微生物學(xué)：07 第六章 微生物生長(zhǎng)及其控制

1、第六章第六章 微生物的生長(zhǎng)及其控制微生物的生長(zhǎng)及其控制 微生物生長(zhǎng)繁殖的定義微生物生長(zhǎng)繁殖的定義 微生物微生物生長(zhǎng)生長(zhǎng)是細(xì)胞物質(zhì)有規(guī)律的、不可逆的增加，導(dǎo)致細(xì)胞是細(xì)胞物質(zhì)有規(guī)律的、不可逆的增加，導(dǎo)致細(xì)胞體積體積擴(kuò)大的生物學(xué)擴(kuò)大的生物學(xué) 過(guò)程。過(guò)程。 繁殖繁殖是微生物生長(zhǎng)到一定階段，由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)制與重建并通過(guò)特定方式產(chǎn)是微生物生長(zhǎng)到一定階段，由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)制與重建并通過(guò)特定方式產(chǎn) 生新的生命個(gè)體，引起生命個(gè)體生新的生命個(gè)體，引起生命個(gè)體數(shù)量數(shù)量增加的生物學(xué)過(guò)程。增加的生物學(xué)過(guò)程。 群體生長(zhǎng)群體生長(zhǎng)= =個(gè)體生長(zhǎng)個(gè)體生長(zhǎng)+ +個(gè)體繁殖個(gè)體繁殖 在微生物學(xué)里在微生物學(xué)里, , 生長(zhǎng)生長(zhǎng)定義為群

2、體生長(zhǎng)，注重于個(gè)體數(shù)量的增加。定義為群體生長(zhǎng)，注重于個(gè)體數(shù)量的增加。 微生物生長(zhǎng)繁殖微生物生長(zhǎng)繁殖 物質(zhì)合成：結(jié)構(gòu)單體的合成物質(zhì)合成：結(jié)構(gòu)單體的合成 多聚化多聚化 核苷酸合成核苷酸合成 DNADNA復(fù)制、復(fù)制、RNARNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 氨基酸合成氨基酸合成 多肽、蛋白質(zhì)合成多肽、蛋白質(zhì)合成 以數(shù)量變化對(duì)微生物生長(zhǎng)情況進(jìn)行測(cè)定以數(shù)量變化對(duì)微生物生長(zhǎng)情況進(jìn)行測(cè)定 1、培養(yǎng)平板計(jì)數(shù)、培養(yǎng)平板計(jì)數(shù) 法法 2、膜過(guò)濾培養(yǎng)、膜過(guò)濾培養(yǎng) 法法 3、顯微鏡直接計(jì)數(shù)、顯微鏡直接計(jì)數(shù) 法法 以生物量為指標(biāo)測(cè)定微生物的生長(zhǎng)以生物量為指標(biāo)測(cè)定微生物的生長(zhǎng) 1、重量法、重量法 2、生理指標(biāo)法、生理指標(biāo)法 3、比濁法、比濁法

3、 第一節(jié)第一節(jié) 測(cè)定微生物生長(zhǎng)繁殖的方測(cè)定微生物生長(zhǎng)繁殖的方 法法 4 1 1、重量法：、重量法： 可以用于單細(xì)胞、可以用于單細(xì)胞、多細(xì)胞及絲狀體微生物多細(xì)胞及絲狀體微生物 濕重：離心或過(guò)濾分離菌體，洗滌，直接稱重。發(fā)酵：濕重：離心或過(guò)濾分離菌體，洗滌，直接稱重。發(fā)酵：g g菌菌/L/L 干重：干重：105105烘干至恒重烘干至恒重 2 2、生理指標(biāo)法、生理指標(biāo)法 蛋白質(zhì)量：細(xì)菌中蛋白質(zhì)含量大約為蛋白質(zhì)量：細(xì)菌中蛋白質(zhì)含量大約為6565，蛋白質(zhì)含氮量，蛋白質(zhì)含氮量1616， 凱氏定氮法凱氏定氮法 （蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)氨離子氨離子蒸餾蒸餾 滴定）滴定） DNADNA，ATPATP等含量等含量 微生物

4、的呼吸強(qiáng)度，耗氧量，酶活性，生物熱以及產(chǎn)酸、產(chǎn)氣等微生物的呼吸強(qiáng)度，耗氧量，酶活性，生物熱以及產(chǎn)酸、產(chǎn)氣等 “ “吹口氣查胃病吹口氣查胃病”：13 13C C尿素呼氣法快速鑒定幽門螺桿菌（尿素酶）感染 尿素呼氣法快速鑒定幽門螺桿菌（尿素酶）感染 （ NH NH3 3和和13 13CO CO2 2 ） ） 以生物量為指標(biāo)測(cè)定微生物的生長(zhǎng)以生物量為指標(biāo)測(cè)定微生物的生長(zhǎng) 在一定波長(zhǎng)下，測(cè)定菌懸液的光密度，以光密度在一定波長(zhǎng)下，測(cè)定菌懸液的光密度，以光密度 (optical density, 即即O.D.)表示菌量。表示菌量。 實(shí)驗(yàn)測(cè)量時(shí)應(yīng)控制在菌濃度與光密度實(shí)驗(yàn)測(cè)量時(shí)應(yīng)控制在菌濃度與光密度 成正比的

