流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1、流感監(jiān)測(cè)目的 （一）監(jiān)測(cè)流感活動(dòng)水平和流行動(dòng)態(tài)； （二）及時(shí)發(fā)現(xiàn)流感病毒變異并作出預(yù)警； （三）為全球及我國(guó)流感疫苗毒株的預(yù)測(cè) 和推薦提供依據(jù)。 流感監(jiān)測(cè)內(nèi)容 （一）流感樣病例監(jiān)測(cè) （二）流感樣病例暴發(fā)疫情監(jiān)測(cè) 流感樣病例監(jiān)測(cè)標(biāo)本采集 采集對(duì)象： 流感樣病例流感樣病例 發(fā)熱（體溫發(fā)熱（體溫3838），伴咳嗽或咽痛之一者），伴咳嗽或咽痛之一者 采集時(shí)間：病人發(fā)病的頭3天內(nèi)采集 采集地點(diǎn)：國(guó)家級(jí)流感樣病例監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院 采集數(shù)量：根據(jù)就診ILI病例數(shù)的多少，每家 哨點(diǎn)醫(yī)院每周至少采集515份流感樣病例的 標(biāo)本(根據(jù)流行季節(jié)、流行強(qiáng)度、防控工作需要實(shí)時(shí) 調(diào)整） 暴發(fā)疫情標(biāo)本采集 （1）1周內(nèi)，在同一學(xué)

2、校、幼兒園或其他集體 單位發(fā)生30例及以上流感樣病例；或發(fā)生5例 及以上因流感樣癥狀住院病例（不包括門(mén)診留 觀病例）；或發(fā)生2例及以上有流行病學(xué)關(guān)聯(lián) 的死亡病例； （2）在某一社區(qū)內(nèi)（如同一鄉(xiāng)或街道）1周內(nèi) 出現(xiàn)流感樣病例異常增多。 每一起暴發(fā)疫情一般應(yīng)當(dāng)采集10份左右咽、鼻 拭子標(biāo)本（如果現(xiàn)癥病例在10例以下的，應(yīng)當(dāng) 盡量全部采樣）。 采集標(biāo)本類型 常規(guī)常規(guī)特殊特殊 咽拭子咽拭子 鼻咽/呼吸道吸取物 鼻拭子鼻拭子 鼻洗液 痰液 呼吸道灌洗液 肺組織活檢標(biāo)本 尸檢標(biāo)本 采樣液 常用的采樣液有：PH 7.4-7.6的Hanks液或 MEM； 標(biāo)本采集后應(yīng)立即放入適當(dāng)?shù)牟蓸右褐械?溫保存，同時(shí)加入

3、抗菌素（入慶大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250g/mL ） 咽拭子采集 咽拭子咽拭子 用滅菌棉簽（最好用聚丙烯纖維頭的塑料 桿拭子）擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將棉 簽頭部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部棄 去，旋緊管蓋。 標(biāo)本的保存與運(yùn)送 標(biāo)本采集后應(yīng)在4條件下，盡快（哨點(diǎn)監(jiān) 測(cè)48小時(shí)疫情24小時(shí)內(nèi)）運(yùn)送至流感監(jiān)測(cè)網(wǎng) 絡(luò)實(shí)驗(yàn)室 未能送至實(shí)驗(yàn)室的，應(yīng)置-70或以下保存， 一周內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室 凍存的標(biāo)本，盡量避免其反復(fù)凍融，在冷 藏條件下送到實(shí)驗(yàn)室 實(shí)驗(yàn)室生物安全要求 l季節(jié)性流感病毒分離鑒定在生物安全級(jí) 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。 l流感病毒分離鑒定及其它檢測(cè)過(guò)程中所有 能夠產(chǎn)生感染性氣溶膠的過(guò)程必

