鐵、氧自由基與腎小管上皮細胞(一)

1、鐵、氧自由基與腎小管上皮細胞 （一 ） 關(guān)鍵詞：鐵氧自由基腎小管上皮細胞鐵， 過渡態(tài)金屬元素之一， 外層軌道電子分布呈 3d64s2， 化學(xué)性質(zhì)活潑， 極易得失電子， 產(chǎn)生高反應(yīng)性氧自由基或鐵氧、過鐵氧復(fù)合物，導(dǎo)致組織損 傷。正常情況下，體內(nèi)的鐵以血紅素鐵或非血紅素鐵等非反應(yīng)態(tài)存在， 但在急、慢性腎臟病 變，尤其是伴發(fā)蛋白尿的臨床和動物模型中可發(fā)現(xiàn)小管液及上皮細胞漿內(nèi)博萊霉素敏感鐵即 具有催化活性的游離鐵顯著增加 1，并且可積聚于腎近曲、 遠曲小管細胞的溶酶體中，偶 見于線粒體內(nèi)。 鐵的積聚與蛋白尿、 腎小管間質(zhì)病變、脂質(zhì)過氧化、次全切除腎的腎小球濾 過率、殘余腎重量等病損程度直接相關(guān)1， 2

2、，鐵負荷可增加缺血腎的損傷易感性3；而腎小管上皮細胞是鐵介導(dǎo)的氧自由基損傷的主要部位， 小管間質(zhì)病變又是繼發(fā)性腎單位毀 損和慢性進展性腎功能衰竭的主要決定因素 2。因此闡明鐵、氧自由基、 腎小管上皮細胞 間的相互作用機制正受到日益重視。一、鐵代謝與腎小管上皮細胞 蛋白尿時，尿轉(zhuǎn)鐵蛋白排泄增多，轉(zhuǎn)鐵蛋白是鐵的主要轉(zhuǎn)運形式，相對分子質(zhì)量為88000，球形，等電點 5.2，與白蛋白 （相對分子質(zhì)量為 65000，pI4.7） 相比，其通過腎小球濾膜更多的 是由膜孔的改變而不是受電荷屏障影響2。尿鐵 / 尿轉(zhuǎn)鐵蛋白比例增高提示蛋白尿損害加重，鐵的毒性作用與下列因素有關(guān)：鐵的游離、Fe3 Fe2+及用以

3、生成OH的H2O2或其他過氧化體。轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵或小管腔內(nèi)解離鐵（亦可來源于血紅蛋白、肌紅蛋白 ）可經(jīng)位于基底膜側(cè)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或刷狀緣胞飲作用進入腎小管細胞。一般認為，鐵的解離與尿液pH有關(guān)，當(dāng)尿 pH 接近至 6 時，有催化活性的游離鐵迅速增加， 但尿液中鐵螯合劑存在的濃度、 種類，離子成分，可能存在的還原成分，使尿pH在V 6或6時，也能使鐵游離4。尿中游離鐵溶解度極低（V 10-6），當(dāng)pH 4時，鐵以羥氧化體和磷酸形成不溶性復(fù)合物存在， 因此小管液中非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵，必須與小分子物質(zhì)如焦磷酸、ADP或檸檬酸（可能性更大）結(jié)合， 增加鐵的溶解度與反應(yīng)性。值得注意的是， 凡是可緩解腎功能

4、惡化、 改善組織學(xué)形態(tài) 的方法， 均可同時降低小管液鐵， 如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑 （如開博通與鐵結(jié)合可降解O2-5 ）、鐵缺失、甲狀腺切除、限制飲食蛋白、限磷。入胞后的鐵大部分以鐵蛋白、 含鐵血黃素形式積聚于溶酶體。 胞漿內(nèi)催化鐵的來源途徑可能 有三：小管腔的重吸收、 跨基底膜的攝取、 原有細胞內(nèi)鐵儲存池的釋放。 鐵釋放的因素包括： 氧自由基，鐵蛋白的動員（Fe3+f Fe2+,細胞色素P450轉(zhuǎn)換不足，后者可能是缺血再灌注損 傷中額外鐵、催化鐵的重要來源6。其他來源包括：血紅蛋白、線粒體中的細胞色素、過氧化氫酶、某些情況下腎外的血紅蛋白、肌紅蛋白、脫氫酶4Fc=4S簇等。二、腎小管細胞的鐵