5、線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。 相對(duì)值，不能區(qū)分死活菌 6 3、比濁法、比濁法 以生物量為指標(biāo)測(cè)定微生物的生長(zhǎng)以生物量為指標(biāo)測(cè)定微生物的生長(zhǎng) 直接計(jì)數(shù)法：顯微鏡，細(xì)菌計(jì)數(shù)板、血細(xì)胞計(jì)數(shù)扳直接計(jì)數(shù)法：顯微鏡，細(xì)菌計(jì)數(shù)板、血細(xì)胞計(jì)數(shù)扳 間接計(jì)數(shù)法：（活菌計(jì)數(shù)法）間接計(jì)數(shù)法：（活菌計(jì)數(shù)法） 平板菌落計(jì)數(shù)法平板菌落計(jì)數(shù)法 cfucfu (colony forming unit) (colony forming unit) 菌落形成單位菌落形成單位 e.g.: 100 e.g.: 100 cfucfu/ml/ml MPNMPN方法：方法：最大或然數(shù)最大或然數(shù)（most prob

6、able number)most probable number)計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)法 稀釋稀釋液體液體培養(yǎng)計(jì)數(shù)培養(yǎng)計(jì)數(shù) 膜過(guò)濾法：主要用于液體樣品中菌數(shù)很低時(shí)膜過(guò)濾法：主要用于液體樣品中菌數(shù)很低時(shí) 3 3、計(jì)數(shù)法：細(xì)菌、孢子、酵母菌等單細(xì)胞微生物的數(shù)量計(jì)數(shù)法：細(xì)菌、孢子、酵母菌等單細(xì)胞微生物的數(shù)量 以數(shù)量變化對(duì)微生物生長(zhǎng)情況進(jìn)行測(cè)定以數(shù)量變化對(duì)微生物生長(zhǎng)情況進(jìn)行測(cè)定 直接計(jì)數(shù)法：顯微鏡、細(xì)菌計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法：顯微鏡、細(xì)菌計(jì)數(shù)板/ /血細(xì)胞計(jì)數(shù)扳血細(xì)胞計(jì)數(shù)扳 Procedure for viable counting using serial dilutions of the sample and t

7、he pour plate method. 間接計(jì)數(shù)法：間接計(jì)數(shù)法： （活菌計(jì)數(shù)法）平（活菌計(jì)數(shù)法）平 板菌落計(jì)數(shù)法板菌落計(jì)數(shù)法 cfu cfu (colony forming (colony forming unit) unit) 菌落形成單菌落形成單 位位 e.g.: 100cfu/mle.g.: 100cfu/ml 159 * 5 * 103 Two methods of performing a viable count (plate count). In either case the sample must usually be diluted before plating. 澆注

8、平板澆注平板 涂布平板涂布平板 MPNMPN方法：方法：最大或然數(shù)最大或然數(shù)（most probable number)most probable number)計(jì)數(shù)法，又稱計(jì)數(shù)法，又稱 稀釋液體培養(yǎng)計(jì)數(shù)。稀釋液體培養(yǎng)計(jì)數(shù)。 適用于測(cè)定在一個(gè)混雜的微生物群落中雖不占優(yōu)勢(shì)，但卻具有特殊生理功適用于測(cè)定在一個(gè)混雜的微生物群落中雖不占優(yōu)勢(shì)，但卻具有特殊生理功 能的類群。能的類群。 膜過(guò)濾法：主要用于液體樣品中菌數(shù)很低時(shí)膜過(guò)濾法：主要用于液體樣品中菌數(shù)很低時(shí) 哪些方法在厭氧菌的測(cè)定中可以使用？哪些方法在厭氧菌的測(cè)定中可以使用？ 哪些方法在混合微生物的測(cè)定中可以使用？哪些方法在混合微生物的測(cè)定中可以使用

9、？ 哪些方法適合于高濃度微生物（如：糞便）檢測(cè)，哪些方法適合于高濃度微生物（如：糞便）檢測(cè)， 哪些方法適用于飲用水中的微生物檢測(cè)？哪些方法適用于飲用水中的微生物檢測(cè)？ 有多種微生物混在一起的情況下我要檢測(cè)其中某一種微生物有多種微生物混在一起的情況下我要檢測(cè)其中某一種微生物 量，應(yīng)該怎么做？量，應(yīng)該怎么做？ 第二節(jié)第二節(jié) 微生物的生長(zhǎng)規(guī)律微生物的生長(zhǎng)規(guī)律 了解細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律了解細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律, 對(duì)其進(jìn)行研究與利對(duì)其進(jìn)行研究與利 用用 細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的規(guī)律（細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的規(guī)律（標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)曲線標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)曲線） 及控制技術(shù)（及控制技術(shù)（連續(xù)培養(yǎng)的概念與方法連續(xù)培養(yǎng)的概念與方法） 一、同步培養(yǎng)一、同步培養(yǎng)