4、須在生物 安全級(jí)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜里操作。 l用滅活的抗原進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)時(shí)可以在生 物安全級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行 標(biāo)本的接收 接收標(biāo)本時(shí)必須核對(duì)送檢表 流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室的工作人員接到標(biāo)本 后，24小時(shí)內(nèi)將“流感/人禽流感監(jiān)測(cè)病例 標(biāo)本原始登記送檢表”（表2）錄入到“監(jiān) 測(cè)信息系統(tǒng)” 標(biāo)本的處理 標(biāo)本送至實(shí)驗(yàn)室后，立即進(jìn)行處理，未加 抗菌素的加入適量的抗菌素。 將原始標(biāo)本一分為三份，一份（1ml）用于 MDCK細(xì)胞接種，一份（1ml）用于雞胚接 種，一份（1ml）保存待復(fù)核。（根據(jù)檢測(cè) 程序?qū)崟r(shí)調(diào)整） 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) 核酸檢測(cè) 病毒分離和鑒定：雞胚分離和細(xì)胞培養(yǎng) 膠體金快速檢測(cè) 檢測(cè)流程 臨床標(biāo)本采集臨床標(biāo)

5、本采集 接種接種MDCK細(xì)胞細(xì)胞接種雞胚接種雞胚 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)，鑒定病毒紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)，鑒定病毒 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)紅細(xì)胞凝集試驗(yàn) 寄送國(guó)家流感中心寄送國(guó)家流感中心 流感病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性流感病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性 核酸檢測(cè) 核酸提取- QIAamp Viral RNA Mini Kit 1）在1.5ml 離心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。 2）取采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養(yǎng)物（雞胚 尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液）140ul加入上述離心管中（糞便標(biāo)本用10 懸液的上清），震蕩15s，室溫放置10min。 3）稍離心后，加入560ul無(wú)水乙醇，震蕩15s。 4）將Viral RNA

6、Mini spin柱子取出，將步驟3的混合液吸取 630ul加入柱子中，8000rpm離心1min。棄離心液。 5）重復(fù)步驟4。 6）將吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW l液，8000 rpm離心1min。棄套管及其離心液。 7）將吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW 2液， 13000rpm離心3min，棄套管及其離心液。 8）將吸附柱放入一新的1.5ml 離心管中，于柱中加入60ul的 AVE液，室溫靜置13分鐘，8000rpm離心1min，收集離心液即 為提取的病毒RNA，立即實(shí)驗(yàn)或20以下保存。 熒光定量PCR 第一次使用前引物稀釋 1引物工作濃度（

7、40M） 配制方法： （1）將新合成的引物開(kāi)蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。 （2）用RNase Free Water溶解，加水量為10總摩爾數(shù)總摩爾數(shù)，充分混勻，此時(shí)引物 濃度為100M，可作為儲(chǔ)存液。（例如：假設(shè)合成引物每管2OD，若2OD的量 為9.1 nmol ，加水量為109.191l） （3）將100M的引物2.5倍稀釋，此時(shí)濃度為40M，可作為工作濃度。 2探針工作濃度（10/20M/） 配制方法： （1）將新合成的探針管開(kāi)蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。 （2）用RNase Free Water溶解，加水量為10總摩爾數(shù)，充分混勻，此時(shí)引物 濃度為100M，

8、可作為儲(chǔ)存液。 （3）將100M的探針10/5倍稀釋，此時(shí)濃度為10/20M，可作為工作濃度。 熒光定量PCR 引物和探針 稀釋好的冰凍的引物和探針進(jìn)行融化（已融的探針避 光2-8可保存多達(dá)3個(gè)月，不要對(duì)探針?lè)磸?fù)凍融）； 渦旋振蕩引物和探針； 瞬時(shí)離心引物和探針，之后置于冰架上。 real-time RT-PCR的試劑 QIAGEN公司 QuantiTect Probe RT-PCR Kit， Cat No. 204443 注意：在試驗(yàn)過(guò)程中，保持所有的試劑在冰架上保 持低溫。 熒光定量PCR 反應(yīng)體系和條件 試劑：Invitrogen SuperScript III Platinum One

