實(shí)驗(yàn)四 從豬肝中分離提取DNA和RNA 10-5-15

1、 實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四 從豬肝中分離提取從豬肝中分離提取 DNA和和RNA 學(xué)習(xí)、掌握分離制備學(xué)習(xí)、掌握分離制備DNADNA和和RNARNA的原理及基本方法。的原理及基本方法。 一一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康模?二 實(shí)驗(yàn)原理： 利用利用DNADNA和和RNARNA的溶解特性不同而使二者分開(kāi)。的溶解特性不同而使二者分開(kāi)。 DNADNA在生物體內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在在生物體內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在 的，因此提取出脫氧核糖核蛋白復(fù)合物（的，因此提取出脫氧核糖核蛋白復(fù)合物（DNPDNP）后，必）后，必 須將蛋白質(zhì)除去。動(dòng)物和植物組織的須將蛋白質(zhì)除去。動(dòng)物和植物組織的DNPDNP可溶于水或濃可溶于水或

2、濃 鹽溶液鹽溶液, ,但在稀鹽溶液中溶解度很低但在稀鹽溶液中溶解度很低, ,而而RNPRNP則溶于稀鹽則溶于稀鹽 溶液中溶液中. .由此將由此將DNPDNP與與RNPRNP分開(kāi)。分開(kāi)。 二二 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理： 去蛋白方法有很多種，本實(shí)驗(yàn)采用去蛋白方法有很多種，本實(shí)驗(yàn)采用異戊醇異戊醇- -氯仿氯仿 混合液以及酚作為蛋白變性劑混合液以及酚作為蛋白變性劑去除去除DNPDNP與與RNPRNP中的蛋中的蛋 白，最終達(dá)到分離出白，最終達(dá)到分離出DNADNA與與RNARNA的目的。的目的。 實(shí)驗(yàn)安排：實(shí)驗(yàn)安排： 本次實(shí)驗(yàn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)臺(tái)分為本次實(shí)驗(yàn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)臺(tái)分為A A、B B兩組兩組 A A組組-提取提取 RN

3、ARNA B B組組-提取提取 DNADNA 藥品的配制：藥品的配制： 1 10.1mol/L NaCl0.1mol/L NaCl - 0.05mol/L, pH7.0 - 0.05mol/L, pH7.0 檸檬酸鈉緩沖液檸檬酸鈉緩沖液 1000ml1000ml 檸檬酸鈉檸檬酸鈉 29.412g29.412g NaCl NaCl 11.7g 11.7g 加蒸餾水至加蒸餾水至 2000 ml2000 ml 2.2. 10 % NaCl10 % NaCl 800 ml 800 ml NaClNaCl 80g + 800 ml 80g + 800 ml 蒸餾水蒸餾水 實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料： 豬肝豬肝

4、3.3. 氯仿氯仿異戊醇混合液（異戊醇混合液（9:19:1） 500 ml500 ml 450ml 450ml 氯仿氯仿+50ml +50ml 異戊醇異戊醇 4.4. 95% 95% 乙醇（實(shí)驗(yàn)前放入冰箱）乙醇（實(shí)驗(yàn)前放入冰箱） 5.5.冷蒸餾水（實(shí)驗(yàn)前放入冰箱）冷蒸餾水（實(shí)驗(yàn)前放入冰箱） 6.6.SSCSSC溶液溶液 100ml100ml （0.15M NaCl0.15M NaCl含含0.015M0.015M檸檬酸三鈉）檸檬酸三鈉） 藥品的配制：藥品的配制： 藥品的配制藥品的配制： 7.7. SDS SDS溶液溶液 5g SDS5g SDS溶于溶于45%45%乙醇中配成乙醇中配成100ml1

5、00ml溶液溶液 8.8. 水飽和酚水飽和酚 新鮮重蒸酚用水飽和新鮮重蒸酚用水飽和 9.9. 2% 2%醋酸鉀醋酸鉀-95%-95%乙醇溶液乙醇溶液 2g2g醋酸鉀溶于醋酸鉀溶于95%95%乙醇中配成乙醇中配成100ml100ml溶液溶液 豬肝豬肝 加緩沖液加緩沖液 絞碎、離心絞碎、離心 上清上清沉淀沉淀 A組從中 提取RNA B組從中 提取DNA RNPRNP解聚解聚 酚去蛋白酚去蛋白 沉淀沉淀RNARNA 檢測(cè)檢測(cè) 析出析出DNPDNP 析出析出DNADNA 沉淀沉淀DNADNA 檢測(cè)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)流程： 三三. .操操 作作 步步 驟驟 加緩沖液、絞碎、離心加緩沖液、絞碎、離心 稱(chēng)取新鮮（或

