生物制藥RNAi

1、第七章第七章 rnairnai rna interference 梅洛梅洛(craig mello)生于生于1960 年，是被恐龍骨引入科學(xué)世界的。年，是被恐龍骨引入科學(xué)世界的。 梅洛童年時經(jīng)常跟著父親在美國梅洛童年時經(jīng)常跟著父親在美國 西部尋找化石。從那時起，他就西部尋找化石。從那時起，他就 迷上了遠古時代、地球歷史和人迷上了遠古時代、地球歷史和人 類生命的起源等問題。高中時代，類生命的起源等問題。高中時代， 梅洛的興趣逐漸轉(zhuǎn)移到了基因工梅洛的興趣逐漸轉(zhuǎn)移到了基因工 程方面。程方面。 法爾法爾(andrew fire)1959年出年出 生在美國加利福尼亞州，本科在生在美國加利福尼亞州，本科在

2、 加利福尼亞大學(xué)伯克利分校主修加利福尼亞大學(xué)伯克利分校主修 數(shù)學(xué)，僅用數(shù)學(xué)，僅用3年時間就拿到學(xué)位。年時間就拿到學(xué)位。 與梅洛類似，他逐漸對涉及生命與梅洛類似，他逐漸對涉及生命 奧秘的遺傳學(xué)產(chǎn)生興趣，并將其奧秘的遺傳學(xué)產(chǎn)生興趣，并將其 作為自己終身的學(xué)術(shù)追求。作為自己終身的學(xué)術(shù)追求。 哺乳動物細胞中的哺乳動物細胞中的 rnai 現(xiàn)象現(xiàn)象 長鏈長鏈dsrna 所有基因表達下降所有基因表達下降 rnai 現(xiàn)象現(xiàn)象 pkr, rnase l 活性化活性化 x 干擾素干擾素 提供rnai 在線技術(shù)支持的公司（網(wǎng)站） 一、一、rnarna干擾的發(fā)現(xiàn)干擾的發(fā)現(xiàn) 94年cogoni等證明真菌中 亦有類似現(xiàn)象

3、，此稱為 (quelling)。 90年代初，美國和荷蘭的兩個轉(zhuǎn)基 因植物實驗組rich jorgensen和同 事,在對矮牽牛(petunias)進行的 研究中有個奇怪的發(fā)現(xiàn):將一個能 產(chǎn)生色素的基因置于一個強啟動子 后,導(dǎo)入矮腳牽牛中,試圖加深花朵 的紫顏色,結(jié)果沒看到期待中的深 紫色花朵,多數(shù)花成了花斑的甚至 白的。也就是說轉(zhuǎn)基因的植株不僅 沒有新基因表達，反而使原有的色 素基因也受到了抑制，jorgensen 將這種現(xiàn)象命名為 (cosuppression) 一、一、rnarna干擾的發(fā)現(xiàn)干擾的發(fā)現(xiàn) 1995年，康乃爾大學(xué)的su guo博士在 試圖阻斷秀麗新小桿線蟲(c.elegans

4、) 的par-1基因時，發(fā)現(xiàn)了一個意想不到 的現(xiàn)象。她們本想利用反義rna技術(shù)特 異性地阻斷上述基因的表達，而同時 在對照實驗中給線蟲注射正義rna以期 觀察到基因表達的增強，但得到的結(jié) 果是二者都同樣地切斷了par-1基因的 表達途徑。這是與傳統(tǒng)上對反義rna技 術(shù)的解釋正好相反。該研究小組一直 未能給這個意外以合理解釋。 論文：論文： guo s, kemphues kj, par l. cell, 1995,81:611-620. 一、一、rnarna干擾的發(fā)現(xiàn)干擾的發(fā)現(xiàn) 1998年，華盛頓卡耐基研究院的fire和麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院的 mello首次在秀麗新小桿線蟲中證明上述現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后水

5、平 的。他們發(fā)現(xiàn)su guo博士遇到的正義rna抑制基因 表達的現(xiàn)象，以及過去的反義rna技術(shù)對基因表達的阻斷，都 是由于體外轉(zhuǎn)錄所得rna中污染了而引起。 當(dāng)他們將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈rna純化后注射線蟲時發(fā)現(xiàn)，基 因抑制效應(yīng)變得十分微弱，而經(jīng)過純化的雙鏈rna卻正好相反， 能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達，其抑制基因表達的效率 比純化后的反義rna至少高2個數(shù)量級。該小組將這一現(xiàn)象稱為 rna干擾。 論文：論文： fire a, xu s, montgomery me, et al. nature. 1998,391:806-811. 1998年，andrew fire等首次將正義鏈反義鏈r

6、na混合注入線蟲 c.elegans中，觀察到更強的基因表達抑制。首次提出了rna interference的概念。 mex-3 mrna detection in embryos by in situ hybridization (a)negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (b) embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 rna (purple stainin

7、g). (c) embryo from parent injected with purified mex-3 antisense rna. these embryos (and the parent animals) retain mex-3 mrna, although levels may be somewhat less than wild type. (d) late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsrna corresponding to mex-3 ; no mex-3 rna is detected. (tem

