修改后的梅毒SOP

1、岳陽(yáng)廣濟(jì)醫(yī)院免疫室操作手冊(cè)文件名稱梅毒螺旋體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編 碼GJYYJYK頁(yè) 數(shù)33頁(yè)實(shí)施日期制訂人王文君審核人周楚紅批準(zhǔn)人20140516制訂日期2014-05審核日期2014-05批準(zhǔn)日期2014目的：規(guī)范的梅毒螺旋體檢驗(yàn)操作，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。適用范圍：免疫室工作人員責(zé)任人：實(shí)驗(yàn)操作者1、標(biāo)本的采集與處理1.1標(biāo)本采集的基本要求1.1.1操作應(yīng)規(guī)范化。1.1.2所有標(biāo)本都應(yīng)當(dāng)被視為具有傳染性，醫(yī)務(wù)人員應(yīng)戴手套謹(jǐn)慎操作。1.2梅毒標(biāo)本采集梅毒的實(shí)驗(yàn)室診斷主要有病原體檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)方法，各期梅毒的檢測(cè)方法及 部位見下表。臨床表現(xiàn)取材部位檢查方法一期梅毒潰瘍、淋巴結(jié)、血液暗視野檢杳、血

2、清學(xué)檢杳二期梅毒皮損、淋巴結(jié)、血液暗視野檢杳、血清學(xué)檢杳潛伏梅毒血液血清學(xué)檢杳二期梅毒血液、腦脊液血清學(xué)檢杳神經(jīng)梅毒血液、腦脊液血清學(xué)檢杳1.2.1 血液1.2.1.1 血清標(biāo)本根據(jù)需要，用一次性真空采血針與促凝采血管抽取靜脈血2-5 ml,室溫靜置1-2小時(shí)（或37C靜置30分鐘），待血液凝固、血塊收縮后，3000r/min離心10-15 分鐘，分離新鮮血清，備用。也可采用保存于2-8 C或-20 C的血清。溶血、脂血或污染的標(biāo)本可影響試驗(yàn)結(jié)果。1.2.1.2 血漿標(biāo)本根據(jù)需要，用一次性真空采血針與抗凝采血管抽取靜脈血 2-5 ml ，輕輕顛倒混 勻8-10 次， 3000r/min 離心

3、10-15 分鐘，分離血漿，備用。血庫(kù)血漿以及 EDTA 抗凝血漿同樣可以用于梅毒血清學(xué)實(shí)驗(yàn) （一般僅用于RPF實(shí)驗(yàn)，），但易出現(xiàn)假陽(yáng) 性反應(yīng)（需用血清復(fù)試） ，如用其他抗凝劑應(yīng)首先評(píng)價(jià)后再用。1.2.1.3 末梢全血消毒局部皮膚（成人和 1 歲以上兒童可選擇手指或耳垂， 1 歲以下兒童采用足跟 部）。一次性采血針刺破皮膚，用無(wú)菌棉簽擦掉第一滴血。收集滴出的血液，立 即用于檢測(cè)。1.2.2 皮損部位組織液 用無(wú)菌生理鹽水浸濕的棉拭子擦去皮損表面的污物，鈍刀 /刮勺輕刮、擠壓皮損 部位，取滲出液與預(yù)先滴加在載玻片上的生理鹽水混合后加蓋玻片立即用于暗視 野顯微鏡檢測(cè) .1.2.3 淋巴液無(wú)菌操作下

4、穿刺腹股溝淋巴結(jié)， 注入 0.3ml 無(wú)菌生理鹽水并反復(fù)抽吸 2-3 次，取 少量的淋巴液直接滴于載玻片上，加蓋玻片后立即進(jìn)行暗視野鏡檢或備用。1.2.4 腦脊液操作由專業(yè)人員進(jìn)行， 一般用腰椎穿刺術(shù)獲得。 患者側(cè)臥于硬板床， 兩手抱膝緊 貼腹部，頭向前胸屈曲， 使軀干呈弓形， 以髂后上棘連線與后正中線的交點(diǎn)為穿 刺點(diǎn)，相當(dāng)于第 3-4 腰椎棘突間隙，消毒處理后，用 2%利多卡因自皮膚到椎間 韌帶作局部麻醉。 術(shù)者用左手固定穿刺皮膚， 右手持穿刺針以垂直背部方向緩緩 刺入，針尖稍斜向頭部，成人進(jìn)針深度約 4-6cm，兒童約2-4cm。當(dāng)針頭穿過(guò)韌 帶與硬腦膜時(shí)， 有阻力突然消失落空感， 此時(shí)可