5、毒性作用機理 近曲小管細胞是鐵介導(dǎo)的氧自由基損傷的主要部位鐵對小管細胞的毒性作用取決于鐵劑的 劑量、接觸時間、接觸鐵的類型、有無轉(zhuǎn)運蛋白等 7。 10-4mol/L 鐵作用于小管細胞即可 引起溶酶體鐵積聚，各種細胞損傷，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、線粒體變性、中間纖維增多、自嗜體 鞘樣結(jié)構(gòu)增加、B1整合素亞基表達下調(diào)，損傷修復(fù)障礙，肌紅蛋白尚有抗細胞增殖作用8但目前對于哪個自由基觸發(fā)和引起損傷、 鐵源性自由基產(chǎn)生部位和作用途徑、 導(dǎo)致細胞死亡 的關(guān)鍵生化事件等尚有爭議。1氧化損傷學(xué)說（oxidantstress）:在缺血、免疫、中毒性 （包括肌注甘油后、肌紅蛋白、順鉑、 慶大霉素 ）腎病的臨床和實驗動物模

6、型中，均發(fā)現(xiàn)氧自由基作用的直接和間接證據(jù)（脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 MDA） 。鐵通過催化 Fenton/Haber-Weiss 反應(yīng)使 O2 逐步還原，依次形成 O2-、 H2O2、OH。OH的產(chǎn)生具有部位特異性，由于附著于刷狀緣胞外膜磷脂的游離鐵原位催化 而來，且作用于小管腔中V 100nm的有效范圍，去鐵胺（DNA, deferoxamine）可阻斷其通路， 而只有到達該部位的 OH清除劑才能發(fā)揮作用；H2O2和O2-則分別可自由穿過胞膜及經(jīng)離子通道出入細胞。自由基可直接作用于蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、DNA,破壞生物大分子；同時自由基可使鐵游離為催化活性鐵，加重損傷。OH可氧化含-HS的復(fù)合物，-SH

7、的氧化導(dǎo)致細胞內(nèi)關(guān)鍵酶和轉(zhuǎn)運蛋白如Na+-K+-ATPase的失活，該酶在維持細胞內(nèi)外離子梯度、細胞轉(zhuǎn)運中有重要作用。脂質(zhì)過氧化終末產(chǎn)物丙二醛（MDA）、短鏈烷烴，可破壞細胞膜的脂雙層，使生物膜通透性增加，氧化磷酸化中電子傳遞障礙，溶酶體通透性增加；此外，自由基尚可 降解DNA，阻礙損傷后的細胞修復(fù)過程，H2O2與Ca2+協(xié)同誘導(dǎo)DNA斷裂，被認為是氧化損傷的早期事件。目前認為缺血后腎臟病變是由再灌注相的自由基損傷介導(dǎo)，再灌注相時由黃嘌呤氧化酶XO催化的O2還原可能是O2-的主要來源。正常組織中以NAD+為電子受體的胞漿酶黃嘌呤脫氫 酶（TypeD）在缺血時可向以 O2為電子受體的黃嘌呤氧化酶

8、 （TypeO）轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的發(fā)生與細胞內(nèi) 鈣離子濃度增加，TypeD中的-SH氧化或Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴的絲氨酸蛋白激酶裂解有關(guān)， 在腎臟中這種轉(zhuǎn)換約需 30分鐘，且不可逆；同時，ATP降解產(chǎn)物AMP、腺嘌呤、次黃嘌呤、 黃嘌呤相應(yīng)增多，當(dāng)次黃嘌呤、黃嘌呤氧化時，電子傳遞至再灌注所供O2，產(chǎn)生O2-。缺血再灌注腎小管上皮內(nèi)，自由基其他可能來源如下：線粒體內(nèi)膜電子傳遞物復(fù)合體I、n、 川中泛醌-細胞色素b（O2-），隨線粒體呼吸的增加而相應(yīng)增加；質(zhì)膜、細胞器內(nèi)膜中含脂加 氧酶和環(huán)加氧酶催化的分解代謝（脂肪酸自由基中間產(chǎn)物 ）;-SH抗壞血酸還原螯合的Fe3+,Fe2+的自身氧化（O2-）; O