9、-Step Quantitative Kit （公司： Invitrogen， 貨號(hào)：11732-020或11745-100） 分子級(jí)無(wú)菌蒸餾水 (無(wú)RNA酶 和DNA酶) 正反向引物 (40M) 雙重標(biāo)記探針(10M) 反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄50 30min95 2min （95 15s 55 30s*）45 反應(yīng)體系為25ul 注：*在55 度這一步驟中要收集熒光信號(hào) （FAM） 熒光PCR結(jié)果陽(yáng)性樣品 熒光PCR結(jié)果陰性樣品 熒光PCR結(jié)果可疑樣品 病毒分離-MDCK細(xì)胞 3335培養(yǎng) 接種流程 清洗MDCK 細(xì)胞 臨床采樣標(biāo)本接種細(xì)胞 Hanks液清洗細(xì)胞，一般清洗2遍 3335度吸附12小

10、時(shí) Hanks液清洗細(xì)胞 加入病毒生長(zhǎng)液，3335度培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24小時(shí)后，觀察細(xì)胞病變。當(dāng)細(xì) 胞病變?yōu)?+或4+時(shí)，即75100% 細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)進(jìn)行收獲，收獲 之前將細(xì)胞凍融12次，以提高 收獲標(biāo)本的病毒滴度。即使無(wú)細(xì) 胞病變也應(yīng)該于第7天收獲 （細(xì)胞 病變情況：細(xì)胞病變的特征是細(xì) 胞腫脹圓化，細(xì)胞間隙增大，細(xì) 胞核固縮或破裂，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞部 分或全部脫落 ） 根據(jù)使用的細(xì)胞瓶的大小，決定接種 量，一般的小細(xì)胞瓶接種0.5ml的臨 床標(biāo)本 流程圖 MDCK細(xì)胞病毒分離 lCPE出現(xiàn)時(shí)間與感染病毒的型別、毒株的差 異、感染量的大小和MDCK細(xì)胞的敏感性 有關(guān) l每日觀察細(xì)胞病變(CPE) l標(biāo)

11、本接種后7天還未出現(xiàn)CPE，維持液經(jīng)HA 試驗(yàn)陰性者，繼續(xù)盲傳12代后，HA試驗(yàn) 仍為陰性者，則MDCK細(xì)胞病毒分離為陰 性，標(biāo)本可棄去 細(xì)胞病變圖 雞胚病毒分離 檢卵 標(biāo)本準(zhǔn)備 雞胚分離方法-試劑準(zhǔn)備 1) 1) 9 91111日齡雞胚日齡雞胚 2) 2) 照蛋燈照蛋燈 3) 70%3) 70%7575酒精酒精 4) 1ml 4) 1ml 一次性注射器一次性注射器 5) 5) 雞蛋開(kāi)孔器雞蛋開(kāi)孔器 6) 6) 無(wú)菌膠布或蠟無(wú)菌膠布或蠟 7) 10ml 7) 10ml 試管和試管架試管和試管架 8) 10ml 8) 10ml 移液管或移液管或1ml1ml移液器及無(wú)菌吸尖移液器及無(wú)菌吸尖 9)

12、9) 無(wú)菌鑷子無(wú)菌鑷子 10) 10) 無(wú)菌眼科剪無(wú)菌眼科剪 雞胚分離方法-標(biāo)記雞胚 檢視標(biāo)記雞胚 用照蛋燈檢視雞胚，判斷雞胚狀態(tài) 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血帶 或淤血塊 胎動(dòng)：活胚有明顯的自然運(yùn)動(dòng)，死胚無(wú)胎動(dòng) 絨毛尿囊膜發(fā)育界限：密布血管的絨毛尿囊 膜與雞胚胎的另一面形成明顯的界限 標(biāo)記出雞胚的氣室與尿囊的界限、胚胎頭部 的位置 如果雞胚是死胚、沒(méi)有受精、有裂痕、發(fā)育 不全、或表面有好多滲水孔，應(yīng)棄掉 接種病毒方法接種病毒方法 單腔接種 盲種 雙腔接種 燈下接種 開(kāi)窗接種 雞胚分離方法雞胚分離方法 雞胚分離流程（1） 將標(biāo)記好的雞胚的氣室朝上放置在蛋盤(pán)上，通常每個(gè)樣 本接種3個(gè)雞胚