5、將針芯慢慢抽出， 即可見腦脊液 流出，至于合適的容器中，備用。1.3 標(biāo)本接收的標(biāo)準(zhǔn)1.3.1 核對(duì)樣品與運(yùn)送單，檢查樣品管有無(wú)破損和溢漏。如發(fā)現(xiàn)溢漏應(yīng)立即將尚 存留的樣品移出，對(duì)樣品管和盛器消毒并做記錄。1.3.2 檢查樣品的狀況， 記錄有無(wú)嚴(yán)重溶血、 微生物污染、 脂血以及黃疸等情況。 如果樣品污染或者認(rèn)為樣品不能被接受， 應(yīng)將樣品安全廢棄。 并將樣品情況立即 通知運(yùn)送機(jī)構(gòu)。1.3.3 對(duì)不合要求的標(biāo)本，可以拒絕接受。2、梅毒的實(shí)驗(yàn)室檢查2.1 梅毒螺旋體暗視野顯微鏡檢查2.1.1 原理梅毒螺旋體侵入人體后， 在皮膚黏膜下增殖， 并很快沿著淋巴管到達(dá)附近淋巴結(jié)， 經(jīng)過(guò) 2-4 周的潛伏期，

6、在侵入部位發(fā)生炎癥反應(yīng)，稱為硬下疳，數(shù)天到 1 周后， 淋巴結(jié)腫大。 二期梅毒是梅毒螺旋體由局部經(jīng)淋巴結(jié)進(jìn)入血液， 在人體內(nèi)大量播 散后而出現(xiàn)的全身表現(xiàn)，一般發(fā)生在感染后的 7-10 周或硬下疳出現(xiàn)后 6-24 周， 主要為皮膚黏膜損害， 有扁平疣、 黏膜斑和玫瑰斑疹等。 患梅毒的孕婦可以通過(guò) 胎盤使胎兒受染。研究證明，在妊娠期 7 周時(shí)，梅毒螺旋體即可通過(guò)胎盤。其梅 毒患者硬下疳、淋巴結(jié)、皮膚黏膜損害以及孕婦羊水中均可檢查到梅毒螺旋體。 將標(biāo)本置于暗視野顯微鏡下， 光線從聚光器的邊緣斜射到涂片上， 可使梅毒螺旋 體折射出亮光，從而可根據(jù)其特殊形態(tài)和運(yùn)動(dòng)方式進(jìn)行檢測(cè)。2.1.2 方法2.1.2

7、.1 儀器耗材：1) 暗視野顯微鏡2) 無(wú)菌紗布3) 不銹鋼刮刀4) 滅菌棉拭子5) 載玻片、蓋玻片6) 注射器，注射針頭7) 滅菌生理鹽水2.1.2.2 檢測(cè)流程1) 將待檢標(biāo)本制成生理鹽水涂片，加蓋玻片后立即備檢。2) 在預(yù)先調(diào)整好的暗視野顯微鏡的聚光器上加數(shù)滴浸油，輕輕調(diào)低聚光器，使 之在載物臺(tái)下方。3) 將標(biāo)本玻片置載物臺(tái)上，上升聚光器，使浸油接觸載玻片底面，避免浸油內(nèi) 有氣泡。4) 鏡檢：先低倍后高倍，尋找有特征形態(tài)和運(yùn)動(dòng)方式的梅毒螺旋體。2.1.3 結(jié)果2.3.1.1 結(jié)果判讀：在暗視野顯微鏡下觀察 ,發(fā)現(xiàn)有纖細(xì)、白色、有折光的螺旋狀微生物， 長(zhǎng) 6-20um, 直徑小于0.2um

8、,有6-14個(gè)螺旋，具有旋轉(zhuǎn)、蛇行及伸縮等特征性的運(yùn)動(dòng)方式， 可判斷為梅毒螺旋體。2.3.1.2 結(jié)果報(bào)告：暗視野顯微鏡下若發(fā)現(xiàn)上述特征的梅毒螺旋體則報(bào)告陽(yáng)性結(jié)果； 未見到上述特征 的梅毒螺旋體則報(bào)告陰性結(jié)果。2.1.4 臨床意義1) 梅毒螺旋體暗視野顯微鏡檢測(cè)陽(yáng)性在臨床上可確診梅毒, 特別是對(duì)于有皮膚 黏膜損害和淋巴結(jié)病變的一、二期梅毒的診斷具有重要價(jià)值,且具有快速, 方便,易操作等特點(diǎn)。2) 若未能發(fā)現(xiàn)梅毒螺旋體,不能排除梅毒診斷。陰性結(jié)果原因可能為：標(biāo)本中 的微生物數(shù)量不足(單次的暗視野檢測(cè)其敏感性低于 50%)、病人已接受治療、 皮損已接近自然消退或取自非梅毒性皮損。3) 無(wú)論暗視野顯