10、 (Synchronous culture) (Synchronous culture) 2 2、機(jī)械篩選法、機(jī)械篩選法 （1 1）密度梯度離心法）密度梯度離心法 （2 2）過(guò)濾分離法）過(guò)濾分離法 （3 3）膜洗脫法）膜洗脫法 1 1、環(huán)境條件誘導(dǎo)法、環(huán)境條件誘導(dǎo)法 （1 1）溫度）溫度 （短期熱休克法）（短期熱休克法） （2 2）培養(yǎng)基成分）培養(yǎng)基成分 （用氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成）（用氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成） （3 3）明顯的生理周期）明顯的生理周期 （藻類細(xì)胞的光照、黑暗控制）（藻類細(xì)胞的光照、黑暗控制） 研究微生物個(gè)體生長(zhǎng)的方法研究微生物個(gè)體生長(zhǎng)的方法 生理與遺傳特性的研究；生理與遺

11、傳特性的研究； 工業(yè)發(fā)酵的種子；工業(yè)發(fā)酵的種子； 同步培養(yǎng)物：同步培養(yǎng)物：一種理想的材料一種理想的材料 硝酸纖維素濾膜法是最經(jīng)典的獲得同步生長(zhǎng)的方法硝酸纖維素濾膜法是最經(jīng)典的獲得同步生長(zhǎng)的方法 由于細(xì)胞的個(gè)體差異，同步生長(zhǎng)往往只能維持由于細(xì)胞的個(gè)體差異，同步生長(zhǎng)往往只能維持2-3個(gè)世代，個(gè)世代， 隨后又逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機(jī)生長(zhǎng)。隨后又逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機(jī)生長(zhǎng)。 16 生長(zhǎng)曲線生長(zhǎng)曲線（growth curve）：菌數(shù)變化規(guī)律：菌數(shù)變化規(guī)律 時(shí)間為橫坐標(biāo)、時(shí)間為橫坐標(biāo)、菌數(shù)對(duì)數(shù)菌數(shù)對(duì)數(shù)作為縱坐標(biāo)作為縱坐標(biāo) 生長(zhǎng)速率常數(shù)生長(zhǎng)速率常數(shù) (growth rate constant)(growth rate con

12、stant) （R: R: 每小時(shí)分裂每小時(shí)分裂次數(shù)次數(shù)） 延滯期延滯期 Lag phase 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 Exponential phase 穩(wěn)定生長(zhǎng)期穩(wěn)定生長(zhǎng)期 Stationary phase 衰亡期衰亡期 Death phase 二、細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律二、細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律 特點(diǎn)：生長(zhǎng)速率接近零特點(diǎn)：生長(zhǎng)速率接近零 細(xì)胞形態(tài)變大或增大細(xì)胞形態(tài)變大或增大 rRNA含量增高含量增高 合成代謝十分活躍合成代謝十分活躍 對(duì)環(huán)境比較敏感對(duì)環(huán)境比較敏感 原因原因：（：（1）種子老化種子老化 （2）適應(yīng)新環(huán)境的酶系統(tǒng)沒(méi)有表達(dá)）適應(yīng)新環(huán)境的酶系統(tǒng)沒(méi)有表達(dá) 解決方法解決方法： （1）接種齡）接種齡

13、指數(shù)期種子最好指數(shù)期種子最好 （2）接種量）接種量 實(shí)驗(yàn)室：實(shí)驗(yàn)室：3-5%，工業(yè)發(fā)酵：，工業(yè)發(fā)酵：10% （3）培養(yǎng)基：發(fā)酵與種子培養(yǎng)基成分接近）培養(yǎng)基：發(fā)酵與種子培養(yǎng)基成分接近 1 1、延滯（遲緩）期、延滯（遲緩）期 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 生長(zhǎng)速率常數(shù)最大生長(zhǎng)速率常數(shù)最大 菌體成分均勻菌體成分均勻 代謝旺盛代謝旺盛 影響指數(shù)期微生物代時(shí)長(zhǎng)短的因素影響指數(shù)期微生物代時(shí)長(zhǎng)短的因素 菌種菌種 營(yíng)養(yǎng)成分營(yíng)養(yǎng)成分 營(yíng)養(yǎng)物濃度營(yíng)養(yǎng)物濃度 培養(yǎng)溫度培養(yǎng)溫度 2、指數(shù)（對(duì)數(shù)）期：、指數(shù)（對(duì)數(shù)）期： v生長(zhǎng)限制因子生長(zhǎng)限制因子 （growth-limited factor)growth-limited factor

14、)：凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可 影響生長(zhǎng)速率的營(yíng)養(yǎng)物成分，就稱為生長(zhǎng)限制因子。影響生長(zhǎng)速率的營(yíng)養(yǎng)物成分，就稱為生長(zhǎng)限制因子。 對(duì)數(shù)期菌種是研究微生物基本代謝的良好材料；對(duì)數(shù)期菌種是研究微生物基本代謝的良好材料； 也常在生產(chǎn)上用作種子，使發(fā)酵的遲緩期縮短也常在生產(chǎn)上用作種子，使發(fā)酵的遲緩期縮短 指數(shù)期的三個(gè)參數(shù)： N，繁殖代數(shù)，繁殖代數(shù) G，代時(shí)，代時(shí) R，生長(zhǎng)速率常數(shù)，生長(zhǎng)速率常數(shù) N N，繁殖代數(shù)，繁殖代數(shù) 20 Relationship between nutrient concentration, growth rate (green curve), and g

