細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)診斷

1、實(shí)驗(yàn)診斷的目的與要求實(shí)驗(yàn)診斷的目的與要求 l進(jìn)行病原學(xué)診斷進(jìn)行病原學(xué)診斷 l進(jìn)行藥敏試驗(yàn)進(jìn)行藥敏試驗(yàn),指導(dǎo)合理用藥指導(dǎo)合理用藥 l用作流行病學(xué)調(diào)查用作流行病學(xué)調(diào)查, 追蹤傳染源追蹤傳染源 l研究病原生物與感染的關(guān)系研究病原生物與感染的關(guān)系 l時(shí)間：時(shí)間：1992年年9月月 l發(fā)?。喊l(fā)病：26名名 l死亡：死亡：10名名 l地點(diǎn)：某嬰兒室地點(diǎn)：某嬰兒室 l傳染源：慢性攜帶者產(chǎn)婦傳染源：慢性攜帶者產(chǎn)婦 l傳播方式：通過(guò)污染操作臺(tái)接觸傳播方式：通過(guò)污染操作臺(tái)接觸 l時(shí)間：時(shí)間：1991年年11月月 l地點(diǎn)：某嬰兒室地點(diǎn)：某嬰兒室 l發(fā)?。喊l(fā)?。?5名名 l 死亡：死亡：23名名 l 56件物品（被褥

2、，尿布，奶瓶）中件物品（被褥，尿布，奶瓶）中26件件 檢出鼠傷寒沙門(mén)菌檢出鼠傷寒沙門(mén)菌 l有價(jià)值的有價(jià)值的 l快速簡(jiǎn)便的快速簡(jiǎn)便的 l特異性和敏感性高的特異性和敏感性高的 查病原體查病原體:直接涂片直接涂片 分離分離,對(duì)純培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定對(duì)純培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定 查可溶性抗原查可溶性抗原: 用已知抗體用已知抗體 查查DNA:分子生物學(xué)方法分子生物學(xué)方法 查抗體查抗體: 用已知抗原用已知抗原 IgM IgG: 效價(jià)有效價(jià)有4倍以上增高倍以上增高 l雙歧檢索雙歧檢索: 以某一試驗(yàn)分以某一試驗(yàn)分 l表解表解: 用多種試驗(yàn)整體分析用多種試驗(yàn)整體分析 l數(shù)字編碼數(shù)字編碼: 將多種試驗(yàn)分別編碼將多種試驗(yàn)分別編碼,

3、 數(shù)字化后查表數(shù)字化后查表 革蘭氏陰性桿菌革蘭氏陰性桿菌 葡萄糖發(fā)酵葡萄糖發(fā)酵 + - 氧化酶氧化酶 + - 弧菌弧菌 腸桿菌腸桿菌 非發(fā)酵菌非發(fā)酵菌 A B C D E 甲甲 乙乙 丙丙 丁丁 + + - - + + + + - - - - + + - - + - + + 組別組別 試驗(yàn)試驗(yàn) 代碼代碼 結(jié)果結(jié)果 結(jié)果代碼結(jié)果代碼 總值總值 1 A 4 - 0 1 B 2 - 0 C 1 + 1 2 D 4 + 4 5 E 2 - 0 F 1 + 1 15 l 各試驗(yàn)孔含不同試驗(yàn)的脫水底物各試驗(yàn)孔含不同試驗(yàn)的脫水底物 l 加入純化的被檢菌加入純化的被檢菌 l 孵育孵育4-24h觀察結(jié)果觀察結(jié)果

4、 l 人工讀取根據(jù)編碼資料判定菌種或人工讀取根據(jù)編碼資料判定菌種或 電腦讀取電腦讀取 臨床標(biāo)本的采集與處理臨床標(biāo)本的采集與處理 l早期早期,用抗菌藥物前用抗菌藥物前 l根據(jù)病原體存在的部位采集相應(yīng)標(biāo)根據(jù)病原體存在的部位采集相應(yīng)標(biāo) 本本 l無(wú)菌技術(shù)無(wú)菌技術(shù),避免正常菌群污染避免正常菌群污染,防止病防止病 原體播散原體播散 l采用合適的方法采用合適的方法 l盡快接種到合適的培養(yǎng)基上盡快接種到合適的培養(yǎng)基上 l根據(jù)抵抗力選擇保存和運(yùn)輸條件根據(jù)抵抗力選擇保存和運(yùn)輸條件 厭氧菌厭氧菌 奈瑟菌奈瑟菌 病毒病毒 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查 l用懸滴法或壓片用懸滴法或壓片 l細(xì)菌是活的細(xì)菌是活的,可觀察