8、plates used for interfering rna and in situ probes were largely non-overlapping.) effects of mex-3 rna interference on levels of the endogenous mrna. nomarski dic micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos. 一、一、rnarna干擾的發(fā)現(xiàn)干擾的發(fā)現(xiàn) 在1999年短短的一年間,發(fā)現(xiàn)rna干擾現(xiàn)象廣泛存在于從植物、 真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠

9、、猴一直到人 類的幾乎所有的真核生物中細胞。2000年，又先后發(fā)現(xiàn)小鼠 早期胚胎中和大腸桿菌中也存在rna干擾現(xiàn)象。 2000年提出rnai作用機制模型。 論文：論文： hannond sm et al. nature, 2000, 404(6775):293-296 zamore pd. cell, 2000,101(1):25-33 2001年，rnai技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動物細胞基因沉默現(xiàn) 象。nature，2001，411（6836）：494498 rnai技術(shù)被science評為2001年度的十大科技進展之一。 二、二、rnarna干擾的機制干擾的機制 dsrna：雙鏈rna，包含

10、正義鏈和反義鏈 dicer：屬于rnase 家族，是dsrna的特異性核酸內(nèi)切酶 sirna：small interfering rna ，rnai的關(guān)鍵效應(yīng)分子， 21-23個nt大小的雙鏈rna risc：rna-inducing silencing complex，具有核酸內(nèi)切、 外切以及解旋酶活性 rdrp：rna-dependent rna polymerases，依賴rna的 rna聚合酶，是rnai的調(diào)節(jié)因子，使rnai可以在生物體內(nèi)傳 遞 預(yù)備知識：預(yù)備知識： 基因沉默基因沉默 二、二、rnarna干擾的機制干擾的機制 轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(transcriptional gen

11、e silencing, tgs) 轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post-transcriptional gene silencing, ptgs) tgs是指轉(zhuǎn)基因在細胞核內(nèi)rna 合成受到了阻止而導(dǎo)致基 因沉默。對于部分植物來說，轉(zhuǎn)基因引發(fā)的基因沉默可能是 因為基因特異的甲基化而導(dǎo)致； ptgs 則是指轉(zhuǎn)基因能夠在細胞核里被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄，但在細 胞質(zhì)里卻無相應(yīng)的mrna 存在這一現(xiàn)象。 基因沉默 rnai的作用原理的作用原理 雙鏈rna（ dsrna ） (外源的或體內(nèi)產(chǎn)生的) 首先被降 解為具5單磷酸、長2123bp 的小分子雙鏈rna , 這 種rna小分子稱為小干擾rna（ small in

12、terfering rna ，sirna） 。 sirna具相似的結(jié)構(gòu)特征: 為長約2123bp 的雙鏈 rna ,具5單磷酸和3羥基末端, 互補雙鏈的3端均有 一個23nt 的單鏈突出。 二、二、rnarna干擾的機制干擾的機制 1. sirna的產(chǎn)生的產(chǎn)生 一種稱為dicer 的核酸酶負(fù)責(zé)將dsrna 轉(zhuǎn)化為 sirna 。 它屬于rnase 家族,具有兩個催化結(jié)構(gòu)域、一個 解旋酶( helicase) 結(jié)構(gòu)域和一個paz ( piwi/ argonaute/ zwille ) 結(jié)構(gòu)域, dicer 在催化過程中以二 聚體的形式出現(xiàn), 其催化結(jié)構(gòu)域在dsrna 上反平行排 列, 形成四個活

13、性位點, 但只有兩側(cè)的兩個位點有內(nèi)切 核酸酶活性, 這兩個位點在相距約22bp 的距離切斷 dsrna , 各種生物體內(nèi)dicer 結(jié)構(gòu)略有不同, 致使 sirna 長度存在微小差別。 二、二、rnarna干擾的機制干擾的機制 dicers 2. sirna介導(dǎo)介導(dǎo)mrna降解降解 sirna 形成之后, 與一系列特異性蛋白結(jié)合形成sirna 誘導(dǎo)干擾復(fù)合體(sirna induced interference complex , risc) , 在atp存在下，此復(fù)合物通過堿基 互補配對識別靶mrna 并使其降解, 從而導(dǎo)致特定基 因沉默。 二、二、rnarna干擾的機制干擾的機制 3. r

14、nai 的的 特異性和高效性特異性和高效性 許多研究顯示rnai 過程中有新的dsrna 分子的合成。 當(dāng)sirna 反義鏈識別并結(jié)合靶mrna 后, sirna 反義 鏈可作為引物, 以靶mrna 為模板在依賴于rna 的 rna 聚合酶(rna dependent rna polymerase , rdrp) 催化下合成新的dsrna , 然后由dicer 切割產(chǎn) 生新的sirna , 新sirna 再去識別新一組mrna, 又產(chǎn) 生新的sirna , 經(jīng)過若干次合成2切割循環(huán), 沉默信號 就會不斷放大。 二、二、rnarna干擾的機制干擾的機制 cap aaaaaa cap aaaaaa

