愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在自動生化分析儀上的應用課件

1、愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 1 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 2 n免疫比濁回顧 n免疫膠乳濁度分析（immunolatex turbidimetry） n在生化分析儀上進行測定的有關問題 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 3 免疫檢測的基礎 抗原抗體間的特異性反應抗原抗體間的特異性反應 手工操作 自動化分析 核心核心基礎基礎 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 4 n免疫比濁技術是在免疫沉淀反應（Precipitation）檢測 法的基礎上建立的。 n最早應用的免疫沉淀反應是Ouchterlony

2、在1948年建立 的瓊脂雙向擴散法。 n1965年Mancini等和Fahey等分別建立了可以定量的單 向（輻射狀）免疫擴散技術。 nLaurell等1966年建立了電免疫擴散法，使報告結果的 時間由單向免疫擴散法的24h縮短到4-5h。 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 5 n經典的免疫沉淀試驗通常是在抗原與相應抗體反應的 終點判定結果，存在費時、操作繁瑣、敏感度低（10 100mg/L）、不能自動化等缺陷。 n根據(jù)沉淀反應時，抗原抗體結合后可使反應系統(tǒng)透光 度發(fā)生改變，建立了以測定透光度為特征的微量免疫 沉淀測定法法，既免疫濁度測定技術。 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析

3、在 自動生化分析儀上的應用 6 n1967年由Richie首次報告，20世紀70年代逐步完善， 80年代初期初步應用臨床常規(guī)檢查。 n抗原抗體在液相（特殊的緩沖液）中快速結合，形成 抗原抗體復合物，反應液出現(xiàn)濁度。 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 7 n液相中抗原與抗體的反應結果與兩者的濃度比例有關。 抗原或抗體顯著過量時，都只能生成少量的可溶性免疫 復合物，分子極小，不適于免疫比濁法檢測。 n免疫比濁技術要求溶液中抗體要保持中等過量，此時免 疫復合物（immunecomplex，IC）仍是可溶性的。 n在這種情況下，抗原與抗體的反應遵循質量作用定律（ Ag+AbAg.

4、Ab），形成IC的量是抗原或抗體的函數(shù)。 n當抗體固定時，IC的量與抗原的量成正比。 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 8 LIGHT SOURCE FILTER REACTION CUVETTE TURBIDIMETRIC DETECTOR NEPHELOMETRIC DETECTOR ICIC 散射比濁、透射比濁 光路圖 透射光透射光+ +散射光散射光 散散 光光 射射 平光線平光線 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 9 n目前，國內開展的各項免疫檢驗，均求使用國家食 品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）準入和批準的儀器和試 劑。這樣做不僅能使各項檢查更

5、加統(tǒng)一，規(guī)范，各 實驗室之間檢查結果更具可比性，而且也可避免很 多不必要的醫(yī)療糾紛。 n免疫比濁技術中散射比濁法目前均用獲國家食品藥 品監(jiān)督管理局（SFDA）批準進口的自動化分析儀器 和配套的各種檢測項目的專用試劑。 n透射比濁法（生化分析儀）可用國產試劑。 全國臨床檢驗操作規(guī)程 第3版 透射還是散射 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 10 n散射比濁 專用儀器 專用配套試劑 原裝進口試劑昂貴 n透射比濁 生化分析儀 開放試劑 （可用國產試劑） 速率法和終點法測定； 速率法的靈敏度和特異性優(yōu)于終點法；終點法 的穩(wěn)定性較好； 透射還是散射 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自

6、動生化分析儀上的應用 11 n目前，由于技術的發(fā)展，兩種比濁法的靈敏度和特異 性已接近，而全自動生化儀的自動化程度和精密度要 勝于專用散射比濁儀，透射免疫比濁法在臨床上的應 用日益廣泛。生化分析儀通過免疫比濁法技術，架起 了現(xiàn)代生化檢驗和現(xiàn)代免疫技術的橋梁。 n免疫化學是免疫學技術和生物化學技術的結合。既具 有免疫學抗原抗體結合的特異性，又具有生物化學反 應動力學特點。 透射還是散射 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 12 n可溶性抗原與其特異性抗體，在一定緩沖液中形成的 復合物，經一段時間聚合后出現(xiàn)濁度，人射光在滲過 反應液時，由于溶液內IC粒子對光線的反射和吸收， 引

7、起透射光減少，可用吸光度A表示。 n用已知濃度的標準參考品建立標準曲線，測出待測抗 原的含量。 n透射比濁法主要用于生化分析儀。 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 13 n免疫復合物直徑為35lOOnm，這一范圍要求近紫外光處 入射光發(fā)出最大的干擾(最大吸收峰)，選擇290410nm 波長測定最佳。 n由于抗原抗體結合后在短時間內(19s)形成 可見的復合物，才能進行比濁。 n為了提高復合物形成速度，加入促聚劑，如4聚乙二醇 (MW：60008000)，可使復合物形成在310min完成。 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 14 n比濁法中，少量的小的

