醫(yī)學分子生物學-上課用-11DNA損傷修復和基因突變

1、第第11章章 DNA損傷修復和基因突變損傷修復和基因突變 只有保持低水平的突變率，才能保證遺傳物質在世代間 的穩(wěn)定傳遞。 在生殖細胞中發(fā)生高突變幾率，則會毀滅這個物種；在 體細胞中發(fā)生高突變幾率，則會毀滅這一個體。 如果遺傳物質在世代間能夠絕對忠實地遺傳，將失去推 動生物進化的遺傳變異。 因此，生命及其生物多樣性的存在有賴于突變與修復之 間保持一個恰當?shù)钠胶狻Ｔ谶@章，我們主要學習引發(fā)突 變的原因，以及回復或糾正系統(tǒng)，從而確保遺傳物質受 到最低程度的損傷。 一、基因突變 名詞解釋： 誘變劑：能誘發(fā)產(chǎn)生突變的物理和化學因素； 突變：遺傳物質中不是由于遺傳重組產(chǎn)生的任何的 可遺傳的改變，這種改變能產(chǎn)

2、生一個突變表型； 突變體：指攜帶突變的生物個體或群體； 野生型：指沒有發(fā)生突變的基因； 突變型：指相對的某一性狀的野生型基因發(fā)生突變 后，所表現(xiàn)出來的性狀發(fā)生改變的表現(xiàn)型； 基因突變是DNA分子的堿基對序列發(fā)生改變的過程， 這種改變可以是較為簡單的單個堿基對的置換、插 入、缺失；也可以是較為復雜的某條染色體片斷的 重排、重復、缺失。突變可以自發(fā)發(fā)生，包括由自 然界的射線或復制時的錯誤引發(fā)；突變也可以利用 誘變劑在實驗條件下誘發(fā)。 (一). 可遺傳突變的分類 染色體突變 l染色體結構的變化：缺失、重復、倒位、易位 l染色體數(shù)目的變化：整倍體、非整倍體 1. 根據(jù)堿基改變的數(shù)目分類 染色體突變 D

3、NA點突變堿基的替換 轉換：4種 嘌呤 to 嘌呤 嘧啶 to 嘧啶 顛換：8種 嘌呤 to 嘧啶 嘧啶 to 嘌呤 AG TC AG TC 2. 根據(jù)編碼的氨基酸的順序的改變分類： 同義突變： 錯義突變： 無義突變： 移碼突變： F點突變的表型效應 同義突變(Synonymous mutation):基因突變導致 mRNA密碼子第三位堿基改變，但基因產(chǎn)物的序列不發(fā) 生改變； DNADNA 5-TCTCAA 3-AGAGTT TTTACG- 3AAA AAATGC- 5TTT 5-TCTCAA 3-AGAGTT TTTACG- 3AAG AAATGC- 5TTC 5-UCUCAAUUUACG-

4、 3AA A mRNA LysPhe ThrSer Glnpolypeptide 5-UCUCAAUUUACG- 3AA G LysPhe ThrSer Gln AAA AAA AAG AAG（LysLys） 5-TCTCAA 3-AGAGTT TTTACG- 3 AAATGC- 5 AA TT G C F點突變的表型效應 錯義突變(Missense mutation):基因突變導致mRNA密 碼子堿基被置換，導致基因編碼的氨基酸被替換，或功能 性的RNA序列發(fā)生改變。 DNADNA 5-TCTCAA 3-AGAGTT TTTACG- 3 AAATGC- 5 AA TT A T 5-UCUCA

5、AUUUACG- 3AAA mRNA LysPhe ThrSer Glnpolypeptide 5-UCUCAAUUUACG- 3AAG GluPhe ThrSer Gln AAA AAA（LysLys） GAAGAA（GluGlu） 5-TCTCAA 3-AGAGTT TTTACG- 3 AAATGC- 5 AA TT T A F點突變的表型效應 無義突變(Nonsense mutation):基因突變導致mRNA 密碼子堿基被置換成終止密碼子，引起多肽鏈合成的終止。 DNADNA 5-TCTCAA 3-AGAGTT TTTACG- 3 AAATGC- 5 AA TT A T 5-UCUCA

