PCR實(shí)驗(yàn)中的污染預(yù)防及處理

1、-作者xxxx-日期xxxxPCR實(shí)驗(yàn)中的污染預(yù)防及處理【精品文檔】PCR實(shí)驗(yàn)中的污染預(yù)防及處理一污染的預(yù)防進(jìn)行PCR 操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR 污染或杜絕污染的出現(xiàn)。（一）劃分操作區(qū)：目前，普通PCR 尚不能做到單人單管，實(shí)現(xiàn)完全閉管操作，但無(wú)論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR 的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：1. 標(biāo)本處理區(qū)，包括擴(kuò)增摸板的制備；2. PCR 擴(kuò)增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和PCR 擴(kuò)增；3. 產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定

2、的方向性。如：標(biāo)本制備PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析產(chǎn)物處理。切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)。（二）分裝試劑：PCR 擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來(lái)吸取擴(kuò)增后的DNA 和其他來(lái)源的DNA：1PCR 用水應(yīng)為高壓的雙蒸水；2引物和dNTP 用高壓的雙蒸水在無(wú)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制；3引物和dNTP 應(yīng)分裝儲(chǔ)存，分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因。（三）實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)

3、增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套；2. 使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR 產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；3. 避免反應(yīng)液飛濺，打開(kāi)反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開(kāi)蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；4. 操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度；5. 最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管；6. 操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR 反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性；

4、7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA 的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過(guò)程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR 產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)；8. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。二追蹤污染源如果不慎發(fā)生污染情況，應(yīng)從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染。（一）設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照：有利于監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，應(yīng)選擇擴(kuò)增弱，且重復(fù)性好的樣品，因強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照可產(chǎn)生大量不必要的擴(kuò)增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對(duì)照，100 個(gè)拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生

5、陽(yáng)性擴(kuò)增。陰性對(duì)照的選擇亦要慎重，因?yàn)镻CR 敏感性極高，可以從其它方法（Sourthern 印跡或點(diǎn)雜交等）檢測(cè)陰性的標(biāo)本中檢測(cè)出極微量的靶分子。此外，每次擴(kuò)增均應(yīng)包括PCR 體系中各試劑的時(shí)機(jī)對(duì)照，即包括PCR 反應(yīng)所需的全部成分，而不加模板DNA，這對(duì)監(jiān)測(cè)試劑中PCR 產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。如果擴(kuò)增結(jié)果中試劑對(duì)照為陽(yáng)性結(jié)果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時(shí)，要全部更換一批新的試劑進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)設(shè)立不同的反應(yīng)管，每一管含有一種被檢測(cè)試劑，在檢出污染試劑后，應(yīng)馬上處理。（二）環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了，如果預(yù)防措施比較嚴(yán)密，則考慮可能為環(huán)

6、境污染。環(huán)境污染中常見(jiàn)的污染源主要有：1. 模板提取時(shí)真空抽干裝置；2. 凝膠電泳加樣器；3. 電泳裝置；4. 紫外分析儀；5. 切膠用刀或手術(shù)刀片；6. 離心機(jī)；7. 冰箱門把手，冷凍架，門把手或?qū)嶒?yàn)臺(tái)面等；此時(shí)可用擦拭實(shí)驗(yàn)來(lái)查找可疑污染源。1）用無(wú)菌水浸泡過(guò)的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2）0.1ml 去離子水浸泡；3）取5ml 做PCR 實(shí)驗(yàn)；4）電泳檢測(cè)結(jié)果。8. 氣溶膠。如果經(jīng)過(guò)上述追蹤實(shí)驗(yàn)，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR 產(chǎn)物的氣溶膠造成的，此時(shí)就應(yīng)該更換實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所，若條件不允許，則重新設(shè)計(jì)新的引物（與原引物無(wú)相關(guān)性）。三污染處理（一）環(huán)境污染1. 稀酸處理法：對(duì)可疑

7、器具用1mol/L 鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA 脫嘌呤；2. 紫外照射（UV）法：紫外波長(zhǎng)（nm）一般選擇254/300nm，照射30min 即可。需要注意的是，選擇UV 作為消除殘留PCR 產(chǎn)物污染時(shí)，要考慮PCR 產(chǎn)物的長(zhǎng)度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV 照射僅對(duì)500bp 以上長(zhǎng)片段有效，對(duì)短片段效果不大。UV 照射時(shí)，PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會(huì)形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA 鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV 照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV 波長(zhǎng)，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點(diǎn)相鄰核苷酸的序列。在受照射的長(zhǎng)DNA 鏈上，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0.06