9、微鏡檢查的結(jié)果如何,都應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)。2.1.5 注意事項(xiàng)1) 取材前,應(yīng)用無(wú)菌生理鹽水清潔皮膚表面,取材時(shí)應(yīng)注意無(wú)菌操作。2) 應(yīng)取到組織滲出液,盡量避免出血,以提高檢出陽(yáng)性率。3) 取材后應(yīng)立即置暗視野顯微鏡下觀察,如擱置太久,梅毒螺旋體活動(dòng)能力會(huì) 下降,導(dǎo)致鏡下難以觀察到陽(yáng)性結(jié)果。4）對(duì)口腔潰瘍標(biāo)本， 在暗視野顯微鏡下如觀察到梅毒螺旋體的特征性形態(tài)和運(yùn) 動(dòng)方式，應(yīng)與其他螺旋體相區(qū)別。2.2. 甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（ TRUS）T2.2.1 原理梅毒螺旋體一旦感染人體， 宿主迅速對(duì)感染早期被損害的自身細(xì)胞以及梅毒螺旋 體細(xì)胞表面所釋放脂類物質(zhì)做出免疫應(yīng)答， 在 3-4 周內(nèi)可產(chǎn)生

10、抗類脂抗原的抗體 （亦稱為反應(yīng)素）。這種抗體在體外可與心磷脂、卵磷脂和膽固醇等組成的抗原 （0.03%心磷脂、 0.21%卵磷脂和 0.90%膽固醇）發(fā)生抗原 -抗體反應(yīng)。心磷脂、 卵磷脂和膽固醇都是醇溶性脂類， 遇水形成膠體溶液。 當(dāng)含有反應(yīng)素的梅毒血清 與之混合時(shí)，即粘附在膠體顆粒的周圍。經(jīng)搖動(dòng)、碰撞，形成抗原抗體復(fù)合物， 出現(xiàn)凝集顆粒， 即為陽(yáng)性反應(yīng)。 甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)即在抗原中加入甲苯胺 紅顆粒作為指示物，與待檢血清（漿）中的反應(yīng)素結(jié)合，形成肉眼可見的紅色絮 狀物。血清不需滅活，肉眼可觀察結(jié)果。2.2.2 方法2.2.2.1 儀器耗材：1）TRUST試劑盒2）水平旋轉(zhuǎn)儀：要求旋轉(zhuǎn)

11、環(huán)狀直徑為 2cm轉(zhuǎn)速為（100土 2） r/min ,并帶有計(jì) 時(shí)器和保濕蓋）3）無(wú)菌生理鹽水（ 0.9%）2.2.2.2 檢測(cè)流程：2.2.2.2.1 定性試驗(yàn)1）試劑準(zhǔn)備：檢測(cè)前將試劑盒置室溫預(yù)溫 30分鐘2）加標(biāo)本：吸取50卩l(xiāng)血清（漿）置試驗(yàn)卡片圈中，并均勻地涂布在整個(gè)卡圈 內(nèi)。不能將標(biāo)本溢出環(huán)圈外面。3）加抗原：將抗原輕輕搖勻，在每個(gè)標(biāo)本圈中，用專用滴管針頭垂直滴加 1 滴（60 1滴/ml，約17卩1/滴）抗原，不需要手工混勻。4）反應(yīng)：將卡片置水平旋轉(zhuǎn)儀上，建議罩上保濕蓋， （ 100 2） r/min 旋轉(zhuǎn) 8 分鐘。5）從旋轉(zhuǎn)儀中取出卡片后立即在亮光下用肉眼觀察結(jié)果。 用手

12、輕微的旋轉(zhuǎn)或傾斜卡片可有助于弱陽(yáng)性和陰性標(biāo)本。2.2.2.2.2 定量實(shí)驗(yàn)1) 實(shí)驗(yàn)卡片準(zhǔn)備：在卡片中圈 1 到圈 4中分別標(biāo)上 1:2 ，1：4，1：8，1：162) 稀釋液準(zhǔn)備：在圈1到圈4中加入50卩l(xiāng)生理鹽水，勿將鹽水液滴涂開。3) 標(biāo)本稀釋：吸取50卩l(xiāng)血清(漿)于圈1中，用移液器來(lái)回吸放5-6次已混 合圈 1 中的生理鹽水和標(biāo)本，但要避免產(chǎn)生氣泡。從圈 1(1:2)中移取 50 卩l(xiāng)到圈2( 1: 4)用上述同樣方法混合后依次稀釋至圈 3( 1: 8)和圈4( 1: 16)?；煨髲娜?中棄去50卩l(xiāng)。4) 依次從圈 4- 圈 1 將不同稀釋度的標(biāo)本涂布整個(gè)圈內(nèi)。5) 加抗原等以下