15、 cap aaaaaa 循環(huán) 復(fù)制酶 dicer 切割 rnai機制 dicer risc 堿基互補堿基互補 酶解酶解 rnairnai的放大效應(yīng)機制的放大效應(yīng)機制 二、二、rnarna干擾的機制干擾的機制 sirna不僅可引導(dǎo)risc切割靶rna，而且可作為引物在rna 依賴的rna聚合酶(rdrp)作用下以靶mrna為模板合成新的 dsrna。 新合成的長鏈dsrna同樣可被rnase樣核酸酶切割、降解 而生成大量的次級次級sirna。次級sirna又可進入合成-切割 的循環(huán)過程，進一步放大rnai作用。這種合成-切割的循環(huán) 過程稱為隨機降解性隨機降解性pcr（random degrada

16、tive pcr）。 gisela storz, science, 296(5571):1263-1265, 2002. rnai是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制； rnai具有很高的特異性； 只有dsrna才能誘導(dǎo)產(chǎn)生rnai； 只有針對編碼區(qū)的dsrna才能產(chǎn)生有效的和特異性的干擾； 注射同源dsrna可以引起內(nèi)源性mrna特異性的降解； rnai抑制基因表達具有很高的效率，可達到缺失突變體表 型的程度，而且相對很少量的dsrna分子就能完全抑制相應(yīng) 基因的表達，這是通過催化放大的方式進行的； 二、二、rnarna干擾的機制干擾的機制 rnai干擾現(xiàn)象具有以下幾個重要的特征：干擾現(xiàn)象具有以下幾個

17、重要的特征： 二、二、rnarna干擾的機制干擾的機制 rnai抑制基因表達的效應(yīng)可以長距離傳遞和維持信號甚至 傳播至整個有機體以及可遺傳給f1，但f2往往恢復(fù)為野生型。 dsrna不得短于21個堿基，大于30 bp的dsrna不能在哺 乳動物中誘導(dǎo)特異的rna干擾，而是細胞非特異性和全面的 基因表達受抑和凋亡； rnai作用迅速，mrna快速降解； rnai效應(yīng)的依賴性，只有連續(xù)產(chǎn)生dsrna才能產(chǎn)生長期效 應(yīng)，否則只產(chǎn)生短暫的沉默反應(yīng)。 rnai干擾現(xiàn)象具有以下幾個重要的特征：干擾現(xiàn)象具有以下幾個重要的特征： short-interfering rna quicktime and a gi

18、f decompressor are needed to see this picture. 加工長鏈加工長鏈 dsrna形成形成 21-23 nt 小片段小片段 34 27 21 20 16 tuschl, 2001 dicer contains two rnase iii domains sirnas long dsrna risc: rna-induced silencing complex exonuclease homology search activity endonuclease helicase 5 3 target mrna oh3 5p 形成risc復(fù)合物，降解目的mrn

19、a 利用生物學(xué)軟件利用生物學(xué)軟件組配組配長鏈長鏈 oligooligo，（合成單鏈，（合成單鏈dnadna （直接帶有（直接帶有4 4個個bpbp的酶切位點粘性末端的酶切位點粘性末端) )； 載體構(gòu)建：載體構(gòu)建： dsdnadsdna形成：形成：annealingannealing 載體的酶切和回收載體的酶切和回收 連接連接 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 鑒定鑒定 轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染：瓶頸之一瓶頸之一 含有真核細胞篩選標(biāo)志含有真核細胞篩選標(biāo)志 含有熒光標(biāo)志含有熒光標(biāo)志 效應(yīng)檢測：效應(yīng)檢測：mrnamrna水平和蛋白水平兼顧水平和蛋白水平兼顧 rnai主要通過在轉(zhuǎn)錄后（post-transcriptional）水平阻斷 基

20、因的表達，導(dǎo)致蛋白無法合成，出現(xiàn)導(dǎo)致蛋白無法合成，出現(xiàn)“基因沉默基因沉默”。比 如，我們可以按擬定的方式來關(guān)閉（shutting off）非必需 或致病基因的功能。從理論上說，若能關(guān)閉致病基因的表 達則很多疾病將被治愈。動物實驗已證明，可以通過 rnai的方法使導(dǎo)致血膽固醇升高的基因“沉默”；病毒 性疾病，眼疾，心血管代謝性疾病等方面的臨床試驗也正 在進行中；這一方法為病毒性肝炎、艾滋病和腫瘤等人類 頑疾的治療指了一條新路 。 三、三、rnarna干擾的應(yīng)用干擾的應(yīng)用 三、三、rnarna干擾的應(yīng)用干擾的應(yīng)用 1.基因功能研究基因功能研究 由于rnai技術(shù)可以利用sirna或sirna使目的基

21、因沉默，研 究基因的功能。同時sirna表達文庫構(gòu)建方法的建立，使得 利用rnai技術(shù)進行高通量篩選成為可能，對闡明信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 通路、發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點有重要意義。 如利用rnai技術(shù)證明ag-1基因與擬南芥花的發(fā)育有關(guān)。 chiou-fen chuang and elliot m. meyerowitz* pnas april 25, 2000 vol. 97 no. 9 49854990 三、三、rnarna干擾的應(yīng)用干擾的應(yīng)用 2.病毒性疾病的治療病毒性疾病的治療 研究人員開發(fā)出使用rnai技術(shù)來阻止艾滋病病毒進入人體細 胞。這個研究小組設(shè)計合成的lenti病毒載體引入sirna，激發(fā)