13、 用70%75酒精消毒雞胚，在氣室端鉆孔，開(kāi)10 x6mm 窗口 用注射器吸200l處理過(guò)的臨床標(biāo)本，裝上16 號(hào)針頭 從窗口中滴入無(wú)菌的液體石蠟，然后輕輕晃動(dòng)雞胚，讓 液體石蠟在雞胚殼膜內(nèi)層鋪開(kāi)，此時(shí)在照蛋燈下即 可清楚 的看到雞胚胎的位置。將注射針頭刺入胚胎的 鄂下胸前， 用針頭輕輕撥動(dòng)下顎及腿，當(dāng)進(jìn)入羊膜腔時(shí)，能看到雞胚 隨著針頭的撥動(dòng)而動(dòng)，即可注射100l標(biāo)本。將針頭退出至 寸，將另外100 l標(biāo)本 注入雞胚尿囊腔 雞胚分離流程（2） 用同一注射器和針頭將同一標(biāo)本依上法接種 另外的兩枚雞胚 將針頭棄于合適的生物安全裝置中 用消毒過(guò)的醫(yī)用膠布封口 3335oC 溫箱培養(yǎng)雞胚23 天。臨床

14、采樣 標(biāo)本通常培養(yǎng)3天，病毒傳代通常培養(yǎng)2天 雞胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)時(shí)，每天檢查雞胚 生長(zhǎng)情況，24小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，認(rèn)為是非 特異死亡應(yīng)棄去 雞胚分離流程（3） 收獲尿囊液和羊水收獲尿囊液和羊水 雞胚在收獲前應(yīng)4過(guò)夜或至少放置4小時(shí) 標(biāo)記15ml 無(wú)菌塑料管與相應(yīng)的雞胚編號(hào)一致 用70%75酒精消毒雞胚頂部 用無(wú)菌鑷子撕破雞胚氣室蛋殼，推開(kāi)雞胚尿囊 膜。用10ml 吸管吸取雞胚尿囊液置于相應(yīng)的收 集管中。用吸管刺破雞胚羊膜，盡量吸取羊水 放置于另外的管中。羊水較少時(shí)也可以將3個(gè) 雞胚的羊水合并 雞胚病毒鑒定 l 經(jīng)HA試驗(yàn)陰性者，將羊水和尿囊液混合，繼 續(xù)盲傳1代（72小時(shí)），如仍為陰性，則雞

15、胚 病毒分離為陰性，標(biāo)本可棄去 雞胚收獲HA試驗(yàn) 病毒鑒定 紅細(xì)胞凝集 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn) 病毒鑒定流程 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn) 4個(gè)凝集單位配制“回滴” 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn) 判定流感病毒型別 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA） l MDCK細(xì)胞或雞胚收獲的標(biāo)本分離物首先用雞、豚 鼠或人紅細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA），確定病 毒滴度 l 原理：流感病毒顆粒表面的血凝素蛋白原理：流感病毒顆粒表面的血凝素蛋白（HA）含）含 有能結(jié)合并識(shí)別紅細(xì)胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂有能結(jié)合并識(shí)別紅細(xì)胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂 蛋白結(jié)構(gòu)，許多哺乳動(dòng)物和禽的紅細(xì)胞表面均含有蛋白結(jié)構(gòu)，許多哺乳動(dòng)物和禽的紅細(xì)胞表面均含有 這兩種成分。因

16、此流感病毒能與其結(jié)合并識(shí)別，產(chǎn)這兩種成分。因此流感病毒能與其結(jié)合并識(shí)別，產(chǎn) 生凝集現(xiàn)象。當(dāng)血清中有特異性抗體與病毒血凝素生凝集現(xiàn)象。當(dāng)血清中有特異性抗體與病毒血凝素 結(jié)合后，可以抑制凝集現(xiàn)象出現(xiàn)結(jié)合后，可以抑制凝集現(xiàn)象出現(xiàn) 紅細(xì)胞紅細(xì)胞雞雞火雞火雞豚鼠豚鼠人人 O 型 血 紅型 血 紅 細(xì)胞細(xì)胞 馬馬 適用范圍流感和禽流 感病毒 流 感 和 禽 流感病毒 流感病毒流感病毒禽流感病毒 終 濃 度 （） 0.5（1%）0.5（1%）0.75（1.5%） /0.5（1%） 0.75（1.5%） /0.5（1%） 0.5（1%） 孔底部形 狀 U或V型U或V型U型U型U型 孵育時(shí)間30min30min