13、實(shí)驗(yàn)步驟同定性試驗(yàn)的 2-4。6) 如陽(yáng)性反應(yīng)滴度大于 1;16, 則繼續(xù)稀釋以測(cè)定最高稀釋反應(yīng)滴度。2.2.3 結(jié)果2.2.3.1 結(jié)果判讀1) 陽(yáng)性反應(yīng)：圓圈內(nèi)出現(xiàn)中或大的紅色絮狀物，液體清亮；2) 弱陽(yáng)性反應(yīng)：圓圈內(nèi)出現(xiàn)小的紅色絮狀物，液體混濁；3) 陰性反應(yīng)：圓圈內(nèi)僅見炭顆粒集中于中央一點(diǎn)或均勻分散。2.3.3.2 結(jié)果報(bào)告1) 定性試驗(yàn)：出現(xiàn)凝集反應(yīng)報(bào)告陽(yáng)性，不產(chǎn)生凝集反應(yīng)報(bào)告陰性。2) 定量實(shí)驗(yàn)：出現(xiàn)凝集反應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)為抗體滴度，結(jié)果報(bào)告滴度為1: X, X依次為1、2、4等稀釋倍數(shù)。2.2.4 臨床意義1) 梅毒螺旋體一旦感染人體后產(chǎn)生抗類脂抗原的抗體，未經(jīng)治療可長(zhǎng)期存在

14、。 經(jīng)適當(dāng)治療后，抗體可以逐漸減少至轉(zhuǎn)為陰性，早期梅毒(一期、二期)經(jīng)足量規(guī)則抗梅毒治療后3個(gè)月，TRUST抗體滴度可下降2個(gè)稀釋度，6個(gè)月 可下降 4個(gè)稀釋度，一期梅毒一般約 1 年后可轉(zhuǎn)為陰性，二期梅毒 2年后可 轉(zhuǎn)為陰性。但晚期梅毒治療后血清滴度下降緩慢， 2 年后約 50%病人血清反 應(yīng)仍為陽(yáng)性。2) TRUST定性試驗(yàn)結(jié)果可用于現(xiàn)癥梅毒診斷。TURST定量試驗(yàn)結(jié)果可用于療效 觀察和判愈。2.2.5 注意事項(xiàng)1）生物學(xué)假陽(yáng)性：非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)采用的抗原為心磷脂、卵磷脂 和膽固醇的混合物，所檢測(cè)的抗心磷脂抗體易見于其他多種疾病，如急性病 毒性感染、自身免疫性疾病、結(jié)締組織病、靜

15、脈吸毒者以及懷孕的婦女等。 因此該類反應(yīng)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。 所以該類試驗(yàn)陽(yáng)性標(biāo)本需進(jìn)一步采用梅毒 螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)（如 TPPA ELISA）等復(fù)檢，以排除生物學(xué)假陽(yáng)性， 確認(rèn)是否為梅毒螺旋體感染。2）前帶現(xiàn)象：只對(duì)早期梅毒患者進(jìn)行非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)時(shí)，有時(shí)血清 中存在高濃度的抗體，導(dǎo)致抗原抗體濃度不匹配，出現(xiàn)弱陽(yáng)性、不典型或陰 性反應(yīng)的結(jié)果，此時(shí)需將血清稀釋后再進(jìn)行試驗(yàn)，可出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。該現(xiàn)象 稱為前帶現(xiàn)象。2.3 梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（ TPPA）2.3.1 原理梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA是用超聲裂解梅毒螺旋體抗原致敏明膠粒子， 致敏粒子與待檢血清 （漿）中的梅毒螺旋體抗