22、rnai抑制了hiv-1的coreceptor-ccr5進入人體外周淋巴細 胞，不影響另一種hiv-1的coreceptor-ccr4，從而使以lenti病 毒載體為媒介引導(dǎo)sirna進入細胞內(nèi)產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，由此治 療hiv-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。 艾滋病 rnai 機制作為真核生物基因組免疫系統(tǒng), 抑制外源和內(nèi)源有害 基因表達 利用rnai 技術(shù)把與病毒基因具同源性的sirna 引入感染細胞 將會抑制病毒的增殖 利用rnai 技術(shù)抑制過度表達的癌基因?qū)拱┌Y表型逆轉(zhuǎn)或病 程得以控制。 三、三、rnarna干擾的應(yīng)用干擾的應(yīng)用 2.病毒性疾病的治療病毒性疾病的治療 最早用

23、于最早用于hiv研究，被研究，被science評為評為2002年年度突破。年年度突破。 斯坦福醫(yī)學(xué)院的研究群，把dsrna放進小老鼠的肝細胞， dsrna被小老鼠體內(nèi)的核酸酶分解成許多sirna。研究發(fā)現(xiàn) sirna具有高度專一性，會與小老鼠體內(nèi)的丙型肝炎病毒的 mrna相結(jié)合，使mrna分解并失去轉(zhuǎn)譯蛋白質(zhì)的功能。斯 坦福醫(yī)學(xué)院運用此技術(shù)來治療丙型肝炎的研究，已從體外試 管實驗階段推進至體內(nèi)的動物實驗。且在小老鼠身上，看到 丙型肝炎病毒被阻斷的明顯效果。 hbv 三、三、rnarna干擾的應(yīng)用干擾的應(yīng)用 2.病毒性疾病的治療病毒性疾病的治療 randall等證明了針對hcv rna的sirn

24、a轉(zhuǎn)染細胞4天后可使 細胞質(zhì)中復(fù)制的hcv rna降低80倍；將sirna 轉(zhuǎn)染至已有 hcv感染、復(fù)制的細胞，sirna對98%以上可檢測到hcv抗 原、hcv復(fù)制活躍的細胞有抑制作用；sirna干擾沉默hcv rna具有劑量依賴性和序列特異性。kapadia等 也證明了 sirna特異抑制hcv rna復(fù)制、阻止相關(guān)蛋白表達的作用。 hcv 三、三、rnarna干擾的應(yīng)用干擾的應(yīng)用 2.病毒性疾病的治療病毒性疾病的治療 其它病毒 hu wy等證明了sirna能阻抑逆轉(zhuǎn)錄rous 肉瘤病毒 （rsv）感染脊椎動物； leonid等發(fā)現(xiàn)針對脊髓灰質(zhì)炎病毒中編碼衣殼蛋白 或編碼病毒聚合酶的mrn

25、a的sirna可以抑制病毒復(fù)制， 加速清除受染細胞中的脊髓灰質(zhì)炎病毒； jia等發(fā)現(xiàn)rta-sirna( rta是皰疹病毒基因表達的一 種起始轉(zhuǎn)錄因子)和orf45-sirna能特異阻止皰疹病毒復(fù) 制。 三、三、rnarna干擾的應(yīng)用干擾的應(yīng)用 3.腫瘤治療腫瘤治療 用rnai特異性地抑制癌基因、癌相關(guān)基因或突變基因的過度表 達，使這類基因保持在靜默或休眠狀態(tài)，從而有望用這種新的 手段治療各種惡性腫瘤。 (1)rnai可應(yīng)用于敲除點突變激活的癌基因， (2)rnai可應(yīng)用于抑制插入基因及融合基因的表達， (3)rnai可應(yīng)用于抑制基因擴增。 li等在3個肝癌細胞系hep3b、hepg2、snu

26、449中對cyclin e 的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染sirna組48 h后生長抑制均達到90，而 對照組無作用，3天后凋亡率分別為16 、44和3l，而對 照組僅為l。 三、三、rnarna干擾的應(yīng)用干擾的應(yīng)用 3.腫瘤治療腫瘤治療 應(yīng)用rnai技術(shù)抑制腫瘤細胞（如肝癌細胞、膽管癌細胞等） 中血管生長因子如血管生成素如angi1、angi2、angi3及 vegf等或其受體的表達，以及抑制腫瘤細胞中如癌基因bcl2、 ras、tp53等突變基因及其蛋白的表達而不影響非突變基因 的表達，可達到很好的抗腫瘤生長及抗腫瘤轉(zhuǎn)移的目的。 figure. use of chemically synthesize

27、d and in vitro transcribed sirnas targeting -actin to induce gene silencing. ku-70 levels were reduced 86% in cells transfected with the sirna cocktail, compared to non-transfected controls. 三、三、rnarna干擾的應(yīng)用干擾的應(yīng)用 4.抗器官移植排斥反應(yīng) 細胞間粘附分子-1（icam-1）是重要的介導(dǎo)細胞粘附和 t細胞激活的分子，應(yīng)用與icam-1基因序列特異的 sirna阻斷 icam-1 mrna和蛋