15、rowth yield (red curve) in a batch culture (closed system). At low nutrient concentrations both growth rate and growth yield are affected. Y=(X-X0)/(C0-C) 生長(zhǎng)得率生長(zhǎng)得率 3）營(yíng)養(yǎng)物濃度，）營(yíng)養(yǎng)物濃度，在一定范圍內(nèi)，生長(zhǎng)速率與營(yíng)養(yǎng)物濃度呈正在一定范圍內(nèi)，生長(zhǎng)速率與營(yíng)養(yǎng)物濃度呈正 比比 凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可影響生長(zhǎng)速率的營(yíng)養(yǎng)物成分，就凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可影響生長(zhǎng)速率的營(yíng)養(yǎng)物成分，就 稱為生長(zhǎng)限制因子。稱為生長(zhǎng)限制因子。C=0 生長(zhǎng)

16、得率：生長(zhǎng)得率： Y=(X-X0)/(C0-C) X：微生物生物量：微生物生物量 C: 底物量底物量 指數(shù)期的三個(gè)參數(shù)：指數(shù)期的三個(gè)參數(shù)： N，繁殖代數(shù)，繁殖代數(shù) G，代時(shí)，代時(shí) R，生長(zhǎng)速率常數(shù)：，生長(zhǎng)速率常數(shù)：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)分裂次數(shù)單位時(shí)間內(nèi)分裂次數(shù) n R= 1/G = t1 t0 t1 t0 G = n 在細(xì)菌個(gè)體生長(zhǎng)里，每個(gè)細(xì)菌分裂繁殖在細(xì)菌個(gè)體生長(zhǎng)里，每個(gè)細(xì)菌分裂繁殖 一代所需的時(shí)間為一代所需的時(shí)間為代時(shí)代時(shí)(Generation time)， 代時(shí)通常以代時(shí)通常以G表示。表示。 在群體生長(zhǎng)里細(xì)菌數(shù)量增加一倍所需在群體生長(zhǎng)里細(xì)菌數(shù)量增加一倍所需 的時(shí)間稱為的時(shí)間稱為倍增時(shí)間倍增時(shí)間（D

17、oubling time)。 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 生長(zhǎng)速率為零生長(zhǎng)速率為零（即細(xì)菌分裂增加的數(shù)量等于細(xì)菌死亡數(shù)（即細(xì)菌分裂增加的數(shù)量等于細(xì)菌死亡數(shù)) ，活菌，活菌 數(shù)最多數(shù)最多 開(kāi)始儲(chǔ)存糖原等內(nèi)含物開(kāi)始儲(chǔ)存糖原等內(nèi)含物 芽孢桿菌：形成芽孢芽孢桿菌：形成芽孢 次生代謝物次生代謝物 （secondary metabolites)secondary metabolites) 原因：原因： 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡 營(yíng)養(yǎng)物比例失調(diào)營(yíng)養(yǎng)物比例失調(diào) pHpH、氧化還原勢(shì)等環(huán)境變化、氧化還原勢(shì)等環(huán)境變化 3 3、穩(wěn)定生長(zhǎng)期：、穩(wěn)定生長(zhǎng)期： 生產(chǎn)上延長(zhǎng)穩(wěn)定期的方法：生產(chǎn)上延長(zhǎng)穩(wěn)定期的方法： 補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（補(bǔ)料）或取

18、走代謝產(chǎn)物、補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（補(bǔ)料）或取走代謝產(chǎn)物、 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH、調(diào)節(jié)溫度、調(diào)節(jié)溫度、 對(duì)好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩對(duì)好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩 獲得更多的菌體物質(zhì)或積累更多的代謝產(chǎn)物獲得更多的菌體物質(zhì)或積累更多的代謝產(chǎn)物 現(xiàn)象現(xiàn)象： 代謝活性降低、代謝活性降低、 衰老自溶衰老自溶(autolysis)(autolysis) 芽孢桿菌：釋放芽孢芽孢桿菌：釋放芽孢 原因原因： 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡 有毒代謝產(chǎn)物大量積累有毒代謝產(chǎn)物大量積累 4 4、衰亡期（、衰亡期（death phase)death phase)： 二次生長(zhǎng)曲線與葡萄糖效應(yīng)二次生長(zhǎng)曲線與葡萄糖效應(yīng) 葡萄糖效應(yīng)葡萄糖效應(yīng) 當(dāng)培養(yǎng)

19、基中存在葡萄糖時(shí)，其他碳源的利用會(huì)嚴(yán)格受到抑制，當(dāng)培養(yǎng)基中存在葡萄糖時(shí)，其他碳源的利用會(huì)嚴(yán)格受到抑制， 直到葡萄糖完全消耗為止。直到葡萄糖完全消耗為止。 JacobJacob和和 MonodMonod首次研究了葡萄糖效應(yīng)，提出了操縱子概念，首次研究了葡萄糖效應(yīng)，提出了操縱子概念， 由此獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。他們的工作開(kāi)創(chuàng)了原核基因調(diào)控的時(shí)代。由此獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。他們的工作開(kāi)創(chuàng)了原核基因調(diào)控的時(shí)代。 遲緩期1 遲緩期2 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期1 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期2 速效源 遲效源 穩(wěn)定期 基本原則：基本原則： 不斷補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 移出培養(yǎng)物移出培養(yǎng)物 恒化器連續(xù)培養(yǎng)恒化器連續(xù)培養(yǎng) 恒濁器連續(xù)培養(yǎng)恒濁器連續(xù)