17、45min45min60min 細(xì)胞對(duì)照細(xì)胞沉積成 圓點(diǎn)狀，傾 斜時(shí)細(xì)胞向 下流成淚滴 狀 細(xì) 胞 沉 積 成圓點(diǎn)狀， 傾 斜 時(shí) 細(xì) 胞 向 下 流 成淚滴狀 細(xì)胞沉積成 環(huán)狀 細(xì)胞沉積成 環(huán)狀 細(xì)胞沉積成 環(huán)狀 A H B C D E F G 100ul病毒液 50ul 50ul50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul50ul50ul 50ul 50ul 稀釋完病毒液后加入稀釋完病毒液后加入50ul紅細(xì)胞懸液紅細(xì)胞懸液 50ulPBS 稀釋病毒 加入配制好 的紅細(xì)胞懸 液 充分混勻， 置室溫孵育 30-60分鐘 觀察記錄結(jié) 果 病病 毒毒 原原 液液 1：2 1：128

18、HA： 32 HA128 HA： 4 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA） lHA滴度8，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制（HI） 試驗(yàn)；HA滴度8者，繼續(xù)在敏感的MDCK 細(xì)胞系或雞胚上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使其HA滴 度8后，再進(jìn)行HI測(cè)定 l若傳12代后，HA滴度仍8者，可應(yīng)用核 酸檢測(cè)方法進(jìn)行鑒定 紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗(yàn) HA試驗(yàn)完成后，用國(guó)家流感中心每年提供 的抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗B （Victoria系）和抗B（Yamagata系）4種標(biāo) 準(zhǔn)參照血清，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制（HI） 試驗(yàn)，確定病毒的型別和亞型，進(jìn)行HI試 驗(yàn)時(shí)，需同時(shí)進(jìn)行4種標(biāo)準(zhǔn)抗原對(duì)照。 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)步驟 4個(gè)凝集單位的配制

19、和檢測(cè) 稀釋血清 加入25ul 4個(gè)血凝單位抗原，室溫孵育15-30 分鐘 每孔加入50ul紅細(xì)胞懸液，充分搖勻。室溫 孵育30-60分鐘 觀察記錄結(jié)果 4個(gè)凝集單位的配制和檢測(cè) 4個(gè)凝集單位的配制 讀取紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)的結(jié)果 計(jì)算所須的4個(gè)凝集單位的病毒用量 用50ul檢測(cè)4個(gè)凝集單位時(shí)，用凝集效價(jià)除以8， 所得商即為4個(gè)單位的稀釋度 用紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)“回滴”，復(fù)核4個(gè)凝集單 位 用50ul，前4孔完全凝集 。此時(shí)的抗原即為4個(gè) 凝集單位 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)稀釋血清紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)稀釋血清 12765349810 H1 血清 50ul H3 血清 50ul 50ul PBS B 血清 50u

20、l 25ul PBS 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul B 血清 50ul H3 血清 50ul H1 血清 50ul 流感病毒的型別判定 標(biāo)準(zhǔn)參照血清對(duì)待鑒定病毒的抑制效價(jià) 20才可以算為陽(yáng)性 一個(gè)待鑒定病毒不能同時(shí)被兩種或兩種 以上的標(biāo)準(zhǔn)血清抑制 待鑒定病毒與標(biāo)準(zhǔn)參照血清有交叉抑制， 但與一種標(biāo)準(zhǔn)參照血清抑制效價(jià)大于其他 參照血清4倍以上時(shí)，可以判定為此型別的 流感病毒 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)-質(zhì)量控制 使用的試劑可靠無(wú)誤 處理后的血清有無(wú)殘余非特異性凝集素 讀取HA試驗(yàn)的結(jié)果是否正確 4個(gè)血凝單位是否準(zhǔn)確 紅細(xì)胞陰性對(duì)照 待鑒定病毒確保沒(méi)有被細(xì)菌