9、2-經(jīng)自發(fā)或催化的歧化作用（H2O2）;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜內(nèi)所含的細 胞色素P450、黃素蛋白、近曲小管上皮中大量的過氧化體。OH 一度被認為是介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化的觸發(fā)因素，但Zager等發(fā)現(xiàn)在無機鐵作用的小管細胞中苯甲酸、二甲基硫脲、甘露醇對MDA無影響；DFO的細胞保護作用不引起 OH產(chǎn)物的顯著下降或與OH產(chǎn)物下降無關(guān)，而谷胱甘肽 （GSH）過氧化氫酶則有細胞保護作用，提示可能 存在非OH途徑。Zager等第一次指出H2O2是肌紅蛋白觸發(fā)細胞死亡的關(guān)鍵決定因素9。血紅素的氧化損傷研究目前集中于H2O2、線粒體呼吸鏈、血紅素加氧酶（HO）, HO參與介導(dǎo)游離鐵的釋放，自由基的來源見于線粒體電子傳遞鏈的

10、可能較存在酶通路如黃嘌呤氧化酶、 花生四烯酸代謝 （經(jīng)環(huán)加氧酶、脂加氧酶或細胞色素P450 系統(tǒng) ）的可能性更大。呼吸鏈末端部分不僅是自由基形成的關(guān)鍵部位， 同時也是肌紅蛋白誘導(dǎo)細胞死亡的關(guān)鍵可調(diào)控點。 此外， 線粒體雖然為脂質(zhì)過氧化提供能源，但不是氧化損傷的對象 10。2缺血性小管損傷和 ATP耗竭：血紅素蛋白小管細胞的損傷因素呈多元性，并可相互疊加、 相互作用?，F(xiàn)在公認的途徑包括腎血管收縮、管型形成，壞死殘?。╪ecroticdebris） ，內(nèi)毒素/TNF的激活等，其中缺血損傷與血紅素蛋白的腎毒性作用密不可分。缺血時，ATP含量下降，血紅素可在容量不足的情況下在近曲小管細胞水平，加強腎縮

11、血管， 加重缺血性損傷， 該現(xiàn)象可能與胞飲、蛋白重吸收 （或某些繼發(fā)事件 ），而不是鐵負荷本身有關(guān)，而胞飲、重吸收或 膜脂質(zhì)的運輸 （trafficking） 、重建可直接增加質(zhì)膜對缺血觸發(fā)損傷的敏感性。血紅素內(nèi)飲直接 增加質(zhì)膜對磷脂酶 A2（PLA2的易損性，質(zhì)膜脫酰化，乳酸脫氫酶和花生四烯酸釋放增加是可 能的途徑之一， 另一途徑是否與縮血管作用無關(guān)， 但由鐵介導(dǎo)的細胞能量代謝紊亂有關(guān)， 有 待于進一步證實 11。3溶酶體失穩(wěn)定：蛋白尿時，濾過蛋白的過吞飲和溶酶體的超載可引起溶酶體鐵的積聚。小 管細胞中溶酶體積聚鐵的損傷機制目前有兩種觀點：Harris 等在嘌呤霉素腎病中發(fā)現(xiàn)溶酶體中鐵的積聚

12、是小管間質(zhì)病變中唯一的、獨立的先兆12，可能與溶酶體內(nèi)蛋白酶活性增加、溶酶體失穩(wěn)定， 水解酶入胞漿、 重吸收蛋白降解不全等有關(guān)； 部分腎切除模型中小管可見細 胞溶酶體酶NAG（N-乙酰-3-D-氨基葡萄糖苷酶卜AP（堿性磷酸酶）活性增加，慢性鐵負荷中酶 活性增加尤其顯著 1。但也有認為溶酶體酶釋放是氧化損傷的結(jié)果， 而不是原因，理由如 下：（1）溶酶體內(nèi)酶的最適pH3.54.0。當(dāng)釋放入中性胞漿時活性受抑；（2）尚未有溶酶體脆性增加的依據(jù)，且隨著慢性鐵負荷加重，脆性反而下降；（3）蛋白尿時，溶酶體膜在電鏡下未呈結(jié)構(gòu)缺陷； （4）尿中 NAG 增多僅見于病變嚴(yán)重時。4.脂質(zhì)過氧化與細胞毒性作用

