板或管及玻璃板或管(有時(shí)從烘箱取出有時(shí)從烘箱取出)也要平衡至也要平衡至 此溫度。由于溶液在抽真空時(shí)仍維持較低溫度，此溫

47、度。由于溶液在抽真空時(shí)仍維持較低溫度， 需待其升至室溫后再脫氣，另外升溫后脫去氧需待其升至室溫后再脫氣，另外升溫后脫去氧 氣的速度較低溫時(shí)快。氣的速度較低溫時(shí)快。 2021-6-2156 7. 氧氣的影響氧氣的影響氧氣會(huì)與被激活的單體自由基氧氣會(huì)與被激活的單體自由基 作用抑制聚合過程，因此需在加激活劑前對(duì)單作用抑制聚合過程，因此需在加激活劑前對(duì)單 體溶液脫氣。如果省去這一步驟，凝膠仍能聚體溶液脫氣。如果省去這一步驟，凝膠仍能聚 合但需更多的激活劑，并且不能保證很好的重合但需更多的激活劑，并且不能保證很好的重 復(fù)性，充分去除氧氣可以用盡量少的激活劑得復(fù)性，充分去除氧氣可以用盡量少的激活劑得 到最

48、佳聚合效果。通常在較好的真空度脫氣至到最佳聚合效果。通常在較好的真空度脫氣至 少少15 min 。 2021-6-2157 8. 凝膠添加劑：凝膠添加劑：凝膠中常常加入凝膠中常常加入SDS、 尿素、尿素、Triton X-100等添加劑。等添加劑。SDS加加 入后不會(huì)對(duì)凝膠的聚合產(chǎn)生影響，但尿入后不會(huì)對(duì)凝膠的聚合產(chǎn)生影響，但尿 素會(huì)使凝膠孔徑變小，這一特性可用來素會(huì)使凝膠孔徑變小，這一特性可用來 分離小分子蛋白質(zhì)或多肽。分離小分子蛋白質(zhì)或多肽。 2021-6-2158 9. 聚膠時(shí)間：聚膠時(shí)間：雖然應(yīng)用過硫酸銨雖然應(yīng)用過硫酸銨 TEMED催化后灌膠催化后灌膠1520 min即可觀察即可觀察 到

49、凝膠的形成，但至少需到凝膠的形成，但至少需90 min才能保證才能保證 95以上的單鏈聚合成長(zhǎng)短以及具有合以上的單鏈聚合成長(zhǎng)短以及具有合 適的孔徑大小。采用核黃素時(shí)聚膠時(shí)間適的孔徑大小。采用核黃素時(shí)聚膠時(shí)間 需更長(zhǎng)，但它一般用于等電聚焦即根據(jù)需更長(zhǎng)，但它一般用于等電聚焦即根據(jù) 蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)進(jìn)行分離，對(duì)孔徑大蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)進(jìn)行分離，對(duì)孔徑大 小要求不高，因此不必等很長(zhǎng)時(shí)間小要求不高，因此不必等很長(zhǎng)時(shí)間(完全完全 聚合需聚合需8 h)。 2021-6-2159 10. 單體的濃度單體的濃度：是指單體總重量是指單體總重量(丙烯酰丙烯酰 胺胺+bis)在溶液中的百分比在溶液中的百分比(wv)，可

50、選擇的范，可選擇的范 圍為圍為330，單體濃度增加后聚合速度將加，單體濃度增加后聚合速度將加 快，因此可適當(dāng)減少催化劑的用量。快，因此可適當(dāng)減少催化劑的用量。 11. SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例（即：（即： 1.4g SDS/g蛋白質(zhì)），蛋白質(zhì)含量不可以超標(biāo)，蛋白質(zhì)），蛋白質(zhì)含量不可以超標(biāo)， 否則否則SDS結(jié)合量不足。結(jié)合量不足。 2021-6-2160 12. 用用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)相聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)相 對(duì)分子量時(shí)，必須同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。不能利用對(duì)分子量時(shí)，必須同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。不能利用 這次的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為下次用。并且這次的標(biāo)準(zhǔn)曲