21、污染 稀釋血清、病毒、紅細(xì)胞懸液加入量準(zhǔn)確 結(jié)果錄入 流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室的工作人員在完成病毒 分離后，24小時(shí)內(nèi)將病毒分離結(jié)果錄入“監(jiān) 測(cè)信息系統(tǒng)”中的“病毒分離、鑒定結(jié)果 登記一覽表” 中 。 毒株的送檢 系統(tǒng)自動(dòng)生產(chǎn)的送檢單，省里和國(guó)家均送 檢 時(shí)限要求 包裝要求 2012年年 底底 50%省省CDC 建成省級(jí)流建成省級(jí)流 感參比中心，感參比中心， 70 %網(wǎng)絡(luò)實(shí)網(wǎng)絡(luò)實(shí) 驗(yàn)室開(kāi)展病驗(yàn)室開(kāi)展病 毒分離毒分離 90%省省CDC 建成省級(jí)建成省級(jí) 流感參比流感參比 中心，中心，90 %網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn) 室開(kāi)展病室開(kāi)展病 毒分離毒分離 2015年底年底 省級(jí)參比中心 開(kāi)始啟動(dòng) 9個(gè)（30%）省級(jí)C

22、DC建成省級(jí)流感參比 中心80 %網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展病毒分離 2009-2013年度全國(guó)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室工作開(kāi)展情況年度全國(guó)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室工作開(kāi)展情況 62 199 248 297 327 199 151 101 68 1 13 111213 0 100 200 300 400 500 2009年年4月份前月份前2009-2010年度年度2010-2011年度年度2011-2012年度年度2012-2013年度年度 網(wǎng)網(wǎng) 絡(luò)絡(luò) 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 室室 （ 家家 ） 開(kāi)展病毒分離的Lab僅開(kāi)展核酸檢測(cè)的Lab未開(kāi)展工作的Lab 80.1% 70 75 80 85 90 95 100 0 100 200 300 40

23、0 500 2010年年2011年年2012年年2013年年 正正 確確 率率 （ % ） 網(wǎng)網(wǎng) 絡(luò)絡(luò) 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 室室 數(shù)數(shù) （ 家家 ） 未參與考核的家數(shù)考核結(jié)果有誤的lab 考核結(jié)果全部正確的lab全部正確率（%） 2010-2013年度全國(guó)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室盲樣考核情況年度全國(guó)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室盲樣考核情況 97.5%93.2% 96.0% 2010-2013年度全國(guó)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果年度全國(guó)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果 32600 28679 27852 30120 2803727239 4738 12632 12728 0 10000 20000 30000 40000 2010-2011年度201

24、1-2012年度2012-2013年度 標(biāo)標(biāo) 本本 數(shù)數(shù) （ 份份 ） 陽(yáng)性的標(biāo)本數(shù)陽(yáng)性的標(biāo)本數(shù)進(jìn)行亞型鑒定的標(biāo)本數(shù)進(jìn)行亞型鑒定的標(biāo)本數(shù)分離毒株數(shù)分離毒株數(shù) 省級(jí)流感參比中心工作要求省級(jí)流感參比中心工作要求 至少每月編撰至少每月編撰1次監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析報(bào)告，在疫情流行次監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析報(bào)告，在疫情流行 期每周編撰期每周編撰1次監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析報(bào)告次監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析報(bào)告，并上報(bào)。，并上報(bào)。 監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析 定期培訓(xùn)和現(xiàn)場(chǎng)指導(dǎo)相結(jié)合；定期培訓(xùn)和現(xiàn)場(chǎng)指導(dǎo)相結(jié)合； 每年組織對(duì)本省至少每年組織對(duì)本省至少30%的流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室及的流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室及 哨點(diǎn)醫(yī)院進(jìn)行督導(dǎo)檢查哨點(diǎn)醫(yī)院進(jìn)行督導(dǎo)檢查，督導(dǎo)報(bào)告上報(bào)備