5、運(yùn)動(dòng)可觀察運(yùn)動(dòng) l加入特異抗體可抑制其運(yùn)動(dòng)加入特異抗體可抑制其運(yùn)動(dòng) l結(jié)合標(biāo)本來(lái)源可作初步診斷結(jié)合標(biāo)本來(lái)源可作初步診斷,如霍亂如霍亂, 梅毒梅毒 l用相差或暗視野顯微鏡效果更好用相差或暗視野顯微鏡效果更好 壓片壓片 懸滴法懸滴法 l革蘭染色革蘭染色(Gram stain):紫色革蘭陽(yáng)性紫色革蘭陽(yáng)性;紅紅 色革蘭陰性色革蘭陰性. 注意細(xì)菌的大小注意細(xì)菌的大小,形狀形狀,排列排列 以及著色的均一性以及著色的均一性 l抗酸染色抗酸染色(acid-fast stain):紅色抗酸陽(yáng)性紅色抗酸陽(yáng)性, 藍(lán)色抗酸陰性藍(lán)色抗酸陰性 l熒光染色熒光染色:更易觀察更易觀察 特殊染色可用于觀察莢膜特殊染色可用于觀察

6、莢膜, 鞭毛等鞭毛等 細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu) 細(xì)菌的分離培養(yǎng)細(xì)菌的分離培養(yǎng) 培養(yǎng)基培養(yǎng)基:營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),pH7.4 氣體氣體: 需氧菌需氧菌, 厭氧菌厭氧菌, 兼性厭氧兼性厭氧 菌菌,微需氧菌微需氧菌 溫度溫度: 一般一般37C 時(shí)間時(shí)間: 一般一般1824h 1.對(duì)對(duì)培養(yǎng)基的基本要求培養(yǎng)基的基本要求 l足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) l合適的合適的pH l無(wú)菌無(wú)菌 l澄清澄清 l按培養(yǎng)基成分分按培養(yǎng)基成分分: 基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基: 滿足一般細(xì)菌要求滿足一般細(xì)菌要求 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基: 滿足苛求細(xì)菌要求滿足苛求細(xì)菌要求 鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基: 加有被利用物和指示劑加有被利用物和指

7、示劑 選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基: 加有抑制劑加有抑制劑,能抑制非目的菌能抑制非目的菌 生長(zhǎng)生長(zhǎng) 特殊培養(yǎng)基特殊培養(yǎng)基: 滿足特殊細(xì)菌要求滿足特殊細(xì)菌要求 l按培養(yǎng)基物理性狀分按培養(yǎng)基物理性狀分: 液體液體:增菌增菌 固體固體:加加2%瓊脂瓊脂,平板用于分離純種平板用于分離純種, 斜面用于傳代或保存細(xì)菌斜面用于傳代或保存細(xì)菌 半固體半固體:加加0.5%瓊脂瓊脂,用于觀察動(dòng)力用于觀察動(dòng)力, 保存菌種保存菌種 l分區(qū)劃線法分區(qū)劃線法:用于分離純種用于分離純種,多次燒灼減少菌多次燒灼減少菌 數(shù)數(shù),以獲取單個(gè)菌落以獲取單個(gè)菌落 l連續(xù)劃線連續(xù)劃線:不要求單個(gè)菌落不要求單個(gè)菌落,用于保存或繁殖用于保存或繁殖

8、細(xì)菌細(xì)菌 l涂布涂布:使細(xì)菌長(zhǎng)成菌苔使細(xì)菌長(zhǎng)成菌苔,可觀察細(xì)菌被抑制情可觀察細(xì)菌被抑制情 況或用于繁殖細(xì)菌況或用于繁殖細(xì)菌 l傾注平板傾注平板:少量細(xì)菌混于瓊脂中倒板少量細(xì)菌混于瓊脂中倒板,計(jì)數(shù)計(jì)數(shù), 分離純種分離純種 固體基固體基: 菌落形成菌落形成,注意其注意其 大小大小, 形狀形狀 表面表面, 邊緣邊緣 質(zhì)地質(zhì)地, 透明度透明度 溶血情況溶血情況 液體基液體基: 渾濁渾濁,菌膜菌膜,沉淀沉淀 l純種是細(xì)菌學(xué)工作的基礎(chǔ)純種是細(xì)菌學(xué)工作的基礎(chǔ) l獲得方法獲得方法: 劃線分離法劃線分離法(傾注平傾注平 板法板法)獲得大的單個(gè)菌落獲得大的單個(gè)菌落 斜面斜面 純培養(yǎng)物純培養(yǎng)物 l純培養(yǎng)物的外觀表現(xiàn)