51、線作為下次用。并且SDS-PAGE測(cè)測(cè) 定分子量有定分子量有10誤差，不可完全信任。誤差，不可完全信任。 13. 有的蛋白質(zhì)（如：電荷異常或結(jié)構(gòu)異常的蛋有的蛋白質(zhì)（如：電荷異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常的蛋 白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)）不能采用該法白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)）不能采用該法 測(cè)相對(duì)分子量。測(cè)相對(duì)分子量。 2021-6-2161 14. 有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以 上肽鏈（上肽鏈（-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們?cè)趲€基胰凝乳蛋白酶）組成的，它們?cè)趲€基 乙醇和乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。 因此，對(duì)于這一類蛋

52、白質(zhì)，因此，對(duì)于這一類蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝 膠電泳法測(cè)定的只是它們的亞基或是單條肽鏈膠電泳法測(cè)定的只是它們的亞基或是單條肽鏈 的相對(duì)分子量。的相對(duì)分子量。 15. 如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清 晰等現(xiàn)象，可能是晰等現(xiàn)象，可能是SDS不純引起不純引起。 2021-6-2162 常見問題及處理辦法常見問題及處理辦法 、紋理和拖尾現(xiàn)象、紋理和拖尾現(xiàn)象 由于樣品溶解不佳引起的，克服的方法可以在由于樣品溶解不佳引起的，克服的方法可以在 加樣前離心，增加一些增溶輔助試劑如尿素。加樣前離心，增加一些增溶輔助試劑如尿素。 、蛋白帶過寬蛋白帶過

53、寬，與鄰近泳道的蛋白帶相連是由于與鄰近泳道的蛋白帶相連是由于 加樣量太多，可以減少上樣量。加樣量太多，可以減少上樣量。 電泳時(shí)間比正常要長(zhǎng)電泳時(shí)間比正常要長(zhǎng) 可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電極緩沖系統(tǒng)的可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電極緩沖系統(tǒng)的pH選擇選擇 錯(cuò)誤。錯(cuò)誤。 指示劑成微笑符號(hào)指示劑成微笑符號(hào)（指示劑前沿呈現(xiàn)向上的曲（指示劑前沿呈現(xiàn)向上的曲 線形）：說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻線形）：說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻 不好，導(dǎo)致分子有不同的遷移率不好，導(dǎo)致分子有不同的遷移率。 2021-6-2163 .指示劑成微笑符號(hào)指示劑成微笑符號(hào)（指示劑前沿呈現(xiàn)（指示劑前沿呈現(xiàn)向下向下的曲線的曲線 形

54、）。形）。 由于電泳槽的裝置不合適，尤其是凝膠和玻璃由于電泳槽的裝置不合適，尤其是凝膠和玻璃 板組成的板組成的“三明治三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝底部有氣泡或靠近隔片的凝 膠聚合不完全膠聚合不完全 .凝膠時(shí)間不對(duì)。凝膠時(shí)間不對(duì)。 通常膠在通常膠在30min內(nèi)凝聚如果凝聚得太慢，可能是內(nèi)凝聚如果凝聚得太慢，可能是 TEMED，APS劑不夠或者失效。劑不夠或者失效。 7.出現(xiàn)出現(xiàn)“皺眉皺眉”（兩邊向下中間鼓起）（兩邊向下中間鼓起） 主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩 板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：

55、可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。 2021-6-2164 8.8.出現(xiàn)出現(xiàn)“鬼帶鬼帶” 如何處理？如何處理？ “鬼帶鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì) 分子時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）分子時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中） 的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主 要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性， 致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞 基重新締合，聚合成大分

56、子，其分子量要比目標(biāo)基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo) 條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條 帶有相同的免疫學(xué)活性，在帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見其能反應(yīng)中可見其能 與目標(biāo)條帶對(duì)應(yīng)的抗體作用。處理辦法：在加熱與目標(biāo)條帶對(duì)應(yīng)的抗體作用。處理辦法：在加熱 煮沸后，再添加適量的煮沸后，再添加適量的DTT或或Beta巰基乙醇，以巰基乙醇，以 補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還來阻止還 原劑的氧化。原劑的氧化。 2021-6-2165 9.9.為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？ 我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中常會(huì)遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中常會(huì)遇到溴酚藍(lán)已跑出板底， 但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液 和分離膠的濃度有關(guān)。處理辦法：