25、案。，督導(dǎo)報(bào)告上報(bào)備案。 培訓(xùn)培訓(xùn)和督導(dǎo)和督導(dǎo) 中國(guó)疾控中心每年中國(guó)疾控中心每年對(duì)對(duì)省級(jí)流感參比中心省級(jí)流感參比中心和和抽查抽查的的1-2家網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室家網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室 進(jìn)行流感盲樣標(biāo)本考核進(jìn)行流感盲樣標(biāo)本考核； 省級(jí)流感參比中心每年考核本轄區(qū)內(nèi)所有網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室；省級(jí)流感參比中心每年考核本轄區(qū)內(nèi)所有網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室； 每年組織對(duì)轄區(qū)內(nèi)的流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)成員單位進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估每年組織對(duì)轄區(qū)內(nèi)的流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)成員單位進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估 考核和評(píng)估考核和評(píng)估 省級(jí)流感參比中心工作要求省級(jí)流感參比中心工作要求 4年內(nèi)，使本省所有流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室均具備有病毒分離能力；年內(nèi)，使本省所有流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室均具備有病毒分離能力； 本省至少有本

26、省至少有2/3的網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室每年送國(guó)家流感中心的毒株數(shù)的網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室每年送國(guó)家流感中心的毒株數(shù) 不少于不少于30株。株。 實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè) 逐步建立流感病毒抗原性、基因特性分析以及耐藥性分析逐步建立流感病毒抗原性、基因特性分析以及耐藥性分析 能力，相應(yīng)結(jié)果報(bào)送至中國(guó)疾控中心；能力，相應(yīng)結(jié)果報(bào)送至中國(guó)疾控中心； 序列數(shù)據(jù)提交全國(guó)流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)基因序列共享數(shù)據(jù)庫(kù)。序列數(shù)據(jù)提交全國(guó)流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)基因序列共享數(shù)據(jù)庫(kù)。 實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè) 負(fù)責(zé)對(duì)本轄區(qū)內(nèi)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室季節(jié)性流感毒株在負(fù)責(zé)對(duì)本轄區(qū)內(nèi)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室季節(jié)性流感毒株在10個(gè)工作日個(gè)工作日 內(nèi)進(jìn)行復(fù)核鑒定內(nèi)進(jìn)行復(fù)核鑒定； 對(duì)對(duì)HA（血凝）滴度（血凝）滴度8

27、的毒株利用的毒株利用HI方法進(jìn)行復(fù)核鑒定方法進(jìn)行復(fù)核鑒定； 對(duì)對(duì)HA8的毒株進(jìn)行核酸分型的毒株進(jìn)行核酸分型/亞型鑒定亞型鑒定； 每周一每周一反饋反饋上周復(fù)核結(jié)果。上周復(fù)核結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè) 參比中心近期要求參比中心近期要求 成為參比中心4年內(nèi)，所有流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室 均具備病毒分離能力，并上送毒株 省參比中心的毒株復(fù)核鑒定工作 各實(shí)驗(yàn)室毒株在網(wǎng)上送檢時(shí)需要多點(diǎn)一下送省里 毒株 國(guó)家流感中心 省CDC 10個(gè)工作日內(nèi) 完成復(fù)核鑒定 滴度8的型別鑒定，滴度8核酸鑒定，每周一 在系統(tǒng)中反饋結(jié)果 質(zhì)控考核-考核標(biāo)本 考核標(biāo)本制備： 14份H1N1，14份H3N2，14份 BV， 10份 H5N1，7份H7N9，10份陰性 7份BY和H3N2混合型 4份H1N1，H3N2，BY混合型 每個(gè)地市隨機(jī)抽取5份標(biāo)本 質(zhì)控考核-新的要求 增加混合型 B型要求分系 考慮到運(yùn)輸問(wèn)題，均為強(qiáng)陽(yáng)性 質(zhì)控考核-結(jié)果 14家網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果全部正確 一些問(wèn)題： 原始記錄應(yīng)為手寫(xiě)，而非全部打印原始記錄應(yīng)為手寫(xiě)，而非全部打印+簽名簽名 原始記錄空白項(xiàng)、涂改項(xiàng)原始記錄空白項(xiàng)、涂改項(xiàng) 有一地市為非正式的報(bào)告單，報(bào)告人未簽有一地市為非正式的報(bào)告單