8、抗原抗體復合物極難形成 濁度，除非放置較長時間；如形成較大的復合物 ，則抗原和抗體用量也較大，顯然不符合微量化 的要求。 n為解決快速反應及微量化的要求，建立了免疫膠 乳濁度法（immunolatex turbidimetry）。 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 15 n其基本原理是： v將特異性抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒 上，當遇到相應抗原時，則使膠乳顆粒發(fā)生凝集。 v單個膠乳顆粒在入射光波之內，不阻礙光線透過；兩 個或兩個以上膠乳顆粒凝聚時則使透過光減少。 v免疫微球凝聚的程度為被測物濃度的函數(shù)，由此可測 出標本中待測物的含量。 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度

9、分析在 自動生化分析儀上的應用 16 (a)帶抗體的膠乳在帶抗體的膠乳在1個波長之內可透過光線個波長之內可透過光線 (b)結合后，則形成光線衰減結合后，則形成光線衰減 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 17 該技術的關鍵在于兩個方面： n首先是選擇適用的膠乳，其大?。ㄖ睆剑┮孕∮?波長。用500nm波長者，選擇100nm顆粒較適合；用 585nm波長者，則選用100200nm顆粒為好。目前多 用200nm的膠乳顆粒。 n其次，膠乳與抗體結合時用化學交聯(lián)雖好，但失活 也較嚴重；一般用吸附法即可。 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 18 愛愛醫(yī)資源-免

10、疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 19 n膠乳顆粒多為惰性微球和羧基化微球 n氨基化高分子納米微球 氨基化納米微球的顆粒大小較傳統(tǒng)的微球更?。s 0.1m），它與抗體的結合是通過其表面的氨基與抗 體的氨基端共價結合，在微球與抗體之間有一個橋聯(lián) 化學臂，降低了位阻效應，不僅提高了抗體的結合率 ，而且還為抗體提供合適的三維空間立體結構，有效 地保護了抗體與抗原結合的活性區(qū)域。 與采用惰性納米微球的傳統(tǒng)技術相比，檢測的靈敏度 得到了極大的改善，最高可達到1.0ng/ml。 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 20 （1）操作簡單，可在幾分鐘內快速、準確地檢測血清 蛋白含量

11、，真實反映病情進展和評估治療效果，對 于疾病的早期診斷和治療具有重要的臨床意義； （2）不易受人為操作和外界因素干擾，檢測穩(wěn)定性和 重復性都很好； （3）能利用普通的生化分析儀進行檢測，容易實現(xiàn)自 動化，可在各級基層醫(yī)療機構普及和應用。 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 21 n膠乳比濁分析 n顆粒增強透射免疫比濁法 （particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA） n膠乳增強免疫濁度測定 （Latex enhanced turbidimetric immunoassay , LETIA ） n粒子強化免疫濁度測定

12、愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 22 serum proteins 血清蛋白類 IgA（免疫球蛋白A） IgG（免疫球蛋白G） IgM（免疫球蛋白M） IgE（免疫球蛋白E） C3（補體C3） C4（補體C4） Microalbumin （微量白蛋白） 2-microglobulin （ 2球蛋白） -1- acid glycoprotein （ -1酸性糖蛋白） Ferritin（鐵蛋白） Transferrin（轉鐵蛋白） 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 23 心血管疾病監(jiān)測 Apo A-1（載脂蛋白A1） Apo B（載脂蛋白B） Lp(a

13、)（脂蛋白a） h-CRP(超敏感C反應蛋白） Homocysteine （同型半胱氨酸） D-Dimer（D二聚體） Myoglobin（肌紅蛋白） cTnI（肌鈣蛋白I） 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 24 Rheuma 風濕病 RF（類風濕因子） ASO（抗鏈O） CRP（C-反應蛋白） 腎小球過濾率最敏感的 指標 cystatin C （胱抑素C ） 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 25 TDM治療藥物監(jiān)測 Phenobarbital （苯巴比妥） Phenytoin（苯妥英納） Valproic acid（丙戊酸） Carbamaze

14、pine （卡馬西平） Theophylline（茶堿） Gentamicin（慶大霉素） Digoxin（地高辛） Digitoxin（洋地黃） Vitamins維生素 Vitamin B12 （維生素B12） Folate（葉酸） infectious Diseases 傳染性疾病 TOXO（弓形體） RUBELLA（風疹病毒） 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 26 R1（試劑試劑 I）: 緩沖液緩沖液 R2（試劑試劑 II）: 啟動試劑啟動試劑 ( (帶或不帶乳膠顆粒帶或不帶乳膠顆粒) ) STANDARDS（標準液標準液） ( (一點或多點標準一點或多點標準)