28、白的表達，可以明顯降 低大鼠同種移植心的移植物血管病的發(fā)生的程度和缺血 再灌注損傷。 4.rnai在整形外科領(lǐng)域的應(yīng)用前景在整形外科領(lǐng)域的應(yīng)用前景 已證實n-ras或braf的激活型突變是引發(fā)黑素瘤的主要病 因，使用rnai技術(shù)剔除黑素瘤細胞的braf表達，不僅抑 制了腫瘤細胞生長，而且減弱了其侵襲能力，為黑素瘤 基因治療奠定了基礎(chǔ)。 最近研究表明趨化因子受體cxcr4是乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要調(diào) 節(jié)因素，其配體cxcl12可趨化腫瘤細胞并調(diào)節(jié)其增生和 侵襲特性。使用rnai干擾技術(shù)剔除cxcr4，將在治療中起 關(guān)鍵作用。 2004年，美國fda批準(zhǔn)經(jīng)過修飾的第一個rnai藥物 bevasiranib

29、 進行臨床新藥試驗，用于治療與年齡相關(guān) 的黃斑退行性改變。 三、三、rnarna干擾的應(yīng)用干擾的應(yīng)用 dsrna dicer 形成復(fù)合物 靶rna 6 6在功能基因組中的應(yīng)用在功能基因組中的應(yīng)用 由于由于rnai具有高度的序列專一性，可以特異地使特定基具有高度的序列專一性，可以特異地使特定基 因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此rnai可以作為可以作為 一種強有力的研究工具，用于功能基因組的研究。一種強有力的研究工具，用于功能基因組的研究。 將功能未知的基因的編碼區(qū)（外顯子）或啟動子區(qū)，以反將功能未知的基因的編碼區(qū)（外顯子）或啟動子區(qū)，以反 向重復(fù)的方式由同

30、一啟動子控制表達。這樣在轉(zhuǎn)基因個體向重復(fù)的方式由同一啟動子控制表達。這樣在轉(zhuǎn)基因個體 內(nèi)轉(zhuǎn)錄出的內(nèi)轉(zhuǎn)錄出的rna可形成可形成dsrna，產(chǎn)生，產(chǎn)生rna干涉，使目的干涉，使目的 基因沉默，從而進一步研究目的基因的功能，這種技術(shù)即基因沉默，從而進一步研究目的基因的功能，這種技術(shù)即 為為rnai技術(shù)。技術(shù)。 根據(jù)所選用序列的不同，可將其分為根據(jù)所選用序列的不同，可將其分為編碼區(qū)編碼區(qū)rnai和和啟動啟動 子區(qū)子區(qū)rnai技術(shù)技術(shù)。 三、三、rnarna干擾的應(yīng)用干擾的應(yīng)用 6 rna6 rna干擾和干擾和 目前，兩方面的證據(jù)提示轉(zhuǎn)座子沉默涉及目前，兩方面的證據(jù)提示轉(zhuǎn)座子沉默涉及sirna。 其一，

31、發(fā)現(xiàn)蠕蟲其一，發(fā)現(xiàn)蠕蟲mut-7基因參與基因參與rnai和轉(zhuǎn)位抑制。和轉(zhuǎn)位抑制。 其二，從裂殖酵母的中心粒區(qū)也分離出其二，從裂殖酵母的中心粒區(qū)也分離出sirna，并檢測到，并檢測到 這些這些sirna介導(dǎo)此區(qū)內(nèi)組蛋白甲基化。由于中心粒區(qū)包含介導(dǎo)此區(qū)內(nèi)組蛋白甲基化。由于中心粒區(qū)包含 重復(fù)序列重復(fù)序列含轉(zhuǎn)座子片段，在一些減數(shù)分裂基因中也發(fā)含轉(zhuǎn)座子片段，在一些減數(shù)分裂基因中也發(fā) 現(xiàn)了通過其附近的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子現(xiàn)了通過其附近的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子ltr（長末端重復(fù)序列）（長末端重復(fù)序列） 介導(dǎo)的介導(dǎo)的rnai，推測在，推測在sirna介導(dǎo)的中心粒區(qū)域的組蛋白介導(dǎo)的中心粒區(qū)域的組蛋白 甲基化可能源于古老的轉(zhuǎn)座子沉

32、默作用。甲基化可能源于古老的轉(zhuǎn)座子沉默作用。 三、三、rnarna干擾的應(yīng)用干擾的應(yīng)用 sirna可能參與纖毛蟲，四膜蟲蟲體間結(jié)合時的基因重組。可能參與纖毛蟲，四膜蟲蟲體間結(jié)合時的基因重組。 結(jié)合到重組序列的結(jié)合到重組序列的sirna，在蟲體之間的結(jié)合過程中介導(dǎo)，在蟲體之間的結(jié)合過程中介導(dǎo) dna缺失和染色體斷裂。缺失和染色體斷裂。 有趣的是，在這些有趣的是，在這些sirna介導(dǎo)的程序性介導(dǎo)的程序性dna刪除事件中，刪除事件中， 也發(fā)現(xiàn)需要重組區(qū)域組蛋白的甲基化。也發(fā)現(xiàn)需要重組區(qū)域組蛋白的甲基化。 三、三、rnarna干擾的應(yīng)用干擾的應(yīng)用 三、三、rnarna干擾的應(yīng)用干擾的應(yīng)用 4.藥物開發(fā)