20、培養(yǎng) 三、連續(xù)培養(yǎng)三、連續(xù)培養(yǎng) (continuous culture) 在微生物的整個(gè)培養(yǎng)期間，在微生物的整個(gè)培養(yǎng)期間， 通過(guò)一定的方式使微生物通過(guò)一定的方式使微生物 能保持在能保持在指數(shù)期的平衡生指數(shù)期的平衡生 長(zhǎng)狀態(tài)和恒定的生長(zhǎng)速率長(zhǎng)狀態(tài)和恒定的生長(zhǎng)速率 上上的一種培養(yǎng)方法。的一種培養(yǎng)方法。 -開(kāi)開(kāi) 放培養(yǎng)放培養(yǎng) 恒濁器 （turbidostat)：微生物量恒定（菌體密度） 恒化器 （chemostat)：培養(yǎng)液流速保持不變及R（限定因子） 微生物始終在低于其最高生長(zhǎng)速率下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。微生物始終在低于其最高生長(zhǎng)速率下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。 多級(jí)連續(xù)培養(yǎng)器 （multi-step continu

21、ous fermentor) 丙酮、丁醇發(fā)酵 （by Clostridium acetobutylicum 丙酮丁醇梭菌) 前期：菌體生長(zhǎng)期（trophophase) 37 C, dilution rate: 0.125/h 后期：產(chǎn)物合成期 （idiophase) 33 C, dilution rate: 0.04/h 恒濁培養(yǎng)：過(guò)量的必需營(yíng)養(yǎng)物，菌體維持最高的生長(zhǎng)速率。恒濁培養(yǎng)：過(guò)量的必需營(yíng)養(yǎng)物，菌體維持最高的生長(zhǎng)速率。 一般用于菌體以及與菌體生長(zhǎng)平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的發(fā)酵工業(yè)一般用于菌體以及與菌體生長(zhǎng)平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的發(fā)酵工業(yè) 連續(xù)培養(yǎng)的應(yīng)用例子：生活污水微生物凈化連續(xù)培養(yǎng)的應(yīng)用例子：生

22、活污水微生物凈化 四、微生物的高密度培養(yǎng)四、微生物的高密度培養(yǎng) （high cell-density culture, HCDC)high cell-density culture, HCDC) 超過(guò)常規(guī)培養(yǎng)10倍以上時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)或培養(yǎng)技術(shù) E.coli工程菌生產(chǎn)多肽類藥物的實(shí)踐中發(fā)展 E.coli W3110: 174g（濕重）/L 進(jìn)行高密度培養(yǎng)方法 選取最佳培養(yǎng)基 適時(shí)補(bǔ)料 提高溶解氧濃度 防止有害代謝產(chǎn)物生成 保持合適pH 第三節(jié)第三節(jié) 影響微生物生長(zhǎng)的主要因素影響微生物生長(zhǎng)的主要因素 溫度三基點(diǎn)溫度三基點(diǎn) （對(duì)同一種微生物）（對(duì)同一種微生物） 最適生長(zhǎng)溫度最適生長(zhǎng)溫度 最高生長(zhǎng)溫度最

23、高生長(zhǎng)溫度 最低生長(zhǎng)溫度最低生長(zhǎng)溫度 一、溫度一、溫度 Effect of temperature on growth rate and the molecular consequences for the cell. The three cardinal temperatures vary by organism. 350 溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的具體影響：溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的具體影響： （1 1）酶活性；）酶活性； （2 2）細(xì)胞質(zhì)膜的流動(dòng)性；）細(xì)胞質(zhì)膜的流動(dòng)性； （3 3）物質(zhì)的溶解度。）物質(zhì)的溶解度。 Growth of hyperthermophiles in boiling water.

24、Yellow Stone National ParkYellow Stone National Park 二、氧氣二、氧氣 專性好氧菌專性好氧菌兼性好氧菌兼性好氧菌 耐氧菌耐氧菌 微好氧菌微好氧菌 厭氧菌厭氧菌 氧的毒副作用氧的毒副作用 及其解毒及其解毒 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD） 過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化氫酶 過(guò)氧化物酶過(guò)氧化物酶 好氧菌好氧菌 耐氧菌耐氧菌 Caption: Method for testing a microbial culture for the presence of catalase. A heavy loopful of cells from an agar

25、culture was mixed on a slide with a drop of 30% hydrogen peroxide. The immediate appearance of bubbles is indicative of the presence of catalase. The bubbles are O2 produced by the reaction H2O2 + H2O2 2 H2O + O2. 檢測(cè)過(guò)氧化氫酶檢測(cè)過(guò)氧化氫酶 對(duì)不同類型微生物采取不同的培養(yǎng)方式：對(duì)不同類型微生物采取不同的培養(yǎng)方式： 好氧：振蕩、通氣好氧：振蕩、通氣 專性厭氧：除氧，加還原劑專性厭氧：

