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1、兩種凝血酶原提取方法的比較研究文章來(lái)源 畢業(yè)論文網(wǎng) 畢業(yè)論文【摘要】  目的 比較等電點(diǎn)沉淀法和檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原的純度。方法 分別采用等電點(diǎn)沉淀法和檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原,凝血酶原經(jīng)單獨(dú)鈣離子激活得到凝血酶,通過(guò)凝血酶效價(jià)測(cè)定、蛋白質(zhì)濃度測(cè)定,計(jì)算出凝血酶的比活性。結(jié)果 采用等電點(diǎn)沉淀法提取的凝血酶原經(jīng)激活后得到的凝血酶比活性為11.011.54 u/mg,采用檸檬酸鋇吸附法提取的凝血酶原經(jīng)激活后得到的凝血酶比活性為130.1712.30 u/mg,經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn),p0.01.結(jié)論 與等電點(diǎn)沉淀法相比,采用檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取得到的凝血酶原純度

2、更高。 【關(guān)鍵詞】  凝血酶原; 凝血酶; 等電點(diǎn)沉淀法; 檸檬酸鋇吸附法comparative analysis of two extraction methods of prothrombin    lai yi,wu minlu,dai juan,chen man,duan jiahui,liu yang* 畢業(yè)論文網(wǎng) 論文網(wǎng)    (department of lab medicine,chengdu medical college,chengdu 610083,china)    【a

3、bstract】  objective to compare the purity of prothrombin purified by method of precipitating at isoelectricpoint and adsorption method with barium citrate from blood plasma of pig.methods prothrombin was purified by method of precipitating at isoelectricpoint and adsorption method with barium c

4、itrate from blood plasma of pig and activated by ca2+ only to thrombin.then the titer of thrombin and the concentration of protein were measured to get the specific activity of thrombin.results the specific activity of thrombin activated by ca2+ from prothrombin purified by method of precipitating a

5、t isoelectricpoint was 11.011.54 u/mg.the specific activity of thrombin activated by ca2+ from prothrombin purified by adsorption method with barium citrate was 130.1712.30 u/mg.the specific activities were analyzed by paired ttest,p0.01.conclusion the purity of prothrombin purified by adsorption me

6、thod with barium citrate is higher than purified by method of precipitating at isoelectricpoint.    【key words】  prothrombin;  thrombin;  method of precipitating at isoelectricpoint;  adsorption method with barium citrate    凝血酶是參與機(jī)體凝血過(guò)程的一個(gè)重要的凝血因子,在體

7、內(nèi)以凝血酶原形式存在1。20世紀(jì)中期開(kāi)始人們將凝血酶應(yīng)用于臨床,由于其療效顯著,應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。之后美英日等國(guó)從牛血漿中分離出凝血酶應(yīng)用于臨床,并證明將動(dòng)物凝血酶應(yīng)用于人體未出現(xiàn)凝血酶抗原性,口服和局部外用時(shí)無(wú)過(guò)敏反應(yīng)和其他不良反應(yīng)等,因而目前所使用的凝血酶制劑大多來(lái)源于動(dòng)物血漿,國(guó)內(nèi)采用豬血漿制備凝血酶的報(bào)道較多2。等電點(diǎn)沉淀法和檸檬酸鋇吸附法是兩種主要的凝血酶原提取方法3,凝血酶原經(jīng)單獨(dú)的鈣離子激活可得到凝血酶。目前,國(guó)內(nèi)尚無(wú)研究比較應(yīng)用等電點(diǎn)沉淀法和檸檬酸鋇吸附法所得到的凝血酶原純度的差異,哪種方法得到的凝血酶原純度更高?更適合用于提取凝血酶原?本文對(duì)這兩種方法從豬血漿中提取凝血酶原的

8、純度進(jìn)行了比較。為相關(guān)實(shí)驗(yàn)中選擇合適的凝血酶原提取方法提供參考。    1  材料與方法    1.1  材料    檸檬酸鈉抗凝的新鮮豬血漿。    1.2  主要試劑    纖維蛋白原和凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)sigma公司,bradford蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)biorad。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。    檸檬酸鋇吸附法使用的四種溶液分別為,溶液a:1.0 mol/l bacl2

9、溶液; 溶液b:0.02 mol/l tris,0.15 mol/l bacl2,0.10 mol/l nacl,ph7.4; 溶液c:0.02 mol/l tris, 0.10 mol/l nacl,0.20 mol/l na2edta,ph7.4; 溶液d:0.02 mol/l tris,0.15 mol/l nacl,ph6.5.    1.3  主要儀器    ge genequant 1300核酸蛋白分析儀。    1.4  方法    1.4.