8、5/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA 鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA 斷裂等）均可終止Taq DNA 聚合酶的延伸。這些位點(diǎn)的數(shù)量與二聚體位點(diǎn)相當(dāng)。如果這些位點(diǎn)（ 0.13/堿基）在DNA 分子上隨機(jī)分布，一個(gè)500bp片段的DNA 分子鏈上將有32 處損傷位點(diǎn)，那么，105個(gè)這樣的分子中每個(gè)分子中會(huì)至少有一處損傷。相反，如果100bp 的片段，每條鏈上僅有6 處損傷，105個(gè)拷貝分子中將有許多分子沒(méi)有任何損傷。這就是UV 照射有一定的片段長(zhǎng)度限制的原因。（二）反應(yīng)液污染可采用下列方法之一處理：1. DNase I 法：PCR 混合液（未加模板和Taq 聚合

9、酶）加入0.5U DNase I，室溫反應(yīng)30min 后加熱滅活，然后加入模板和Taq 聚合酶進(jìn)行正常PCR 擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要知道污染DNA 的序列；2. 內(nèi)切酶法：選擇識(shí)別4 個(gè)堿基的內(nèi)切酶（如Msp I 和Taq I 等），可同時(shí)選擇幾種，以克服用一種酶只能識(shí)別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進(jìn)行PCR；3. 紫外照射法：未加模板和Taq 聚合酶的PCR 混合液進(jìn)行紫外照射，注意事項(xiàng)與方法同上述UV 照射法；4. g 射線輻射法：1.5kGy 的輻射可完全破壞0.1ng 基因組DNA，2.0 kGy 可破壞104 拷貝的質(zhì)粒分子，4.0 kGy 仍不影響PCR，但高于此限

10、度會(huì)使PCR 擴(kuò)增效率下降。引物可受照射而不影響PCR，g 射線是通過(guò)水的離子化產(chǎn)生自由基來(lái)破壞DNA 的。（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法由于UV 照射的去污染作用對(duì)500bp 以下的片段效果不好，而臨床用于檢測(cè)的PCR 擴(kuò)增片段通常為300bp 左右，因此UNG 的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。1. 原理：在PCR 產(chǎn)物或引物中用dU 代替dT。這種dU 化的PCR 產(chǎn)物與UNG 一起孵育，因UDG 可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG 對(duì)不含dU 的模板無(wú)任何影響。UNG 可從單或雙鏈DNA 中消除尿嘧啶，而

11、對(duì)RNA 中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無(wú)任何作用。2. dUTP 法：用dUTP 代替dTTP，使產(chǎn)物中摻入大量dU。在再次進(jìn)行PCR 擴(kuò)增前，用UNG 處理PCR 混合液即可消除PCR 產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG 在PCR 循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會(huì)影響含dU 的新的PCR 產(chǎn)物。3. dU 引物法：合成引物時(shí)以dU 代dT，這樣PCR 產(chǎn)物中僅5端帶dU。UNG 處理后，引物失去了結(jié)合位點(diǎn)而不能擴(kuò)增。對(duì)長(zhǎng)片段（1-2kb 以上）的擴(kuò)增用dUTP 法效率較用dTTP低，而用dU 法就可克服這一缺點(diǎn)。dU 引物最好將dU 設(shè)計(jì)在3端或近端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。4. 優(yōu)點(diǎn)：

12、可以去除任何來(lái)源的污染；UNG 處理可以和PCR 擴(kuò)增在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行；由于擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量dU 存在，可徹底消除污染源。5. 需注意的是摻入dUTP 的DNA不應(yīng)對(duì)產(chǎn)物的任何操作有影響，在進(jìn)行PCR 產(chǎn)物克隆時(shí)，應(yīng)該轉(zhuǎn)化UNG-（UNG 缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會(huì)被受體菌UNG 消化掉。（四）固相捕獲法用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì)，原理如下：1）用一生物素標(biāo)記的單鏈RNA 探針與待擴(kuò)核酸雜交，雜交區(qū)域是非擴(kuò)增區(qū)；2）用包被鏈霉親和素的固相載體來(lái)捕獲帶有生物素探針的雜交核酸，通過(guò)漂洗可去除污染的擴(kuò)增產(chǎn)物和雜質(zhì)；3）洗脫靶分子后用特異引物擴(kuò)增非RNA 探針雜交區(qū)域。第2）步的漂洗后可用PCR 檢測(cè)以確定標(biāo)本是否被擴(kuò)增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。（五）RS-PCR 法（RNA-specific PCR） 也稱為鏈特異性PCR，主要指用于RNA 模板的特異性PCR 法，該法可明顯降低假陽(yáng)性而不影響PCR 的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的3端（A 區(qū)）有2 0 個(gè)核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5端2 0 個(gè)核苷酸（C 區(qū)）為附加修飾堿基。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速離心使cDNA 與多余引物分開(kāi)，再用和第二引物（C）以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA，以后的PCR 循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B 區(qū)和引物C 進(jìn)行擴(kuò)增加尾cD