26、除氧，加還原劑 耐氧型：深層靜止培養(yǎng)耐氧型：深層靜止培養(yǎng) 三、pH 三、三、pH pHpH對(duì)微生物生長(zhǎng)的具體影響：對(duì)微生物生長(zhǎng)的具體影響： 細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的pHpH卻相當(dāng)穩(wěn)定，胞內(nèi)酶的最適卻相當(dāng)穩(wěn)定，胞內(nèi)酶的最適pHpH接近內(nèi)環(huán)境接近內(nèi)環(huán)境pHpH 周質(zhì)空間的酶和胞外酶的最適周質(zhì)空間的酶和胞外酶的最適pHpH則接近環(huán)境則接近環(huán)境pH pH 直接影響：直接影響： 酸酸破壞破壞DNADNA、ATPATP、葉綠素等、葉綠素等 堿堿破壞破壞RNARNA、磷脂、磷脂 間接影響：間接影響： （1 1）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度 （2 2）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收 （3 3

27、）有害物對(duì)微生物的毒害）有害物對(duì)微生物的毒害 （4 4）代謝反應(yīng)中各種酶活性）代謝反應(yīng)中各種酶活性 微生物代謝活動(dòng)可改變微生物代謝活動(dòng)可改變pHpH值值 糖類糖類 發(fā)酵、氧化發(fā)酵、氧化有機(jī)酸有機(jī)酸變酸變酸 脂肪脂肪 水解水解 有機(jī)酸有機(jī)酸變酸變酸 (NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4 吸收 吸收NHNH4 4 離子 離子 H H2 2SOSO4 4 變酸變酸 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)脫羧脫羧胺類胺類 變堿變堿 NaNONaNO3 3 吸收吸收NONO3 3 離子 離子NaOH NaOH 變堿變堿 pHpH調(diào)節(jié)調(diào)節(jié) 第四節(jié)第四節(jié) 微生物培養(yǎng)法微生物培養(yǎng)法 一、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)法一、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)法 （一）固體

28、培養(yǎng)法（一）固體培養(yǎng)法 1. 好氧菌的固體培養(yǎng) 試管斜面（test-tube slant) 瓊脂平板（agar-plate) 2. 厭氧菌的固體培養(yǎng) 亨蓋特滾管技術(shù)（Hungate rolltube technique) 厭氧罐 （anaerobic Jar) 厭氧手套箱 （anaerobic glove box) （二）液體培養(yǎng)法 1. 好氧菌的液體培養(yǎng) 搖瓶培養(yǎng) (shake-flask cultivation) 臺(tái)式發(fā)酵罐 (benchtop fermentor) 2. 厭氧菌的液體培養(yǎng) 上層去氧 添加還原劑 有機(jī)還原劑：巰基乙酸、半胱氨酸、維生素C 無(wú)機(jī)還原劑: 硫化鈉，鐵絲 二、生產(chǎn)

29、實(shí)踐中培養(yǎng)微生物的裝置二、生產(chǎn)實(shí)踐中培養(yǎng)微生物的裝置 （一）固體培養(yǎng)法（一）固體培養(yǎng)法 （二）液體培養(yǎng)法（二）液體培養(yǎng)法 好氧菌的曲法培養(yǎng)好氧菌的曲法培養(yǎng) 厭氧菌的堆積培養(yǎng)厭氧菌的堆積培養(yǎng) 好氧菌的培養(yǎng)好氧菌的培養(yǎng) 49 1. 好氧菌的曲法培養(yǎng)好氧菌的曲法培養(yǎng) （一）固體培養(yǎng)法（一）固體培養(yǎng)法 50 51 醬油釀造業(yè)醬油釀造業(yè) 1 1）豐富而均勻的養(yǎng)料；）豐富而均勻的養(yǎng)料； 2 2）良好的通氣和攪拌；）良好的通氣和攪拌； 3 3）適宜的溫度和酸堿度；）適宜的溫度和酸堿度； 4 4）防止雜菌的污染。）防止雜菌的污染。 發(fā)酵罐的主要作用：發(fā)酵罐的主要作用： 所需裝置所需裝置 1 1）合理結(jié)構(gòu)的罐體

30、）合理結(jié)構(gòu)的罐體 2 2）培養(yǎng)基配制系統(tǒng)）培養(yǎng)基配制系統(tǒng) 3 3）蒸汽滅菌系統(tǒng)）蒸汽滅菌系統(tǒng) 4 4）空氣壓縮和過(guò)濾系統(tǒng)）空氣壓縮和過(guò)濾系統(tǒng) 5 5）發(fā)酵產(chǎn)物的后處理系統(tǒng)）發(fā)酵產(chǎn)物的后處理系統(tǒng) 52 （二）液體培養(yǎng)法（二）液體培養(yǎng)法: : 發(fā)酵罐發(fā)酵罐 典型發(fā)酵罐的構(gòu)造及其運(yùn)轉(zhuǎn)原理典型發(fā)酵罐的構(gòu)造及其運(yùn)轉(zhuǎn)原理 53 第五節(jié)第五節(jié) 微生物生長(zhǎng)繁殖的控制微生物生長(zhǎng)繁殖的控制 一、幾個(gè)基本概念一、幾個(gè)基本概念 控制害菌控制害菌 殺滅殺滅 抑制抑制 徹底殺滅滅菌徹底殺滅滅菌 （sterilization) 部分滅菌部分滅菌 消毒消毒 (disinfection) 抑制霉腐微生物防腐抑制霉腐微生物防腐