6、AUUUACG- 3AAA mRNA LysPhe ThrSer Glnpolypeptide 5-UCUCAAUUUACG- 3AAU StopSer Gln AAA AAA（LysLys） UAAUAA（StopStop） 突變改變了mRNA上的密碼子讀碼框 3x dNt 移碼突變 GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUCUGCUGCUGCUGCUGCUG AlaAlaAlaAlaLeuLeu LeuLeuLeuLeu AlaAlaAlaAlaAlaAla Deletion = 3x dNt= 3x dNt n x n x 氨基酸氨基酸 GCUGCUUGCUGCUGC

7、UGCA AUGUGC CA AUU GCUGCUGCUGCUGCGCA A AlaAlaAlaAlaCysCysCys Cys MeMe t t AlaAlaAla Ala HisHis 移碼突變：基因突變導致mRNA密碼子堿基被置換，引 起突變點之后的氨基酸順序全部發(fā)生改變。 F點突變的表型效應 正向突變：其突變方向是從野生型向突變型； 回復突變：其突變方向是從突變型向野生型； 3.根據(jù)突變表型和野生型比較，將點突變分為： 突變熱點：DNA分子上每一個部分發(fā)生突變的頻率 并不相同，在某些位點發(fā)生突變的頻率遠遠高于平均 數(shù)，這些位點稱為突變熱點。 自發(fā)突變是在不添加任何誘變試劑的情況下發(fā)生的

8、， 是由復制錯誤（或在DNA復制過程中其他事件）或 環(huán)境損傷引發(fā)的。 1. 自發(fā)突變 vDNA復制的錯誤 vDNA自發(fā)的化學改變 v轉座子的移動 (三).基因突變的分子機制 u復制中的損傷：指復制中堿基配對時發(fā)生誤差經(jīng) 過DNA pol校正和SSB等綜合因素作用下仍存在 的DNA損傷。 u增變基因（mutator）： 是與DNA復制、 DNA損傷修復以及錯配校正相關的基因。當這些 與保證DNA穩(wěn)定遺傳的相關基因突變后，必然會 增加其他基因的突變頻率。 (1).DNA 復制中的損傷 增變基因類別： DNA 聚合酶相關基因 3 5 編碼功能的基因 錯配修復系統(tǒng)的基因 MCE (mismatch c

9、orrection enzyme) DNA 損傷修復系統(tǒng)基因 錯配修復功能喪失 突變率升高 修復過程是基因突變的重要來源 修復過程是基因突變的重要來源 (2).堿基自發(fā)的化學改變 u 化學結構的變化 互變異構移位 脫嘌呤或脫氨基作用 u氧化作用損傷堿基 過氧化氫、羥基(-OH) 互變異構移位 嘌呤和嘧啶環(huán)中芳香族化合物的結構和它的OH 和 NH2 電荷豐富特性可導致異構體的產(chǎn)生，導致H的位 置移動。 自發(fā)點突變多半是由于嘌呤或嘧啶堿中氫原子的互變異 構移位引起的。在DNA復制中，這種移位會引起堿基配 對的改變。 imino form imino form 亞氨基形式亞氨基形式 amino fo

10、rm amino form 氨基形式氨基形式 NH2 N H H 腺嘌呤 NH N H H enolenol form form 烯醇烯醇式式ketoketo form form 酮酮式式 鳥嘌呤 O N H H2N OH N H H2N enolenol form form 烯醇烯醇式式ketoketo form form 酮酮式式 胸腺嘧啶 O N O CH3 H H OH N O CH3 H 胞嘧啶 NH2 N O H NH N O H H imino form imino form 亞氨基形式亞氨基形式amino form amino form 氨基形式氨基形式 A A（a a）= T

