設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)生化——蠶豆病

1、2012年設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn) 患兒，男性，3歲，因面色蒼白伴血 尿1天入院。1天前食用新鮮蠶豆后，今日 出現(xiàn)惡心、嘔吐、排尿呈醬油樣色，面色 蒼白。據(jù)家長反映，患者的姐姐也曾發(fā)生 過類似情況。 體格檢查：體溫38，脈搏150次/分 ，呼吸40次/分，血壓80/60mmHg，呼吸急 促，神清，萎靡，面色蒼白，皮膚及鞏膜 黃染，體型較同齡人瘦小。心、肺未及異 常，肝、脾未觸及，雙腎區(qū)無叩擊痛，神 經(jīng)系統(tǒng)檢查未及異常。實(shí)驗(yàn)室檢查：紅細(xì) 胞 1.981012/L，血紅蛋白53g/L，血清 總膽紅素85.5mol/L，結(jié)合膽紅素 13.7mol/L，未結(jié)合膽紅素71.8mol/L， 尿蛋白（+），潛血(+)，尿

2、膽紅素() ，尿膽素原(+)，尿液鏡下未見紅細(xì)胞。 （尿三膽）尿膽素（尿三膽）尿膽素（+）、尿膽紅素）、尿膽紅素()、尿膽素原、尿膽素原(+) 肝腸肝腸 循環(huán)循環(huán) 增多增多 膽紅素膽紅素 單核單核 吞噬吞噬 系統(tǒng)系統(tǒng) 降解降解 血紅素血紅素 紅細(xì)胞破裂紅細(xì)胞破裂 血紅蛋白滲出血紅蛋白滲出 尿蛋白尿蛋白(+)(1.0g/l) 運(yùn)氧功能障礙運(yùn)氧功能障礙 溶血性貧血溶血性貧血 循環(huán)血量減少循環(huán)血量減少 血壓下降血壓下降 脈搏加快脈搏加快 (心率加快心率加快) 呼吸加快呼吸加快 過多過多34.2umol/L時(shí)，時(shí)， 黃疸黃疸 血清總膽紅素血清總膽紅素 結(jié)合膽紅素變化不大（水溶結(jié)合膽紅素變化不大（水溶

3、性大，隨尿排出）性大，隨尿排出） 未結(jié)合膽紅素未結(jié)合膽紅素（水溶性（水溶性 小，不能隨尿排出，有毒）小，不能隨尿排出，有毒） 醬油尿醬油尿 理論依據(jù) 溶血性黃疸:由于紅細(xì)胞 的大量破壞，使膽紅素產(chǎn) 生過多，超過了肝細(xì)胞攝 取結(jié)合的能力，使得尿中 尿膽原和尿膽素含量增多 。葡糖-6-磷酸脫氫酶缺乏 ，輸血不當(dāng)均會(huì)引起病癥 蠶豆?。浩咸?6-磷酸脫 氫酶缺乏?；颊叽蠖嘣谑?用蠶豆后發(fā)生急性溶血性 貧血。典型病人常出現(xiàn)由 于大量紅細(xì)胞破壞釋放出 膽紅素二導(dǎo)致的溶血性黃 疸 ，惡心嘔吐，尿液呈醬 油樣等癥狀 誘因：一天前食用蠶豆 既往史：姐姐也曾出現(xiàn)過此癥狀 蠶豆病發(fā)病機(jī)制 食用蠶豆 產(chǎn)生大量過氧化氫

4、，不被清除 紅細(xì)胞膜脂質(zhì)被氧化破壞 急性血管內(nèi)溶血，產(chǎn)生過多膽紅素 導(dǎo)致溶血性黃疸，惡心，嘔吐，尿液呈醬油樣 6-磷酸葡萄糖脫氫酶缺乏使磷酸戊糖途徑受阻。 NADPH+H+缺乏致血還原型谷胱甘肽生成不足。 紅細(xì)胞被破壞，則可被肝等單核吞噬細(xì)胞識(shí)別并 吞噬，釋放血紅蛋白，進(jìn)一步分解為珠蛋白和血 紅素，而血紅素被吞噬細(xì)胞降解為膽紅素。 膽紅素是人體內(nèi)原型抗氧化劑，能夠清楚超氧化 劑和過氧化物自由基，因患兒體內(nèi)有大量過氧化 氫，氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)，從而增加膽紅 素的量升高來抵御氧化應(yīng)激狀態(tài)。 患兒正常（兒童） 紅細(xì)胞1.981.98101012 12/L /L 4.04.0* *10101