9、應(yīng)是一致的純培養(yǎng)物的外觀表現(xiàn)應(yīng)是一致的 l確定有無(wú)細(xì)菌確定有無(wú)細(xì)菌 l鑒定細(xì)菌鑒定細(xì)菌 l藥敏試驗(yàn)藥敏試驗(yàn) l計(jì)數(shù)細(xì)菌計(jì)數(shù)細(xì)菌 l利用細(xì)菌利用細(xì)菌:制備菌苗制備菌苗,生產(chǎn)抗生素或基生產(chǎn)抗生素或基 因工程產(chǎn)品因工程產(chǎn)品 l細(xì)菌代謝產(chǎn)物的檢測(cè)細(xì)菌代謝產(chǎn)物的檢測(cè) l內(nèi)毒素內(nèi)毒素:致熱作用致熱作用:兔體溫兔體溫 鱟試驗(yàn)鱟試驗(yàn) l外毒素外毒素:體內(nèi)體內(nèi):毒素與抗毒素的中和試驗(yàn)毒素與抗毒素的中和試驗(yàn) 體外體外:Elek平板法平板法:沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) ELISA 毒素和抗毒素的中和試驗(yàn)毒素和抗毒素的中和試驗(yàn) 外毒素外毒素 ? 外毒素外毒素?+已知抗體已知抗體 小白鼠小白鼠 小白鼠小白鼠 結(jié)果結(jié)果 發(fā)病發(fā)病

10、發(fā)病發(fā)病 有毒性有毒性,但不是但不是 相相 應(yīng)的應(yīng)的 發(fā)病發(fā)病 不發(fā)病不發(fā)病 是相應(yīng)毒素是相應(yīng)毒素 不發(fā)病不發(fā)病 不發(fā)病不發(fā)病 無(wú)毒性無(wú)毒性 抗毒素抗毒素 待測(cè)細(xì)菌待測(cè)細(xì)菌 沉淀線沉淀線 Elek 試驗(yàn)試驗(yàn) 欲檢測(cè)細(xì)菌的生化反應(yīng)欲檢測(cè)細(xì)菌的生化反應(yīng), 一一 般是在合適的培養(yǎng)基中加入被測(cè)般是在合適的培養(yǎng)基中加入被測(cè) 物和檢測(cè)其代謝產(chǎn)物的試劑物和檢測(cè)其代謝產(chǎn)物的試劑, 即即 在鑒別培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)在鑒別培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng), 或直或直 接加試劑于培養(yǎng)物中接加試劑于培養(yǎng)物中, 觀察呈色觀察呈色 等現(xiàn)象判定結(jié)果等現(xiàn)象判定結(jié)果 l糖糖(醇醇)發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)酵試驗(yàn):酸酸,氣體氣體 l氧化氧化-發(fā)酵發(fā)酵(O/F)試

11、驗(yàn)試驗(yàn): l-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(ONPG)試驗(yàn)試驗(yàn) l七葉苷水解試驗(yàn)七葉苷水解試驗(yàn) l甲基紅試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn) lV-P試驗(yàn)試驗(yàn) l明膠液化試驗(yàn)明膠液化試驗(yàn) lIndol試驗(yàn)試驗(yàn) lUra試驗(yàn)試驗(yàn) lH2S試驗(yàn)試驗(yàn) l苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn) l氨基酸脫羧酶試驗(yàn)氨基酸脫羧酶試驗(yàn) l枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn) l丙二酸鹽利用試驗(yàn)丙二酸鹽利用試驗(yàn) 枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn) l氧化酶試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn) l過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn) l硝酸鹽還原試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn) l卵磷脂酶試驗(yàn)卵磷脂酶試驗(yàn) l凝固酶試驗(yàn)?zāi)堂冈囼?yàn) lCAMP試驗(yàn)試驗(yàn) l膽汁溶菌試驗(yàn)?zāi)懼芫囼?yàn) lO/129試