11、= T（k k）；）；GG（k k） C C（a a） A A（a a）= = C C（i i）； GG（k k） T T（e e） A A（i i）= = C C（a a）；）； GG（e e） T T（k k） 模板鏈中的稀有同分異構體與非互補的堿基配對， 在下一輪復制時，堿基對中錯配的堿基分開，然后 進行正常的堿基互補配對，最終導致置換突變。 A(a) T(k) A(a, anti) T(k, anti) C(i) C(a, anti) A(a) A(a, anti) 堿基異構式引起DNA的錯配突變 C(i) C(a) G(k, syn) G(k, syn) G(k, anti) G(k

12、) 脫嘌呤或脫氨基作用 p脫嘌呤：指在完整的雙螺旋DNA分子中失去含氮的 堿基，經(jīng)常是失去嘌呤。這些位點被稱為嘌呤位點 （AP位點） 。 O CH2 OHH 1 9 CH2 H O O P OH O O NH2 G p脫氨基作用是從堿基上去除一個氨基基團。 NH2 O H HH2 2OO NH2 O O H CU HH2 2OO NH2 NH2 O H CH3 O O H CH3 T5mC 突變熱點 物理誘變劑 高能電離輻射X、 非電離輻射紫外線 2.誘導突變 化學誘變劑 抑制堿基合成：5-氨基尿嘧啶 堿基類似物：5-BrU、2-AP 堿基修飾劑：NA、HA、烷化劑 嵌入試劑：吖啶橙AO、EB

13、 衛(wèi)星搭載誘變衛(wèi)星搭載誘變: : 高真空、強輻射、微重力高真空、強輻射、微重力 dNtdNt電荷及結構改變電荷及結構改變 p(1).電離輻射 射線和x射線的能量較高 直接影響DNA分子，引起堿基結構改變 p (2). 紫外線 紫外線照射會引起同一條紫外線照射會引起同一條DNADNA鏈上相鄰的嘧啶堿基發(fā)鏈上相鄰的嘧啶堿基發(fā) 生共價交聯(lián)而形成嘧啶二聚體生共價交聯(lián)而形成嘧啶二聚體（TTTT）。）。 CC、CT、TC二聚體同樣可以通過紫外線產(chǎn)生， 但是數(shù)量很少。 O O CH3 H O O CH3 H O O CH3 H O O CH3 H O O 1 2 3 4 5 6 5 6 p(3).堿基類似物

14、 堿基類似物結構與DNA中的正確堿基相似 5溴尿嘧啶是T的類似物，這種堿基替代物的出現(xiàn) 可以以烯醇式的形式與G配對。 O O Br H enolenol form form 烯醇烯醇式式ketoketo form form 酮酮式式 OH O Br H O H N H H G (k)G (k) H 5-BrU (e)5-BrU (e) O O Br H H A A（a a） N H H H H 5-BrU (K) O O Br H H 錯配 u復制的錯誤:可以導致AT向GC的轉換突變 A (a) T T (k) 5-BrU(k) A (a) 5-BrU(k)5-BrU(e) G (k) G (

15、k) C (a) u摻入錯誤： GC向AT的轉換突變。 G (k) C (a) G (k) 5-BrU(e) 錯配 5-BrU(e)5-BrU(k) A (a) A (a) T T (k) 5BrU5BrU誘發(fā)誘發(fā) 復制錯誤復制錯誤 的突變頻率低于誘發(fā)的突變頻率低于誘發(fā) 摻入錯誤摻入錯誤 的突變頻率的突變頻率. . 2-AP2-AP H N H H H O O CH3 H T (k)T (k) 2-氨基嘌呤(2-AP)是另一種腺嘌呤類似物，也有氨 式a和亞氨式i兩種異構體。 正常情況下可發(fā)生2-APa=T。但在DNA復制的過程 中C偶爾會取代T，發(fā)生2-APi Ca。 p(4).堿基修飾劑 u