31、(antisepsis) - 低溫，缺氧，干燥，高滲，高酸度，低溫，缺氧，干燥，高滲，高酸度， 高醇度，加防腐劑高醇度，加防腐劑 抑制宿主體內(nèi)的病原菌化療抑制宿主體內(nèi)的病原菌化療 （chemotherapy) 殺菌殺菌 (bacteriocidation) 溶菌溶菌 (bacteriolysis) 抑菌抑菌 殺菌殺菌 溶菌溶菌 抑制抑制(Inhibition)： 死亡死亡(Death)： 防腐防腐(Antisepsis)：防止或抑制霉腐微生物在食品等物質(zhì)上的生長(zhǎng)；防止或抑制霉腐微生物在食品等物質(zhì)上的生長(zhǎng)； 化療化療(Chemotherapy)：殺死或抑制宿主體內(nèi)的病原微生物；殺死或抑制宿主體內(nèi)

32、的病原微生物； 消毒消毒(Disinfection)：殺死或滅活病原微生物（營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞）；殺死或滅活病原微生物（營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞）； 滅菌滅菌(Sterilization)：殺死包括芽胞在內(nèi)的所有微生物；殺死包括芽胞在內(nèi)的所有微生物； 生長(zhǎng)停止，但不死亡；生長(zhǎng)停止，但不死亡； 生長(zhǎng)能力不可逆喪失；生長(zhǎng)能力不可逆喪失； 二、物理滅菌因素的代表二、物理滅菌因素的代表-高溫高溫 高溫滅菌高溫滅菌 干熱滅菌法干熱滅菌法 濕熱滅菌法濕熱滅菌法 火焰灼燒法火焰灼燒法 烘箱內(nèi)熱空氣滅菌法：烘箱內(nèi)熱空氣滅菌法：150170 1 12 2小時(shí)小時(shí) 常壓常壓 加壓加壓 巴氏消毒法巴氏消毒法 煮沸消毒法：飲用水煮沸消毒法

33、：飲用水 100 幾分鐘幾分鐘 間歇消毒法：不耐熱培養(yǎng)基間歇消毒法：不耐熱培養(yǎng)基 LTH 法：法：63 30分鐘分鐘 HTST 法：法： 72 15秒秒 常規(guī)加壓滅菌法：常規(guī)加壓滅菌法：121 15分鐘分鐘 105 30分鐘分鐘 連續(xù)加壓滅菌法：發(fā)酵工廠培養(yǎng)基連續(xù)加壓滅菌法：發(fā)酵工廠培養(yǎng)基 135140 15秒秒 ，冷卻，重復(fù)，冷卻，重復(fù) UHT 法：法： 141 2秒秒 LTH：低溫維持法（：低溫維持法（low temperature holding) HTST: 高溫瞬時(shí)法（高溫瞬時(shí)法（high temperature short time) UHT: 超高溫瞬時(shí)消毒法超高溫瞬時(shí)消毒法 （

34、ultrahight temperature) The effect of temperature on the viability of a mesophilic bacterium. (a) a mesophile (b) a thermophile 影響加壓蒸氣滅菌效果的影響加壓蒸氣滅菌效果的 因素因素 滅菌物體含菌量 滅菌鍋內(nèi)空氣派出程度 滅菌對(duì)象體積 加熱與散熱速度 高溫對(duì)培養(yǎng)基影響高溫對(duì)培養(yǎng)基影響 形成沉淀 破壞營(yíng)養(yǎng)， 提高色澤(褐變） 氨基化合物和羧基化合物間復(fù)雜反應(yīng) 改變pH 防治法防治法 分別滅菌 低壓滅菌 過(guò)濾(Filtration)除菌法 輻射作用輻射作用 微波微波產(chǎn)生熱

35、來(lái)殺菌產(chǎn)生熱來(lái)殺菌 紫外線紫外線DNA損傷損傷 X射線、射線、g g射線射線氧化、自由基破壞生物大分子氧化、自由基破壞生物大分子 過(guò)濾作用：過(guò)濾作用： 微生物不能通過(guò)小孔徑濾膜微生物不能通過(guò)小孔徑濾膜 0.22 m 高滲作用：降低高滲作用：降低aW，細(xì)胞質(zhì)脫水，質(zhì)壁分離，細(xì)胞質(zhì)脫水，質(zhì)壁分離 腌制腌制 1015 鹽鹽 果脯、蜜餞果脯、蜜餞 加糖加糖5070 干燥干燥 低溫低溫 其它物理滅菌其它物理滅菌/ /抑菌方法抑菌方法 1 抗微生物劑：殺死微生物或抑制微生物生長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì)抗微生物劑：殺死微生物或抑制微生物生長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì) 人工人工/天然天然 根據(jù)根據(jù)抗微生物程度抗微生物程度分為，分為， （1