12、驗(yàn)試驗(yàn) l桿菌肽試驗(yàn)桿菌肽試驗(yàn) lOptochin試驗(yàn)試驗(yàn) 感染的血清學(xué)檢測(cè)感染的血清學(xué)檢測(cè) l已知抗體檢測(cè)細(xì)菌的抗原用于鑒定已知抗體檢測(cè)細(xì)菌的抗原用于鑒定 細(xì)菌細(xì)菌 l已知抗原檢測(cè)病人血清中的抗體已知抗原檢測(cè)病人血清中的抗體 用于診斷感染性疾病用于診斷感染性疾病 l了解微生物的抗原結(jié)構(gòu)了解微生物的抗原結(jié)構(gòu) l 用已知抗體檢測(cè)細(xì)菌的抗原組合用已知抗體檢測(cè)細(xì)菌的抗原組合 l 特異性較高特異性較高 l 多在鑒定的最后進(jìn)行多在鑒定的最后進(jìn)行 l 可用多種血清學(xué)方法可用多種血清學(xué)方法,細(xì)菌多細(xì)菌多用凝集用凝集 反應(yīng)反應(yīng),病毒多用中和試驗(yàn)病毒多用中和試驗(yàn) l查抗體查抗體: 用已知抗原用已知抗原 IgM:

13、 感染的指標(biāo)感染的指標(biāo) IgG: 效價(jià)有效價(jià)有4倍以上增高或倍以上增高或 高于當(dāng)?shù)厝巳核礁哂诋?dāng)?shù)厝巳核?l多用于病程較長(zhǎng)的全身性感染多用于病程較長(zhǎng)的全身性感染 感染的分子生物學(xué)檢測(cè)感染的分子生物學(xué)檢測(cè) 檢出病原體檢出病原體DNA證明病原體存在證明病原體存在 l細(xì)菌分類(lèi)細(xì)菌分類(lèi) l臨床診斷臨床診斷,快速鑒定快速鑒定 l耐藥性檢測(cè)耐藥性檢測(cè) l毒素檢測(cè)毒素檢測(cè) l流行病學(xué)調(diào)查流行病學(xué)調(diào)查 l G+C mol% PCR l 限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度 l 核酸雜交核酸雜交 l限制性內(nèi)切酶是能夠在一定部位切限制性內(nèi)切酶是能夠在一定部位切 開(kāi)開(kāi)DNADNA的酶的酶 l同樣的內(nèi)切酶可將相

14、同的同樣的內(nèi)切酶可將相同的DNADNA切成同切成同 樣數(shù)目的，同樣大小分子量的片段樣數(shù)目的，同樣大小分子量的片段 l電泳后對(duì)所得圖譜進(jìn)行分析可判斷電泳后對(duì)所得圖譜進(jìn)行分析可判斷 DNADNA是否相同是否相同 1989年國(guó)外某醫(yī)院泌尿科年國(guó)外某醫(yī)院泌尿科3 周內(nèi)從病人血，尿中分出周內(nèi)從病人血，尿中分出8株不株不 動(dòng)桿菌，具有相同的耐藥性，經(jīng)動(dòng)桿菌，具有相同的耐藥性，經(jīng) Smal I 酶切后出現(xiàn)相同片段，但酶切后出現(xiàn)相同片段，但 與環(huán)境中或其他科室分出的不動(dòng)與環(huán)境中或其他科室分出的不動(dòng) 桿菌不同，表明泌尿科的病人是桿菌不同，表明泌尿科的病人是 由同一克隆引起的爆發(fā)由同一克隆引起的爆發(fā) 某醫(yī)院某醫(yī)院

15、ICU病房，從水病房，從水 池和病人標(biāo)本中分出多株銅池和病人標(biāo)本中分出多株銅 綠假單胞菌，將其染色體綠假單胞菌，將其染色體 DNA用用X Bal 酶切，發(fā)現(xiàn)彼此酶切，發(fā)現(xiàn)彼此 之間沒(méi)有共同的酶切片段圖之間沒(méi)有共同的酶切片段圖 譜，病人之間圖譜的也不相譜，病人之間圖譜的也不相 同，說(shuō)明這不是一次爆發(fā)同，說(shuō)明這不是一次爆發(fā) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn) l 分離細(xì)菌分離細(xì)菌, 獲取純種獲取純種 l 檢測(cè)其致病性檢測(cè)其致病性, 觀察發(fā)病或死亡觀察發(fā)病或死亡,可同時(shí)可同時(shí) 加抗體進(jìn)行中和試驗(yàn)或保護(hù)試驗(yàn)加抗體進(jìn)行中和試驗(yàn)或保護(hù)試驗(yàn) l 制備抗體制備抗體 l 誘導(dǎo)變異誘導(dǎo)變異 l 建立感染模型建立感染模型 l 檢測(cè)生