13、（cytotoxicity） ：細胞毒性作用常用 LDH 釋放率、臺盼蘭拒染試 驗、 MTT（3- 4，5-二甲基噻唑 -l-yl-2,5 溴化二聯(lián)苯四氮唑 ）試驗等來監(jiān)測。亞急性鐵負荷直 接增加缺血鼠腎中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 13，去鐵胺、血紅素氧化酶抑制劑在降低 MDA 的同時， 對鐵誘導(dǎo)的細胞死亡具有保護作用， 在體外培養(yǎng)的 OK 細胞系中， 選用無血清、 10%牛血清、 10%牛血清加亞油酸的培養(yǎng)基獲得質(zhì)膜中多不飽和脂肪酸（PUFA含量各不相同的細胞系，H2O2誘導(dǎo)的細胞損傷程度直接與PUFA含量有關(guān)，提示脂質(zhì)過氧化可直接引起細胞毒作用14。但有一些試驗認為脂質(zhì)過氧化與細胞毒作用并不一致，G

14、SH作用于血紅素負荷的 PTS細胞毒作用下降，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物反而增多；Fe2+與Fe3+可引起相同程度的脂質(zhì)過氧化，然而，只有Fe3+引起細胞死亡；呼吸鏈的阻斷可使MDA增多或減少，因此，應(yīng)謹(jǐn)慎用脂質(zhì)過氧化來評估細胞毒作用。 影響 MDA 分析的因素很多， 如常用腎皮質(zhì) MDA 來代表小管 MDA； 組織來源的差異；胞漿 MDA 的干擾；體外培養(yǎng)的正常細胞中可出現(xiàn) MDA 等，此外，體內(nèi) 外小管細胞病變進程不一致，體內(nèi)遠落后于體外，脂質(zhì)過氧化可能是細胞毒作用的條件。5細胞毒中的介質(zhì)：（1）Ca2+：細胞內(nèi)Ca2+濃度升高是多源性小管細胞損傷的共同現(xiàn)象。催 化鐵引起的氧化應(yīng)激，破壞Ca穩(wěn)態(tài)，細胞

15、內(nèi)鈣離子濃度上升，游離鐵與Ca2+協(xié)同，產(chǎn)生H2O2,同時H2O2促使卟啉環(huán)中鐵釋放，形成正反饋8。鈣離子的氧化損傷作用與激活核酸內(nèi)切酶有關(guān)，繼之出現(xiàn)DNA片斷的斷裂，這與細胞凋亡的過程一致；同時，Ca2+依賴的酶活性提高，包括 calpain，胞漿內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶；NO合酶；磷脂酶 A2的大多數(shù)同工酶15Calpain和NO均與細胞骨架成分的破壞、細胞極性改變有關(guān)，故極有可能在缺 血性小管損傷中起重要作用；磷脂酶A2激活可調(diào)節(jié)游離脂肪酸釋放及溶血磷脂的聚積，破壞生物膜，但也有見報道血紅素負荷的小管細胞中，Ca2+螯合，不影響脂質(zhì)過氧化。（2）氧化氮（NO）:近曲小管細胞內(nèi)含 NO合酶（包括

16、組成型和誘生型），通過Ca2+、鈣調(diào)蛋白依賴 或獨立的途徑生成 NO, NO可很快與O2結(jié)合，生成反應(yīng)性更強的過氧化含氮化合物（ONOO-）,O2-又可失活NO,超氧化物歧化酶使 NO半衰期延長一倍；而 NO本身即是一自由基，具有 細胞毒作用；同時，NO參與調(diào)控鐵蛋白 mRNA翻譯，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 mRNA的穩(wěn)定性，介導(dǎo) 鐵蛋白中催化鐵的釋放, 失活細胞代謝活性所必需的鐵硫中心酶； 此外, 血紅蛋白可結(jié)合體 內(nèi)重要的擴血管介質(zhì) NO,加重腎缺血。缺血性急性腎功能衰竭中iNOS是NO的來源，Traylor認為，是脂質(zhì)A（主要成分（LPS通過Ca2+激活的NO產(chǎn)生在近曲小管觸發(fā)氧化損傷16在 體外的