15、) CONTROLS（質控液質控液） 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 27 免疫比濁法試劑的組成免疫比濁法試劑的組成 R R1 1緩沖液緩沖液 R R2 2啟動試劑啟動試劑 校準血清校準血清 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 28 反應類型（不需要乳膠） Ag Ab (Reagent) 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 29 反應類型（需要乳膠） LATEX PARTICLE Ag 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 30 緩沖液: 使反應有最大限度的敏感性使反應有最大限度的敏感性 避免非特異的結果避免非特

16、異的結果 降低反應時間降低反應時間 啟動試劑: 產生抗原產生抗原-抗體反應抗體反應 標準液: 建立濃度與信號（吸光度）之間的關系建立濃度與信號（吸光度）之間的關系 質控液: 檢查定標的情況檢查定標的情況 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 31 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 32 nCRM 歐共體參考局（ BCR ）的認可參考品。 nCRM470是14種（血清）蛋白分析物的參考制品。 nCRM470基于人血清（人血清蛋白參考制備物 lot 5 ，RPPHS lot 5）的Certified Reference Material n由以下組織共同發(fā)展

17、： IFCC BCR Brussels CAP USA 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 33 nCRM 470在歐洲由BCR制備提供。在美國則由美國 病理協(xié)會（CAP）提供材料。 n生產廠家用CRM470對自己的定標液和質控液進行 標化。 nCRM和SRM（Standard Reference Material標準參 考材料）可以認為是目前可以提供的最高質量的材 料。SRM主要用于USA（國家標準和技術研究院 NIST）。 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 34 CRM470參考物及其參考范圍 血漿蛋白質每個CRM470的參考范圍（g/L） 白蛋白

18、3552 -1-抗胰蛋白酶0.92.0 （-1-抗胰蛋白酶抑制劑） C3C-補體0.91.8 C4-補體0.10.4 銅蘭蛋白0.20.6 C-反應蛋白（CRP）0.005 -1-酸性糖蛋白（類粘蛋白）0.51.2 觸珠蛋白0.32.0 IgA0.74.0 IgG716 IgM0.42.3 -2-巨球蛋白1.33.0 前白蛋白（transthyretin）0.20.4 轉鐵蛋白2.03.6 注：C3C在新鮮樣本中可期望較低的參考范圍 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 35 v對實驗室的生化分析儀盡可能充分的掌握并理對實驗室的生化分析儀盡可能充分的掌握并理 解。解。 v理解

19、各個檢測項目的方法學原理。理解各個檢測項目的方法學原理。 v仔細認真閱讀商品化試劑的說明書。仔細認真閱讀商品化試劑的說明書。 v銷售商或者廠家技術部門的支持。銷售商或者廠家技術部門的支持。 “所謂生化分析儀就是將實驗參數(shù)輸入儀器，由儀 器按照試驗指令來完成整個試驗。參數(shù)設置，基本 功在儀器之外，如果對分析化學、對酶動力學、儀 器性能沒有一定的掌握，是很難設置好參數(shù)的?！?愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 36 免疫濁度法在生化分析儀上常見的測定（分析）方式 FINAL POINT D FINAL - SAMPLE BLANK D - A FINAL - INITIAL D

20、 - B KINETIC (C - B)/ time R2 (LATEX OR ANTISERA) SAMPLE AND R1 (BUFFER) TIME OD increment 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 37 測定CRP分析方式 采用雙試劑、兩步終點法采用雙試劑、兩步終點法 37 5min 37 5min A1A2 Sample en R1R2 R1R2 End 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 38 Heidelberger & Kendall Experience Excess antibody zone Equivalence zo

21、neExcess antigen zone Antigen concentration TURBIDITY ( OD ) （useful zone） A B C 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 39 n依據(jù)抗原抗體反應特性，免疫比濁測量選擇在A區(qū)， IC的濁度隨著抗原的增加而增加，但不是呈線性的對 應關系（曲線往往有截距或呈S形），要得到正確的 結果，必須做一個多點定標的標準曲線。 n自動生化分析儀多推薦5點或6點定標，然后選擇適當 的數(shù)學模型作曲線擬合，如：Logit-Log變換； y=d+cx+bx2+ax3 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用

22、40 多點定標：RF、CRP REAL RELATION AND CURVE OF CALIBRATION STRAIGHT LINE CALIBRATION (THERE IS AN ERROR) concentration OD increment 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 41 CONCENTRATION OD increment REAL RELATION STRAIGHT LINE CALIBRATION 一點定標：例如ASO 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 42 校準曲線的選擇和擬合效果檢驗： v選擇何種校準曲線作數(shù)據(jù)處理，是試驗成功的關鍵 之一。 v一般用試劑廠家提供的或文獻介紹的校準模式。 v應該對擬合曲線作檢驗和比較。 愛愛醫(yī)資源-免疫膠乳濁度分析在 自動生化分析儀上的應用 43 n抗原或抗體過剩使免疫復合物部分或全部解離的現(xiàn) 象，稱為帶現(xiàn)象。 n免疫濁