33、藥物開發(fā) 利用rnai技術(shù)來研究藥物作用的特異性和機制對于加快藥物 開發(fā)的研制速度大有益處，因為基因組研究成果和高通量的篩 選技術(shù)，為更好更快發(fā)現(xiàn)藥靶和候選藥物提供了重要基礎(chǔ)。在 藥物開發(fā)過程中，用rnai技術(shù)可以對靶基因的功能進行分析， 有助于搞清藥物的作用機制以及與基因編碼產(chǎn)物，及與相應(yīng)化 合物的相互作用，從而更正確地發(fā)現(xiàn)藥靶，開發(fā)更有效的候選 藥物。 利用sirna治療疾病需要解決幾個問題： （1）導(dǎo)入問題，使用高效載體傳遞sirna； （2）和給藥方式，因為rna容易被降解，如何提高 sirna在體內(nèi)的穩(wěn)定性； （3）高選擇性。如何靶向特定細胞而不影響其他細胞。 三、三、rnarna干

34、擾的應(yīng)用干擾的應(yīng)用 rnai 為抗腫瘤、抗病毒及遺傳病等的基因治療帶來了新的希望,也為基 因功能研究提供了強有力的工具。 但目前也存在一些問題: rnai 的作用機制尚不很清楚,使rnai 的廣泛深入應(yīng)用受一定影響。 針對哺乳動物細胞的sirna 設(shè)計和篩選有很大的盲目性,需經(jīng)過反復(fù)試 驗才能篩選出有效作用位點,在理論和技術(shù)上有待突破。 有些mrna 的靶序列與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合成復(fù)合物,被蛋白質(zhì)封閉了其作 用位點。 與其他基因治療一樣,制約rnai 技術(shù)治療疾病有2 個嚴(yán)重的問題,其一是 效率低下的載體系統(tǒng),其二是人們對基因功能認(rèn)識的廣度和深度遠不能滿 足應(yīng)用的需要,還須在理論與技術(shù)的源頭上作長

35、久不懈的努力。 由于rnai 獨特的作用機制,使其抑制靶基因表達的效率遠高于反義核酸技 術(shù),又由于rnai 技術(shù)流程簡便,周期短,因此rnai 有可能代替反義核酸技術(shù) 及基因敲除技術(shù)而成為基因功能研究的主力軍，在基因治療方面也顯示出 誘人的前景。 三、三、rnarna干擾的應(yīng)用干擾的應(yīng)用 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 一般技術(shù)路線一般技術(shù)路線 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 sirna的設(shè)計的設(shè)計 1.從mrna 的aug起始密碼開始，尋找“aa”二連序列，并 記下其3端的19個堿基序列，作為潛在的sirna靶位點。有研 究結(jié)果顯示gc含量在30%-50%

36、左右的sirna要比那些gc含 量偏高的更為有效。 2.將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大 鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/est同源的序 列。例如使用blast 3.選出合適的目標(biāo)序列進行合成。通常一個基因需要設(shè)計多 個靶序列的sirna，以找到最有效的sirna序列。 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 sirna的設(shè)計的設(shè)計 4.一個完整的sirna實驗應(yīng)該有陰性對照。作為陰性對照的 sirna應(yīng)該和選中的sirna序列有相同的組成，但是和 mrna沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的sirna序 列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源

37、性。 5.計算機軟件輔助設(shè)計，如rational_sirna_design.xls等。 6.internet資源的應(yīng)用： 目前已證實的sirna序列 http:/ /mmcmanus/www/sirnadb.html 互聯(lián)網(wǎng)上的幫助 http:/ http:/ http:/ 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 sirna的制備的制備 1.1.化學(xué)合成化學(xué)合成sirnasirna 是最貴的方法，但是卻是最方便的許多公司都可以根據(jù) 用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成sirna。主要的缺點包括價 格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。 由于價格比其他方法高，

38、為一個基因合成34對sirnas 的 成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效 的序列再進行化學(xué)合成。 最適用于：已經(jīng)找到最有效的sirna的情況下，需要大量 sirna進行研究； 不適用于：篩選sirna等長時間的研究，主要原因是價格 因素。 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 sirna的制備的制備 2. 體外轉(zhuǎn)錄合成體外轉(zhuǎn)錄合成sirna 相對化學(xué)合成法而言成本比較低，是一種性價比高的篩選 sirnas的好方法。更重要的是能夠更快的得到sirnas。 體外轉(zhuǎn)錄得到的sirnas只要較低的濃度就可以達到化學(xué)合 成sirnas較高濃度得到的效果。 不足之處：實驗的規(guī)