16、物制品的安全性檢測(cè)生物制品的安全性 l多用易感的小動(dòng)物多用易感的小動(dòng)物, 如小白鼠如小白鼠, 豚鼠豚鼠 l按需要選擇按需要選擇 純系純系,突變系突變系,雜種雜種 無(wú)菌動(dòng)物無(wú)菌動(dòng)物(GF), 悉生動(dòng)物悉生動(dòng)物(GB), 無(wú)特?zé)o特 殊病原體動(dòng)物殊病原體動(dòng)物(SPF), 最低限度疾病動(dòng)物最低限度疾病動(dòng)物 (MDA), 普通動(dòng)物普通動(dòng)物 l可選用多種途徑注射可選用多種途徑注射,如腹腔如腹腔,靜脈靜脈,皮下皮下, 顱內(nèi)等顱內(nèi)等 l形態(tài)形態(tài): 個(gè)體個(gè)體, 菌落菌落, 液體基生長(zhǎng)情況液體基生長(zhǎng)情況 l生長(zhǎng)需要生長(zhǎng)需要:氧氧,溫度溫度,營(yíng)養(yǎng)物營(yíng)養(yǎng)物 l生化反應(yīng)生化反應(yīng): 觀察其酶活性觀察其酶活性 l抗原性抗原

17、性: 用已知抗體用已知抗體 l致病性致病性: 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn) l核酸核酸: PCR, 酶切片段長(zhǎng)度酶切片段長(zhǎng)度, 雜交雜交 l界界_門(mén)門(mén)_綱綱_目目_科科_屬屬_種種 l種是具有相同生物學(xué)特性的生物種是具有相同生物學(xué)特性的生物 聚合群聚合群 l型：生化型，血清型，噬菌體型型：生化型，血清型，噬菌體型 l株：不同來(lái)源株：不同來(lái)源 l雙命名：金黃色葡萄球菌雙命名：金黃色葡萄球菌 staphylococcus aureous staphylococcus sp(spp) l分離培養(yǎng)出病原體分離培養(yǎng)出病原體 l患者血清病原體抗體有四倍以上患者血清病原體抗體有四倍以上 增高增高 l能復(fù)制出動(dòng)物模型能復(fù)

18、制出動(dòng)物模型 l時(shí)間：時(shí)間：1992年年9月月 l發(fā)?。喊l(fā)?。?6名名 l死亡：死亡：10名名 l地點(diǎn)：某嬰兒室地點(diǎn)：某嬰兒室 l傳染源：慢性攜帶者產(chǎn)婦傳染源：慢性攜帶者產(chǎn)婦 l傳播方式：通過(guò)污染操作臺(tái)接觸傳播方式：通過(guò)污染操作臺(tái)接觸 l有價(jià)值的有價(jià)值的 l快速簡(jiǎn)便的快速簡(jiǎn)便的 l特異性和敏感性高的特異性和敏感性高的 l早期早期,用抗菌藥物前用抗菌藥物前 l根據(jù)病原體存在的部位采集相應(yīng)標(biāo)根據(jù)病原體存在的部位采集相應(yīng)標(biāo) 本本 l無(wú)菌技術(shù)無(wú)菌技術(shù),避免正常菌群污染避免正常菌群污染,防止病防止病 原體播散原體播散 l采用合適的方法采用合適的方法 l用懸滴法或壓片用懸滴法或壓片 l細(xì)菌是活的細(xì)菌是活的,可觀察運(yùn)動(dòng)可觀察運(yùn)動(dòng) l加入特異抗體可抑制其運(yùn)動(dòng)加入特異抗體可抑制其運(yùn)動(dòng) l結(jié)合標(biāo)本來(lái)源可作初步診斷結(jié)合標(biāo)本來(lái)源可作初步診斷,如霍亂如霍亂, 梅毒梅毒 l用相差或暗視野顯微鏡效果更好用相差或暗視野顯微鏡效果更好 固體基固體基: 菌落形成菌落形成,注意其注意其 大小大小,