5、2 125.3 5.3* *101012 12/L /L 血紅蛋白53g/L 53g/L 120120140g/L 140g/L 血清總膽紅素85.585.5mol/L mol/L 1.711.7117.1mol/L 17.1mol/L 結(jié)合膽紅素13.713.7mol/L mol/L 0 03.42mol/L 3.42mol/L 未結(jié)合膽紅素71.871.8mol/L mol/L 0 013.68mol/L 13.68mol/L 尿蛋白(+)(+) 潛血(+)(+) 尿膽紅素(-) (-) 尿膽素原(+)(+) 從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和 實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果 主要臨床表現(xiàn)：1. 1. 血尿、

6、排醬油色尿、面色蒼白 2. 2. 皮膚及鞏膜黃染 3. 3. 體溫升高 4. 4. 呼吸急促 1. 血尿、排醬油色尿、面色蒼白 G6PD GSH的主要作用：的主要作用： 保護(hù)紅細(xì)胞內(nèi)的含硫氫基保護(hù)紅細(xì)胞內(nèi)的含硫氫基 （-SH）血紅蛋白、酶蛋白和膜）血紅蛋白、酶蛋白和膜 蛋白的完整性，免遭氧化蛋白的完整性，免遭氧化 與谷胱甘肽過氧化酶共同使與谷胱甘肽過氧化酶共同使 H2O2還原成還原成H2O NADPH+H+紅細(xì)胞的抗氧化能力紅細(xì)胞的抗氧化能力GSH 紅細(xì)胞紅細(xì)胞 膜破裂膜破裂 溶血性貧血溶血性貧血 （面色蒼白）（面色蒼白） 游離游離Hb腎腎 吸收閾值吸收閾值 血紅蛋白尿血紅蛋白尿/ 含鐵血黃素

7、尿含鐵血黃素尿 2. 皮膚及鞏膜黃染 3. 體溫升高 機(jī)理： 紅細(xì)胞破裂 血紅蛋白暴露 免疫系統(tǒng)攻擊 （單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)） 體溫升高 4. 呼吸急促 溶血性貧血 具有載O2能力的Hb含量下降 機(jī)體缺O(jiān)2 呼吸急促 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 高鐵血紅蛋白還原法高鐵血紅蛋白還原法 實(shí)驗(yàn)思路 患者姐姐出現(xiàn)過此類狀況推測屬于家族 性遺傳，且患者在食用蠶豆后出現(xiàn)癥狀 ，故即有可能為蠶豆病。6-磷酸葡萄糖 脫氫酶缺乏影響高鐵血紅蛋白的還原， 故可以依據(jù)如下反應(yīng)機(jī)制設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。 亞鐵血紅蛋白亞鐵血紅蛋白 高鐵血紅蛋白高鐵血紅蛋白 高鐵血紅蛋白還原酶高鐵血紅蛋白還原酶 NADPH(輔酶輔酶) 亞甲藍(lán)亞甲藍(lán)(遞氫體遞氫

8、體) 亞硝酸鈉亞硝酸鈉 實(shí)驗(yàn)反應(yīng)方向 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、檢測患者體內(nèi)6-磷酸葡萄糖脫氫酶活性以 及發(fā)病原因 2、掌握高鐵血紅蛋白還原法測6-磷酸葡萄糖 脫氫酶的實(shí)驗(yàn)原理及方法 3、了解蠶豆病的發(fā)病機(jī)制及原因 二、實(shí)驗(yàn)原理 在全血中加入亞硝酸鈉，使紅細(xì)胞中的亞鐵 血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白（MHb）,高鐵血紅 蛋白在高鐵血紅蛋白還原酶的作用下又被還原為 亞鐵血紅蛋白。在這過程中，高鐵血紅蛋白還原 酶不僅需要亞甲藍(lán)作為遞氫體，還需要由G6PD參 與磷酸戊糖途徑形成NADPH作為輔酶才完成上述反 應(yīng)。所以，G6PD缺陷癥的患者其MHb還原率下降（ 分光光度技術(shù)）。 三、實(shí)驗(yàn)器材及試劑 器材：離心機(jī)、