6、冷凍）豬肝稱(chēng)取新鮮（或冷凍）豬肝50g50g放入組織搗碎機(jī)中（先剪成放入組織搗碎機(jī)中（先剪成 cmcm小塊），加入小塊），加入100ml100ml 0.1mol/LNaCl,0.05mol/L, pH7.0 0.1mol/LNaCl,0.05mol/L, pH7.0 檸檬酸鈉緩沖液，搗碎檸檬酸鈉緩沖液，搗碎3min3min，組織糜于，組織糜于40004000r/minr/min離心離心 10min10min，將上清液與沉淀分開(kāi)，保留上清液，將沉淀倒入燒，將上清液與沉淀分開(kāi)，保留上清液，將沉淀倒入燒 杯中，用上述緩沖液洗滌杯中，用上述緩沖液洗滌2 2次，每次次，每次50ml50ml，如前離心，如

7、前離心 。合合 并上清液。并上清液。 A A組取上清提組取上清提 RNA RNA ；B B組取沉淀提組取沉淀提 DNADNA A A組：組：RNARNA的提取的提取 1.1. RNARNA- -核蛋白的解聚核蛋白的解聚 在上清液中加入在上清液中加入5% SDS5% SDS溶液，使溶液，使SDSSDS的最終濃度的最終濃度 為為0.5%0.5%左右左右, ,室溫下?lián)u勻室溫下?lián)u勻. .注意計(jì)算加入注意計(jì)算加入SDSSDS的量的的量的 多少。多少。 水飽和酚在水飽和酚在6565下預(yù)熱下預(yù)熱, ,加等體積加等體積水飽和酚水飽和酚于上述解于上述解 聚溶液內(nèi)聚溶液內(nèi). 65. 65水浴中搖水浴中搖15 mi

8、n, 4000r/min15 min, 4000r/min離心離心15min.15min. 離心液分三層離心液分三層: :上層水相含上層水相含RNARNA, ,中層為變性蛋白與少量中層為變性蛋白與少量RNA,RNA, 下層是酚層下層是酚層. .小心吸出上層水相小心吸出上層水相, ,去除蛋白質(zhì)層，下層的苯去除蛋白質(zhì)層，下層的苯 酚回收入大燒杯中。酚回收入大燒杯中。 回收的苯酚用回收的苯酚用4000r/min4000r/min離心離心10min10min，去除含有的雜蛋，去除含有的雜蛋 白，苯酚放入白，苯酚放入6565下預(yù)熱，循環(huán)使用下預(yù)熱，循環(huán)使用. . 2.2. 酚去蛋白酚去蛋白 再在收集的水

9、相中加等體積水飽和酚再在收集的水相中加等體積水飽和酚, ,同上步驟同上步驟, ,抽抽 提去蛋白提去蛋白. .如此重復(fù)如此重復(fù)2 2次次, ,直至上下二相界面之間無(wú)蛋白直至上下二相界面之間無(wú)蛋白 為止為止. .小心吸取上層水相溶液小心吸取上層水相溶液, ,量取體積后置于燒杯中。量取體積后置于燒杯中。 2.2. 酚去蛋白酚去蛋白 取取2.52.5倍體積預(yù)冷的倍體積預(yù)冷的95%95%乙醇乙醇-2%-2%醋酸鉀溶液醋酸鉀溶液, , 加入上述去蛋白的加入上述去蛋白的RNARNA溶液內(nèi)溶液內(nèi),RNA,RNA沉淀，并以沉淀，并以 4000r/min4000r/min離心離心10 min10 min，收集此沉

10、淀。，收集此沉淀。 3.3. RNARNA的沉淀的沉淀 RNARNA沉淀沉淀復(fù)溶于復(fù)溶于SSCSSC（0.15M NaCl0.15M NaCl；0.015M0.015M檸檬酸三檸檬酸三 鈉）溶液中鈉）溶液中( (此處此處SSCSSC溶液體積不易過(guò)大溶液體積不易過(guò)大, ,否則影響下一步否則影響下一步 得率得率, ,開(kāi)始應(yīng)滴加少量開(kāi)始應(yīng)滴加少量SSCSSC溶解，溶解，5-85-8滴管即可，如果該劑滴管即可，如果該劑 量的量的SSCSSC不能溶解，則繼續(xù)滴加不能溶解，則繼續(xù)滴加SSCSSC，直到沉淀完全溶解，直到沉淀完全溶解),), 再用二倍體積再用二倍體積95%95%冷乙醇沉淀冷乙醇沉淀RNA,R