39、模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成 能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的sirnas，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終 有一定的限制。 最適用于：篩選sirnas，特別是需要制備多種sirnas，化 學(xué)合成的價格成為障礙時。 不適用于：實驗需要大量的，一個特定的sirna。長期研 究。 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 3. 用用rnase iii 消化長片斷雙鏈消化長片斷雙鏈rna制備制備sirna 其他制備sirna的方法的缺陷是需要設(shè)計和檢驗多個 sirna序列以便找到一個有效的sirna。 這種方法制備一份混合有各種sirnas “混合雞尾酒” 就 可以避免這個缺陷。 這個方法是選擇通常是200

40、-1000堿基的靶mrna模版，用 體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsrna ，然后用rnase iii (or dicer) 在體外消化，得到sirnas“混合雞尾酒”。 在除掉沒有被消化的dsrna后，這個sirna混合物就可以 直接轉(zhuǎn)染細胞，方法和單一的sirna轉(zhuǎn)染一樣。 由于sirna混合物中有許多不同的sirnas，通常能夠保證 目的基因被有效地抑制。 sirna的制備的制備 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 dsrna消化法的主要優(yōu)點在于可以跳過檢測和篩選有效 sirna序列的步驟，為研究人員節(jié)省時間和金錢。 不過這種方法的缺點也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基 因

41、沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因，雖然現(xiàn)在多數(shù) 的研究顯示這種情況通常沒有發(fā)生。 最適用于：快速而經(jīng)濟地研究某個基因功能缺失的表型 不適用于：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的 sirna進行研究，特別是基因治療。 sirna的制備的制備 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 4.利用質(zhì)?；虿《据d體表達利用質(zhì)粒或病毒載體表達sirna 多數(shù)的sirna表達載體依賴3種rna聚合酶iii 啟動子(pol iii) 中的一種，操縱一段小的發(fā)夾sirna在哺乳動物細胞中的表 達。包括的人源和鼠源的u6啟動子和人h1啟動子。 之所以采用rna pol iii啟動子是由于它可以在哺乳

42、動物細胞 中表達更多的小分子rna，而且它是通過添加一串（3到6個） u來終止轉(zhuǎn)錄的。 使用這類載體，需要2段編碼短發(fā)夾rna序列的dna單鏈， 退火，克隆到相應(yīng)載體的pol iii 啟動子下游。 sirna的制備的制備 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 sirna的制備的制備 sirna表達載體的構(gòu)建 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 由于涉及到克隆，這個過程需要幾天的時間，同時也需要經(jīng) 過測序以保證克隆的序列是正確的。 不過幸好載體容易大量擴增，這個優(yōu)點足以彌補所有缺陷， 特別是當(dāng)載體在實驗中確實有效的時候。 sirna表達載體的優(yōu)點在于這是眾多方法中唯一可

43、以進行長 期研究的方法帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細胞中持續(xù) 抑制靶基因的表達，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。 即使是對轉(zhuǎn)染帶有篩選標(biāo)記質(zhì)粒的細胞進行瞬時篩選，也有 助于富集帶質(zhì)粒的細胞。這也可以幫助解決一些難轉(zhuǎn)染的細 胞由于轉(zhuǎn)染效率低造成的問題。 sirna的制備的制備 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 開始研究逆轉(zhuǎn)錄病毒和其他病毒載體用于sirna表達，其優(yōu) 勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免 由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便。 最適用于：已知一個有效的sirna序列，需要維持較長時間 的基因沉默，或者需要用抗生素篩選能表達sirna的細胞。 適用于長期研究。 不適

44、用于：篩選sirna序列（其實主要是指需要多個克隆和 測序等較為費時、繁瑣的工作）。 sirna的制備的制備 除質(zhì)粒載體外，科研人員已經(jīng)成功地采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、 腺相關(guān)病毒載體和慢病毒載體將表達sirna的dna模板序列 轉(zhuǎn)移入哺乳動物細胞?，F(xiàn)在許多學(xué)者正在加緊腺病毒載體的 sirna轉(zhuǎn)移研究 。 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 sirna的制備的制備 5. pcr方法制備方法制備sirna的表達框架的表達框架 usirna表達框架(sirna expression cassettes，secs)是一 種由pcr得到的sirna表達模版，能夠直接導(dǎo)入細胞進行表 達而無需事前

45、克隆到載體中。 u這個方法最早是由castanotto采用，包括一個rna pol iii 啟動子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)sirna，一個rna pol iii終止位點。 u和sirna表達載體不同的是，secs不需要載體克隆、測序 等頗為費時的步驟，可以直接由pcr得到。 u因此，secs成為篩選sirna的最有效工具，甚至可以用來 篩選在特定的研究體系中啟動子和sirna的最適搭配。 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 u如果在pcr兩端添加酶切位點，那么通過secs篩選出的最 有效的sirna后，可以直接構(gòu)建sirna表達載體。 u構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達sirna和長期研究。

46、u主要缺點是pcr產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細胞中。如果有適合的新 型轉(zhuǎn)染試劑能提高sec的轉(zhuǎn)染效率的話，那問題就可以解決 了。另外，沒有克隆到載體中的pcr片斷并不適于大規(guī)模制 備。 u最適用于：篩選sirna序列，在克隆到載體前篩選最佳啟 動子； u不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以 了）。 sirna的制備的制備 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 sirna的制備的制備 5種sirna制備方法的比較 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 sirna的制備的制備 5種sirna制備方法的比較 反義核酸設(shè)計與修飾技術(shù)反義核酸設(shè)計與修飾技術(shù) 選擇靶序列，提高制劑的