17、原代小管細胞中, NO 的增多或減少可分別加重及緩解缺氧、再氧化損傷,提示NO是缺血再氧化的介質(zhì)之一；但在肌紅蛋白誘導(dǎo)腎毒性的整體實驗中，L-Arg、L-NAME未見作用,在缺血再灌注整體大鼠腎中,腎功能不全伴隨著 NO 產(chǎn)物的減少, L-NAME 可進一步加 重腎功能不全,基礎(chǔ) NO 與缺血時間有關(guān) 17,這提示是否存在血液動力學(xué)等影響因素, 而不是小管細胞的直接損害。6.與其他蛋白的相互作用：除轉(zhuǎn)鐵蛋白外,尿液中的脂蛋白、補體成分等具有小管細胞毒性 作用。小管液中殘余蛋白可加重鐵介導(dǎo)的損傷。新近發(fā)現(xiàn)氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL作用于體外培養(yǎng)的LLC-PK1細胞，可誘導(dǎo)增加血紅素加氧酶 m

18、RNA及蛋白活性，抗氧化劑可阻斷此 種誘導(dǎo)作用。蛋白尿狀態(tài)時，進入管腔的LDL，或停留在尿液腔，或經(jīng)胞飲入胞。 LDL的氧化可發(fā)生在輔氧化環(huán)境的小管腔或小管細胞內(nèi)，鐵加重LDL的毒性作用，依據(jù)有：接觸銅氧化LDL的細胞內(nèi)博萊霉素陽性鐵增多；DFO防止Ox-LDL的細胞毒及血紅素加氧酶的過表達； 在破碎紅細胞中，血紅素促進LDL的氧化18。三、抗氧化系統(tǒng)與腎小管上皮細胞機體內(nèi)存在清除自由基的防御體系，包括生育酚、抗壞血酸、3胡蘿卜素、谷胱甘肽、尿酸、膽紅素、幾種金屬酶包括谷胱甘肽過氧化物酶（硒）、過氧化氫酶 （鐵）、超氧化物歧化酶 （銅、鋅、鎂 ）,和蛋白質(zhì)如血漿銅藍蛋白。有的將金屬離子螯合劑、

19、各自由基清除劑歸入抗氧化 系統(tǒng)。組織損傷的程度取決于自由基生成和抗氧化系統(tǒng)間的平衡關(guān)系。一些微量元素的缺乏,加加重自由基損傷。 如硒缺乏的小管液中過氧化體增多， 硒不足的生長腎中腎間質(zhì)病變， 飲 食中硒合并維生素 E 不足， 可產(chǎn)生以蛋白尿、 腎小球濾過率下降和間質(zhì)細胞浸潤為特點的腎 臟病變。銅、硒缺乏的腎病綜合癥患者極易受鐵源自由基損傷2?？寡趸瘎┑哪I臟保護作用可能是與去除 02-，保護N0不與02-反應(yīng)，取消氧化損傷中的縮血管作用有關(guān)。與其他 組織相似，氧自由基增多伴隨AOE上調(diào)，H2O2孵育后的小管上皮細胞過氧化氫酶、GSH過氧化物酶水平上升?？寡趸傅谋磉_改變多與轉(zhuǎn)錄、加工、翻譯、翻譯

20、后修飾等調(diào)節(jié)有關(guān)。 缺血后細胞耐受 (cytoresistance) 可能與細胞內(nèi)抗氧化酶保護作用增加有關(guān)，但 Zager 等認為 缺血PTS的細胞耐受在缺氧、游離鈣負荷、氧化損傷等情況下均存在，故不能以抗氧化酶表 達增高或膜磷脂脂肪酸含量改變來解釋， 是否存在小管細胞膜物理性狀改變的可能如細胞極 性、流動性、細胞骨架附著，而不是生化成分改變?？寡趸瘎┏Ｓ胁恢挂环N的保護機制，可同時兼有抗氧化與輔氧化作用。DFO,不僅可螯合游離鐵，減少螯合部位 0H的產(chǎn)生，而且可直接清除 0H,滅活H2O2,或通過次黃嘌呤氧化酶、 葡萄糖 /葡萄糖氧化酶間接滅活；阻斷鐵依賴的血紅素加氧酶作用，減少肌紅蛋白誘導(dǎo)的細 胞死亡，抑制近曲小管細胞增殖7；但DFO本身可引起 0H的顯著增加，并促進 Fe2+的自身氧化，加重氧化損傷。谷胱甘肽在消除 H2O2 和脂質(zhì)過氫氧化體的同時，其代謝產(chǎn)物半 胱氨酸的-SH在金屬鐵催化下