10、1  凝血酶原提取  將收集到的5份豬血漿按15編號(hào),各均分為2份,其中1份采用等電點(diǎn)沉淀法提取凝血酶原,另1份采用檸檬酸鋇吸附法提取凝血酶原。    1.4.1.1  等電點(diǎn)沉淀法  豬血漿用蒸餾水稀釋10倍,用5 %冰乙酸將其ph調(diào)至5.3,4靜置過(guò)夜,3 000 r/min離心15 min,棄上清,沉淀用生理鹽水溶解,過(guò)濾備用。    1.4.1.2  檸檬酸鋇吸附法  豬血漿中加入溶液a,體積比為101,4攪拌30 min,靜置30 min后,3 000 r/min離

11、心30 min,棄上清。沉淀用溶液b洗滌,3 000 r/min離心15 min,棄上清。重復(fù)洗3次。沉淀用溶液c解吸附,4攪拌0.51h,3 000 r/min離心15 min取上清。上清液用溶液d于4透析過(guò)夜。3 000 r/min離心15 min取上清液,即為凝血酶原溶液。    1.4.2  凝血酶原激活  用2 % na2co3溶液將凝血酶原溶液的ph調(diào)至7.1,加入0.25 mol/l cacl2溶液,使ca2+終濃度為0.03 mol/l,再用2 % na2co3溶液將凝血酶原溶液的ph調(diào)至7.1,室溫靜置2 h,過(guò)濾即得凝血酶溶

12、液。    1.4.3  凝血酶比活性測(cè)定  根據(jù)文獻(xiàn)4提供的方法配制0.1 %纖維蛋白原溶液。    凝血酶效價(jià)測(cè)定4,5:取凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品,用生理鹽水配制成效價(jià)(u/ml)分別為5、6、7、8、9、10的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。另取110 cm的塑料試管6支,各加入0.1 %纖維蛋白原溶液450 l,置37水浴預(yù)熱5 min,再分別取已37預(yù)熱的上述6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各50 l,迅速加入上述各試管中,立即計(jì)時(shí)并搖勻,記錄凝固時(shí)間。每個(gè)濃度測(cè)2次,求平均值,做標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)樣品用生理鹽水稀釋適當(dāng)濃度,取50 l,按標(biāo)準(zhǔn)曲線的

13、測(cè)定方法平行測(cè)定2次,求平均值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程計(jì)算樣品的效價(jià)。    根據(jù)文獻(xiàn)6,采用bradford法測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)濃度,以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,每個(gè)樣本平行測(cè)2次,取平均值。根據(jù)公式:酶比活性=酶效價(jià)/溶液蛋白質(zhì)濃度,計(jì)算凝血酶溶液的比活性。    2  結(jié)果與分析    以凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液效價(jià) (u/ml)為x,對(duì)應(yīng)的凝固時(shí)間(sec)為y進(jìn)行直線回歸處理,并求得直線回歸方程,所得方程式為:y=62.9135.994x,r0.994 8.將凝血酶樣品的凝固時(shí)間代入回歸方程,即可計(jì)

14、算得出樣品的凝血酶效價(jià)(見(jiàn)表1、圖1)。    采用等電點(diǎn)沉淀法得到的凝血酶原經(jīng)激活后,凝血酶的比活性為11.011.54 u/mg,而采用檸檬酸鋇吸附法提取得到的凝血酶原經(jīng)激活后,凝血酶的比活性可達(dá)到130.1712.30 u/mg。其比活性經(jīng)配對(duì)樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后,其概率p=3.541050.01,說(shuō)明兩種方法得到的凝血酶比活性有顯著性差異,后者約為前者的11.8倍。從兩種方法所得到的凝血酶溶液的酶活性和蛋白質(zhì)濃度分析,造成兩者酶比活性差異的主要原因在于凝血酶的純度差異,凝血酶純度越高,比活性就越高。等電點(diǎn)沉淀法提取的凝血酶原溶液含雜蛋白較多,需要進(jìn)一步純化,以提高酶的比活性。因而,采用檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原大大優(yōu)于等電點(diǎn)沉淀法,得到的凝血酶純度較高。畢業(yè)論文網(wǎng) 論文網(wǎng)    3  討論    從血漿中提取的凝血酶可應(yīng)用于臨

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