16、脫氨基試劑: HNO2 u羥基化試劑: NH2OH u烷基化試劑: EMS、MMS HNOHNO2 2 GG N H H O H H O H H H O N O H H H xanthine黃嘌呤黃嘌呤 NH2 O H O O H HNOHNO2 2 C CUU H H H N H H A A p Nitrous acid （HNO2）脫氨基試劑 CG CG T TA A p Nitrous acid Nitrous acid （HNOHNO2 2） p NH2OH (HA 羥胺，羥基化試劑) O H C C NH H NHNH2 2OHOH H H N H H A A HO O H H N-

17、 O H HNOHNO2 2 A A H H C C N H H HypoxanthineHypoxanthine H H H ONH H A AT T GCGC CGCG T TA A 次黃嘌呤次黃嘌呤 uEMS(EMS(甲基磺酸乙酯甲基磺酸乙酯 ) ) ，MMS (MMS (甲基磺酸甲基磺酸 甲酯甲酯) )等烷化劑都帶有等烷化劑都帶有1 1個或多個活潑的個或多個活潑的 烷基，這些烷基能夠加入堿基的許多位烷基，這些烷基能夠加入堿基的許多位 置形成烷基化堿基，改變氫鍵的結合能置形成烷基化堿基，改變氫鍵的結合能 力。力。 p Alkylation agents 烷基化試劑 EMS (Ethyl

18、methane sulfanate) 乙基甲烷磺酸乙基甲烷磺酸 O H3C S O OCH2CH3 MMS(methyl methane sulfanate) 甲基甲烷磺酸甲基甲烷磺酸 O H3C S O OCH3 SM (Sulfur Mustards gas） 硫芥子氣硫芥子氣 H S CHCH2 2CHCH2 2ClCl CHCH2 2CHCH2 2ClCl Nitrogen Mustards gas 氮芥子氣氮芥子氣 H3C N CHCH2 2CHCH2 2ClCl CHCH2 2CHCH2 2ClCl 嵌入劑是含有幾個多元環(huán)的扁平分子。易于在 DNA復制過程中插入到dNMP分子之間。

19、 能與DNA中同樣是扁平分子的嘌呤或嘧啶堿基結 合，就如在雙螺旋中的堿基相互結合或堆積那樣。 EB (Ethidium Bromide，溴化乙錠) p (5).嵌入劑 AO (Acridine Orange，吖啶橙 ) Proflavin 原黃素 NH2H2N C2H5 Ethidium Bromide H2NNH2 H 原黃素 (CH3)2NN(CH3)2 H Acridine Orange AO (Acridine Orange) AO (Acridine Orange) 扁平分子扁平分子 EB (Ethidium Bromide)EB (Ethidium Bromide) -ATTTTT

20、CG - -TAAAAAGC- -A TTTCG - -T AAAGC- TAO T -AT EB TTTTCG- -TA 分子插入分子插入 AO E B -ATTTCG - -TAAAGC- -ATXTTTTCG- -TAX AAAAGC- X AAAAGC - 5 基因突變的一般特征基因突變的一般特征 基因突變表現(xiàn)出以下的普遍特征：基因突變表現(xiàn)出以下的普遍特征： |(1) (1) 突變的重演性和可逆性突變的重演性和可逆性 |(2) (2) 突變的多方向性與復等位基因突變的多方向性與復等位基因 |(3) (3) 突變的有害性和有利性突變的有害性和有利性 |(4) (4) 突變的稀有性突變的稀