16、體結(jié)合， 產(chǎn)生肉眼可見的顆粒凝集。2.3.2 方法2.3.2.1 儀器耗材：1）TPPA檢測(cè)試劑盒2）移液器3）保濕盒2.3.2.2 檢測(cè)流程：1）試劑準(zhǔn)備：試驗(yàn)前 30 分鐘將待檢標(biāo)本和試劑從冰箱中取出，恢復(fù)至室溫。2）加稀釋液：每份樣本作 4 孔，用移液器將血清稀釋液滴入微量反應(yīng)板第 1 孔（100卩l(xiāng) ）,從第2孑L-第4孔各滴25卩l(xiāng)。3）樣本稀釋：用移液器取待檢血清 25卩l(xiāng)置第1孔中，然后以2n的方式從第1 孔稀釋至第 4孔。4）加對(duì)照液：用移液器在第3孔滴入25卩l(xiāng)未致敏粒子；在第4孔滴入25卩I 致敏粒子。5）混合：以不會(huì)導(dǎo)致微量反應(yīng)板內(nèi)容物濺出的強(qiáng)度混合 30秒鐘。6）反應(yīng)：

17、加蓋置濕盒內(nèi)，于室溫（15C -30 C）下水平靜置。2小時(shí)后觀察并記 錄結(jié)果。附：重吸收試驗(yàn)對(duì)于未致敏粒子和致敏粒子均顯示以上凝集的樣品， 要按照下列程序在完成吸 收操作的基礎(chǔ)上進(jìn)行再試驗(yàn)。1）取用定量的溶解液調(diào)制好的未致敏粒子 0.95ml 至小試管中。2）加入樣品50卩l(xiāng)混合，于室溫（15C -30 C）下放置20分鐘以上。3）離心分離（ 2000rpm、5 分鐘），然后分別吸取上清液【吸收完畢的稀釋樣品（1: 20）】50卩l(xiāng)至反應(yīng)板第3孔中，特別注意不要混入粒子。4）從第4孔以后，要預(yù)先各滴入25卩l(xiāng)血清稀釋液，從第3孔至最后一孔用移 液器以 2n 的方式進(jìn)行稀釋。5）之后的步驟同上

18、。2.3.3 結(jié)果2.3.3.1 結(jié)果判讀首先觀察未致敏粒子反應(yīng)孔是否出現(xiàn)凝集（第 3 孔），判斷試驗(yàn)有效性后，再根 據(jù)致敏粒子與標(biāo)本反應(yīng)孔（第4孔）與致敏粒子是否產(chǎn)生1+2+凝集反應(yīng)凝集 反應(yīng)，判斷結(jié)果。如未致敏粒子反應(yīng)孔出現(xiàn)凝集（第 3 孔）為無(wú)效試驗(yàn)，需要對(duì) 標(biāo)本進(jìn)行重吸收試驗(yàn)后再進(jìn)行檢測(cè)。+ ：產(chǎn)生均一的凝集，凝集粒子在底部，呈膜狀延展；+ ：粒子環(huán)明顯變大，其外周邊緣不均勻且雜亂的凝集在周圍； ：粒子形成小環(huán)狀，呈現(xiàn)出外周邊緣均勻且平滑的圓形；- ：粒子呈紐扣狀聚集，呈現(xiàn)出外周邊緣均勻且平滑的圓形。2.3.3.2 結(jié)果報(bào)告陽(yáng)性：未致敏粒子反應(yīng)孔（第 3孔）不出現(xiàn)凝集，致敏粒子反應(yīng)孔（

19、第 4孔）出 現(xiàn) 1+ 2+凝集反應(yīng)，報(bào)告陽(yáng)性。陰性：未致敏粒子反應(yīng)孔（第 3 孔）和致敏粒子反應(yīng)孔（第 4 孔）均未出現(xiàn)凝集 反應(yīng)，報(bào)告陰性。弱陽(yáng)性：未致敏粒子反應(yīng)孔（第 3 孔）不出現(xiàn)凝集，致敏粒子反應(yīng)孔（第 4 孔） 出現(xiàn)凝集反應(yīng)，報(bào)告弱陽(yáng)性。2.3.4 臨床意義1) 梅毒螺旋體一旦感染人體后約 2-4 周即可檢測(cè)到抗梅毒螺旋體抗體， 此抗體 特異性高可達(dá) 98%以上，所以檢測(cè)到梅毒螺旋體抗體陽(yáng)性可確證為現(xiàn)在或既 往有過(guò)梅毒螺旋體感染。2) 患者感染梅毒螺旋體后產(chǎn)生的抗梅毒螺旋體抗體一般能保持終生， 梅毒患者 即使經(jīng)過(guò)正規(guī)療程的抗梅毒治療后，梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)仍可陽(yáng)性， 故梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)不能作為療效觀察的指標(biāo)。3) 梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)亦不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染， 試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果應(yīng) 進(jìn)一步進(jìn)行非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)，