36、）抑菌劑：抑制但不能殺死）抑菌劑：抑制但不能殺死 （2）殺菌劑：殺死細(xì)胞，但不能使細(xì)胞破裂）殺菌劑：殺死細(xì)胞，但不能使細(xì)胞破裂 （3）溶菌劑：細(xì)胞裂解）溶菌劑：細(xì)胞裂解 根據(jù)根據(jù)施用對(duì)象和用途施用對(duì)象和用途分為，分為， （1）消毒劑：抑制或殺死物體表面上的微生物）消毒劑：抑制或殺死物體表面上的微生物 （2）防腐劑：防止食物腐敗或生物材料霉變，但對(duì)動(dòng)物和人體無(wú)毒害）防腐劑：防止食物腐敗或生物材料霉變，但對(duì)動(dòng)物和人體無(wú)毒害 三、控制微生物的化學(xué)物質(zhì)三、控制微生物的化學(xué)物質(zhì) 最低抑制濃度（最低抑制濃度（minimum inhibitory concentration, MIC) 半致死劑量半致死劑量

37、 （50%lethal dose, LD50) 最低致死劑量（最低致死劑量（minimum lethal dose, MLD) 對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物 （一）表面消毒劑（一）表面消毒劑 (surface disinfectant) 對(duì)一切活細(xì)胞都有毒性、不能用作活細(xì)胞或機(jī)體 內(nèi)治療用的化學(xué)藥劑。 氯消毒：游泳池消毒，自來(lái)水消毒 環(huán)氧乙烷(氣體)消毒：手術(shù)器械，毛皮 石炭酸系數(shù) (phenol coefficient, P.C.) 同同一時(shí)間內(nèi)一時(shí)間內(nèi)(10 min)被試藥劑能殺死全部供試菌（傷寒沙門氏菌）被試藥劑能殺死全部供試菌（傷寒沙門氏菌） 的最高稀釋度與達(dá)到同效的苯酚的最高稀釋度之比。的最

38、高稀釋度與達(dá)到同效的苯酚的最高稀釋度之比。 （二）抗代謝藥物（二）抗代謝藥物（antimetabolite) 代謝類似物（metabolite analogue) 具有良好的選擇毒力 作用機(jī)制 競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心 如如磺胺磺胺 假冒，合成出假產(chǎn)物 如如8-8-重氮鳥(niǎo)嘌呤取代鳥(niǎo)嘌呤，產(chǎn)生無(wú)正常功能重氮鳥(niǎo)嘌呤取代鳥(niǎo)嘌呤，產(chǎn)生無(wú)正常功能RNARNA 類似于終產(chǎn)物，利用反饋調(diào)節(jié)破壞正常調(diào)節(jié)機(jī)制 如如6-6-巰基腺嘌呤，抑制腺嘌呤核苷酸合成巰基腺嘌呤，抑制腺嘌呤核苷酸合成 磺胺的作用機(jī)理磺胺的作用機(jī)理 磺胺是葉酸組成部分磺胺是葉酸組成部分-對(duì)氨基苯甲酸對(duì)氨基苯甲酸(PABA)的結(jié)構(gòu)類似物的結(jié)構(gòu)類似物 磺胺

39、磺胺葉酸葉酸 PABA 磺胺的抑菌作用是因?yàn)楹芏嗉?xì)菌需要自己合成葉酸而生長(zhǎng)?；前返囊志饔檬且?yàn)楹芏嗉?xì)菌需要自己合成葉酸而生長(zhǎng)。 磺胺對(duì)人體細(xì)胞無(wú)毒性，因?yàn)槿巳狈膶?duì)氨基苯甲酸合成葉磺胺對(duì)人體細(xì)胞無(wú)毒性，因?yàn)槿巳狈膶?duì)氨基苯甲酸合成葉 酸的相關(guān)酶酸的相關(guān)酶-二氫葉酸合成酶二氫葉酸合成酶，不能用外界提供的對(duì)氨基苯，不能用外界提供的對(duì)氨基苯 甲酸自行合成葉酸，甲酸自行合成葉酸，而必須直接利用葉酸為生長(zhǎng)因子進(jìn)行生長(zhǎng)。而必須直接利用葉酸為生長(zhǎng)因子進(jìn)行生長(zhǎng)。 Alexander Fleming (1929) and penicillin （三）（三） 抗生素（抗生素（antibiotics)antibiotics) 次級(jí)代謝產(chǎn)物或人工衍生物次級(jí)代謝產(chǎn)物或人工衍生物 抗生素抗生素(antibiotics)：次級(jí)代謝產(chǎn)物或衍生物：次級(jí)代謝產(chǎn)物或衍生物 - 找到找到1萬(wàn)種以上，合成萬(wàn)種以上，合成7萬(wàn)多種半合成抗生素，臨床常用五六十種萬(wàn)多種半合成抗生素，臨床常用五六十種 （1）抑制細(xì)胞壁合成：）抑制細(xì)胞壁合成： 青霉素（青霉素（peniciline)、頭孢菌素（、頭孢菌素（cephalosporin)、