11、NA,離心收集離心收集RNARNA。此。此RNARNA再再 溶于少量溶于少量SSCSSC溶液，置于溶液，置于44冷藏待冷藏待RNARNA沉淀沉淀. . 3.3. RNARNA的沉淀的沉淀 RNA沉淀沉淀 RNA沉淀沉淀 取取RNARNA溶液溶液10ul10ul，直接放入石英比色皿中，加水至比，直接放入石英比色皿中，加水至比 色皿色皿2/32/3以上處，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定以上處，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm260nm和和280nm280nm吸吸 收值，計(jì)算兩者吸收比值來(lái)鑒定其純度。收值，計(jì)算兩者吸收比值來(lái)鑒定其純度。 純的純的RNARNA，其，其ODOD260 260/OD /OD280 2

12、80為 為2.02.0 4.4. RNARNA含量及純度測(cè)定含量及純度測(cè)定 B B組：組：DNADNA的提取的提取 1 1. . 析出析出DNPDNP 向得到的細(xì)胞核沉淀中加入向得到的細(xì)胞核沉淀中加入125 ml125 ml 10%NaCl10%NaCl溶液，溶液， 充分混勻，攪拌充分混勻，攪拌10-15min, 10-15min, 于于4000r/min4000r/min離心離心15min15min。 將所得的半透明粘稠狀液體，沿玻璃棒慢慢倒入將所得的半透明粘稠狀液體，沿玻璃棒慢慢倒入1010倍體倍體 積的冷蒸餾水內(nèi)，這時(shí)有白色絲狀物積的冷蒸餾水內(nèi)，這時(shí)有白色絲狀物- -核蛋白核蛋白DNPD

13、NP析出，析出， 4000 r/min4000 r/min離心離心10min 10min 。將沉淀物再溶于。將沉淀物再溶于10%NaCl10%NaCl溶液中溶液中 （用量筒?。ㄓ昧客踩?0ml 10%NaCl50ml 10%NaCl，每次取少量溶解沉淀，逐步將，每次取少量溶解沉淀，逐步將 溶解液移至兩個(gè)離心管中），迅速攪拌至充分溶解。溶解液移至兩個(gè)離心管中），迅速攪拌至充分溶解。 加入加入1/21/2體積氯仿體積氯仿- -異戊醇混合液，劇烈振蕩異戊醇混合液，劇烈振蕩5min5min左左 右，于右，于4000r/min4000r/min離心離心10min10min。得三層得三層：上面為含有上面為

14、含有DNADNA和和 DNADNA核蛋白的水層核蛋白的水層，下面為氯仿下面為氯仿- -異戊醇的有機(jī)溶劑層異戊醇的有機(jī)溶劑層，變變 性蛋白質(zhì)凝膠介于兩層之間性蛋白質(zhì)凝膠介于兩層之間。吸出上面的水層，用玻璃棒。吸出上面的水層，用玻璃棒 挑出蛋白質(zhì)凝膠層（前幾次易挑出，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量少后不挑出蛋白質(zhì)凝膠層（前幾次易挑出，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量少后不 易挑出時(shí)，可用吸管吸出蛋白層），將吸出的水層倒回原易挑出時(shí)，可用吸管吸出蛋白層），將吸出的水層倒回原 離心管。如前振蕩離心進(jìn)行脫蛋白，直至界面處不再出現(xiàn)離心管。如前振蕩離心進(jìn)行脫蛋白，直至界面處不再出現(xiàn) 蛋白質(zhì)凝膠為止。從中取樣測(cè)定。蛋白質(zhì)凝膠為止。從中取樣測(cè)定。 2.2.析出析出DNADNA 吸出上清液并將它注入兩倍體積的吸出上清液并將它注入兩倍體積的95%95%冰乙醇中?？梢?jiàn)冰乙醇中?？梢?jiàn) 到白色纖維狀到白色纖維狀DNADNA沉淀。沉淀。 4.4.DNADNA的測(cè)定的測(cè)定 取取DNADN