9、分光光度計(jì)、微量移液器 水浴箱、1.5mlEP管、抗凝管，試管 試劑： 0.18mol/L亞硝酸鈉-葡萄糖溶液； 0.4mmol/L亞甲藍(lán)溶液 ； 0. 28 mol/L 葡萄糖溶液、混合液 （等量+）生理鹽水、抗凝劑、 患者靜脈血、蒸餾水 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1、取靜脈血1.8mL于抗凝管(含0.2mL109mmol/L抗凝 劑+葡萄糖20mg），混勻 2、離心沉淀10001000r/min15min 3、調(diào)整血細(xì)胞血漿=11，混勻，（調(diào)整后全血 ） 4.1ml0.18 mol/L亞硝酸鈉、1ml0.28mol/L葡萄糖溶 液、0.14 mmol/L亞甲基藍(lán)液，混勻，得到混合試 劑1ml 5、取試

10、管3 支,標(biāo)上A、B、S ,按下表加入試劑 高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)操作步驟 混合試劑/ mL 0. 01 / / 生理鹽水/ mL / 0. 01 / 0. 18 mol/ L 亞硝酸鈉- / / 0. 01 0. 28 mol/ L葡萄糖溶液/ mL 經(jīng)調(diào)整的全血/ mL 0. 1 0. 1 0. 1 來回?fù)u動(dòng)1520 次,置37 水浴箱靜置3 h 蒸餾水 10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml 試劑 A B S B管為空白管,在波長635nm處，測定“A”管及 “S”管吸光度 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算： 計(jì)算高鐵血紅蛋白還原率 公式： MHb % = (1 - A/ S) 1

11、00 % 計(jì)算出其還原率與正常值比較 六、實(shí)驗(yàn)分析 該患者可能患有先天性鐮刀貧血癥或蠶 豆病。 正常的高鐵血紅蛋白還原率75%，若計(jì)算 所得還原率低于75%，且患者姐姐也有類 似癥狀，患者吃過蠶豆后發(fā)病，故可推斷 患者患有蠶豆病 七、注意事項(xiàng) 1、血細(xì)胞比容比值過低，高鐵血紅蛋白還 原率降低。應(yīng)將血細(xì)胞比容調(diào)整到0.35-0.40 2、細(xì)菌污染可產(chǎn)生亞硝酸鹽而造成假陽性， 試管等應(yīng)無菌 3、不穩(wěn)定Hb、高脂血癥等均可出現(xiàn)假陽性 結(jié)果，故應(yīng)2h內(nèi)送檢 4、標(biāo)本不應(yīng)有凝血或溶血，故需使用抗凝 管 5、在標(biāo)本內(nèi)應(yīng)適當(dāng)加入葡萄糖，以避免較 全血缺乏 要想探討該病發(fā)生的分子基礎(chǔ)，可以用哪些技術(shù)檢測什么目的 基因？ 我組討論認(rèn)為：要想探討該病發(fā)生的分子基礎(chǔ) ，需要對(duì)目的 基因進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，即DNADNA序列檢測 D N A 序 列 測 定 方 法 直接法直接法 間接法間接法：對(duì)于未知片段，或片段過長，用幾種方法：對(duì)于未知片段，或片段過長，用幾種方法 （RFLP；PCR-RFLP；SSCP）來粗略的估計(jì)待分析）來粗略的估計(jì)待分析 基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)是否與對(duì)照基因相同基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)是否與對(duì)照基因相同 雙脫氧末端終止法（