21、有性 基因的定點誘變 oligo-dNt 介導的定介導的定 點誘變點誘變 合成與目標基因某區(qū)合成與目標基因某區(qū) 段互補，并含突變位段互補，并含突變位 點的點的oligo-dNt 可穩(wěn)定遺傳的定點突 變基因 二、保證遺傳穩(wěn)定性的機制 DNA損傷修復 DNA損傷是指DNA結構發(fā)生的任何改變。 (一). 避免差錯的DNA損傷修復 光復活反應 切除修復 重組修復 校讀作用錯配修復 交聯(lián)的修復 (二).傾向錯誤的DNA損傷修復 應急修復系統(tǒng)(SOS) (一). 避免差錯的DNA損傷修復 1.光復活修復復制前修復、直接修復 修復發(fā)生在320-370nm(藍光)的可見光中。 C GCA ATA GT TA

22、TC GCA ATA GT TA TC GCA ATA GT TA T + 光復活酶通過生色基團（N，N-二甲基四氫葉酸）吸收 光能，將能量傳遞給FAD， FADH2通過電子轉移引發(fā) 二聚體的裂解。 主要用來修復胸腺嘧啶二聚體 A G C G T A T C G C A T CH3 uDNA損傷的直接修復 HS Enzyme + A G C G T A T C G C A T + O6-甲基鳥嘌呤甲基轉移酶可防止烷化劑所致的死亡和突 變效應。 通過把甲基從O6-甲基鳥嘌呤上直接轉移到酶 的Cys殘基上直接修復DNA損傷。反應完成后酶失活。 EnzymeS CH3 2. 切除修復復制前修復 u堿

23、基切除修復（BER） u核苷酸切除修復（NER） F切除修復是指在一系列酶的作用下，切除錯誤的堿 基或錯誤核苷酸，然后以另一條完整的互補鏈為模板， 重新合成切去的部分，使損傷DNA恢復正常結構的 過程。是生物體主要的修復方式。 堿基切除修復（BER） -尿嘧啶 N-糖苷酶修復 （1）糖苷酶切斷糖苷鍵， 釋放出損傷堿基，產(chǎn)生 AP位點 （2）AP內(nèi)切酶在AP位點 切開磷酸二酯鍵 （3）外切酶進一步切割 （4）DNA聚合酶、 DNA連接酶填充缺口 5 3 53 U* 53 AP 位點 53 ungase 53 AP內(nèi)切核酸酶 53 53 53 5 5 3 3 進一步酶切 DNA Pol 和連接酶

24、堿基切除修復（BER） uN-糖苷酶與DNA損傷修復 N-糖苷酶有很多種，如E.coli的3-甲基腺嘌呤 -DNA糖苷酶，對于7-甲基鳥嘌呤、3-甲基鳥 嘌呤和7-甲基腺嘌呤也有作用。 3-甲基腺嘌呤-DNA糖苷酶，專門作用于3- 甲基腺嘌呤。 UvrB A UvrB AA UvrB AA UvrB A (in E.coli)核苷酸切除修復uvrA、B、C 5 UvrB 3 C Nick Nick 53 5353 UvrAB識別嘧啶二聚體和較大的損傷并與之結合，DNA骨架彎曲。 UvrA離開復合體， UvrB和UvrC結合，在損傷的5側和3側產(chǎn)生切口。 UvrD(解旋酶)將損傷鏈釋放出來，DN

25、A pol填補缺口。 著色性干皮病(XP) 切除修復缺陷的遺傳病 XP病人細胞對嘧啶二聚 體和烷基化的清除能力降 低，不能修復紫外線照射 引起的DNA損傷，表現(xiàn)為 皮膚光敏和早發(fā)性肉瘤。 跳過損傷部位 新鏈產(chǎn)生的缺口由母鏈通過重 組方式彌補 原損傷部位并沒有切除， 但在后代逐漸稀釋 3. 重組修復復制后修復 RecA蛋白引起的DNA鏈的交換 4. 校讀作用錯配修復系統(tǒng)MRS DNA mismatch + + - A A- - - -C C- DNA pol (= 10-8) 經(jīng)第二次校正= 10-11 Mismatch Repair System p Dam甲基轉移酶， 由dam基因編碼，催化