47、穩(wěn)定性，細胞捕獲率選擇靶序列，提高制劑的穩(wěn)定性，細胞捕獲率 （一）（一） 反義核酸靶位序列設(shè)計反義核酸靶位序列設(shè)計 空間結(jié)構(gòu)影響互補核酸接近空間結(jié)構(gòu)影響互補核酸接近 1 1、反義寡核苷酸文庫（隨機法）、反義寡核苷酸文庫（隨機法） 利用基因文庫目的基因序列，合成一系列寡核苷酸（利用基因文庫目的基因序列，合成一系列寡核苷酸（50-10050-100 個）個） ，針對，針對mrnamrna不同區(qū)域，檢驗誘導(dǎo)反義作用的能力。不同區(qū)域，檢驗誘導(dǎo)反義作用的能力。 費時費力費時費力 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 2 2、計算機模擬預(yù)測易感靶位、計算機模擬預(yù)測易感靶位 易感性受空間結(jié)構(gòu)尤其

48、是折疊的影響易感性受空間結(jié)構(gòu)尤其是折疊的影響 計算機模擬計算機模擬rna(rna(目的基因目的基因) )二級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)開放環(huán)，膨開放環(huán)，膨 出部分易于雜交出部分易于雜交 僅有個別僅有個別mrnamrna二級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)二級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù) 。 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 3、避免序列相關(guān)的非反義活性及毒性 非甲基化非甲基化cpgcpg二聚核苷酸序列引發(fā)特異性的二聚核苷酸序列引發(fā)特異性的免疫激活免疫激活 免疫效應(yīng)細胞有識別免疫效應(yīng)細胞有識別cpgcpg的受體，激活的受體，激活b b細胞，抗體分泌細胞，抗體分泌, ,誘誘 導(dǎo)產(chǎn)生許多細胞因子導(dǎo)產(chǎn)生許多細胞因子 脊椎動物脊椎動物dnacp

49、gdnacpg被抑制，處于被抑制，處于高度甲基化高度甲基化狀態(tài)，含量很低狀態(tài)，含量很低 cpggpccpggpc 刺激作用降低，刺激作用降低，設(shè)計時避免設(shè)計時避免cpgcpg 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 ( (二二) ) 寡核苷酸的化學(xué)修飾寡核苷酸的化學(xué)修飾 經(jīng)血液循環(huán)經(jīng)血液循環(huán)細胞內(nèi)細胞內(nèi)蓄積在胞內(nèi)小體，高爾基體等細胞器蓄積在胞內(nèi)小體，高爾基體等細胞器 中中, ,到達靶位基因很少。到達靶位基因很少。 dna,rnadna,rna在細胞體系中很快被血清酶降解在細胞體系中很快被血清酶降解 磷酸骨架硫代修飾磷酸骨架硫代修飾 第一代第一代: :將磷酸二酯骨架的非橋氧原子換成將磷

50、酸二酯骨架的非橋氧原子換成s s，提高抗，提高抗 性，透過性差性，透過性差 第二代第二代: :混合骨架寡核苷酸混合骨架寡核苷酸 第三代第三代: :肽核酸肽核酸 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 肽核酸（肽核酸（pnapna）技術(shù)）技術(shù) pnapna是一類用是一類用肽鏈骨架肽鏈骨架代替核酸中的代替核酸中的磷酸戊糖骨架磷酸戊糖骨架 而形成的新型分子。它保留了與互補而形成的新型分子。它保留了與互補dnadna或或rnarna配對結(jié)合的特配對結(jié)合的特 性，且其特異性和親和力都比相應(yīng)的寡核苷酸高，同時又能性，且其特異性和親和力都比相應(yīng)的寡核苷酸高，同時又能 抵抗所有核酸酶和蛋白酶的降解。

51、抵抗所有核酸酶和蛋白酶的降解。 pnapna插入雙鏈插入雙鏈dnadna形成穩(wěn)定的雜交體后，可抑制其轉(zhuǎn)形成穩(wěn)定的雜交體后，可抑制其轉(zhuǎn) 錄和復(fù)制；與錄和復(fù)制；與rnarna結(jié)合可抑制翻譯。結(jié)合可抑制翻譯。 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 四、四、rnarna干擾的研究方法干擾的研究方法 sirna的導(dǎo)入的導(dǎo)入 1.細胞的導(dǎo)入 sirnas需要進入細胞后才能對蛋白的表達進行抑制，因此將 其高效地轉(zhuǎn)入細胞也是研究成功與否的關(guān)鍵步驟。 例如，一個sirna對某個特定基因表達的抑制效率是90%，但 是其轉(zhuǎn)染效率只有10%，那么總的抑制率只有9%。 目前傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法與試劑的效果都不是很理想。 但是有專門的rna轉(zhuǎn)染試劑，其原理也是基于脂質(zhì)體技術(shù)，可 用于多種真核細胞的rnai研究。 四、