26、5-GATC- 3中A的甲基化，保證DNA免受限制性核酸內(nèi)切酶Mbo I的切斷，同時在DNA復制時也起一定的輔助作用。 p MCE-錯配修復酶 ：Mut HLS 掃描新生鏈中錯配堿基 識別新生鏈中非 m6A 的GATC序列 酶切含錯配堿基的新生DNA區(qū)段 mutS MCE scanning endonuclease Polymerase ligase GATC GATC CTAG CTAG T C GATC GATC CTAG CTAG T GATC GATC CTAG CTAG T A mutH mutL MutH內(nèi)切核酸酶與MutSL結合，切割未甲基化的鏈， 從GATC到錯配位點之間的序列

27、被切除。 若錯配位于切割點5側，未甲基化鏈由核酸內(nèi)切酶從 斷裂點按35方向對DNA鏈進行降解直至 除去錯配 堿基。 若錯配位于切割點3側，未甲基化鏈由核酸外切酶或 RecJ蛋白從斷裂點按53方向對DNA鏈進行降解直至 除去錯配堿基。 所有錯配都可由這一系統(tǒng)修復，但其中以 G-T錯配修復更為有效，C-C錯配的修復為弱。 由于要降解和置換1000或更多堿基對，這 種修復代價顯然是高的，但這也說明修復的重 要，細胞為此不惜代價。 Jeam Weigle 發(fā)現(xiàn)：Weigle復活效應或W-效應 UV 感染 細菌(用UV照射過) 存活率高 噬菌體 細菌(UV未照射過) 存活率低 這些效應是經(jīng)紫外線誘導產(chǎn)生

28、的，稱為SOS反應 SOS反應：當生物處于極度逆境下，DNA分子受到 較大范圍損傷，細胞會應急產(chǎn)生一系列負責的誘導 效應。 高頻突變被SOS修復 傾向差錯修復(Error-prone) 5. 應急修復反應-SOS反應 DNA 損傷 50 X 誘導信號 RecA 降解 LexA SOS UmuC 突變 LexA RecA,UmuC等11個基因 Neg. repression -UVDNA損傷信號(S.S. DNA tail or 5Nt S.S.DNA) lexArecAumuC lexArecA umuC 紫外線/絲 裂霉素C 少量表達 高效表達 1) 誘導前 2) 誘導 RecA消除LexA

29、的阻遏后，首先轉錄uvrA、sulA等基因， 切除修復加強；SulA則抑制細胞分裂。 LexA的進一步分解，使更多SOS網(wǎng)絡中的基因表達。 RecA蛋白： 兩種功能 與單鏈DNA結合活性與DNA重組有關 蛋白酶活性：可分解LexA蛋白；只有當少量的 RecA與受損的單鏈結合后，此活性被激活。 LexA蛋白： 阻遏蛋白 能阻遏與SOS反應有關的一系列基因。 RecA蛋白酶活性很 快降低 lexA基因高水平 表達 SOS 基 因關閉 3) 恢復狀態(tài) 誘導信號去除 細胞恢復 正常狀態(tài) 當DNA復制受阻/ DNA damaged 能量大量消耗 細胞內(nèi)原少量表達的RecA與S.S, DNA結合 激活RecA的蛋白酶活性 修復損傷修復損傷 LexA-p降解 RecA-p高效表達 50 times up SOS open SOS反應： DNA復制時遇到損傷位點并不停下或跳過，而是 繼續(xù)向前復制，但并不保證堿基配對的準確性。是 一種但求保命的應急行為。又稱為差錯傾向修復 修復過程復雜，涉及l(fā)exA、recA、uvr等20多種 基因產(chǎn)物。 2. RecA蛋白起作用的修復機制是（蛋白起