單個(gè)核細(xì)胞分離凍存及復(fù)蘇.doc

1、1、外周血單個(gè)核細(xì)胞Ficoll 分離：向 Ficoll 分層液離心管中加入稀釋的血液樣本，1500rpm ，5min 離心機(jī)離心；i用毛細(xì)吸管輕輕插入灰白色層，沿管壁輕輕吸出該層的單個(gè)核細(xì)胞，盛入另一支離心管中， 將所得的單個(gè)核細(xì)胞懸液用5 倍體積的 Hanks液或 RPMI-1640 洗滌 2 次， 1500rpm，5min；用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞至所需濃度；淋巴細(xì)胞濃度濃度（細(xì)胞數(shù)/mL）=四個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞數(shù) /4 10 4 2、細(xì)胞凍存：小牛血清的凍存培養(yǎng)液；20%10 或甘油、 10%DMSO）配制含 1（ 2）取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞， 用胰蛋白酶把單層生長的細(xì)胞消化

2、下來，懸浮生長的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至 15ml 離心管中、；（ 3）離心 1000rpm，5min；（ 4）去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻， 計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5106/ml 1 107/ml；（5） 將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管11.5 ml；（6）在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者；7. 凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1-2/ min ；當(dāng)溫度達(dá) -25以下時(shí)， 可增至 -5 -10/min ；到-100時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入 -20冰箱 2h ，然后放入 -80冰箱中過夜，取出凍存管，移入

3、液氮容器內(nèi)。3、細(xì)胞復(fù)蘇：（ 1）從液氮容器中取出凍存管，直接浸入 37溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。（ 2）從 37水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加 10 倍以上培養(yǎng)液，混勻；（ 3）離心， 1000rpm，5min；（ 4）棄去上清液，加入含 10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶， 37培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；（ 5）次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。、注意事項(xiàng)： 4（ 1）從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但最好為對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液；（ 2）將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護(hù)工作，以

4、免凍傷；（ 3）凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。（ 4）細(xì)胞分層液應(yīng)避光 4下保存，取出后逐漸升至室溫后混勻，方可使用，避免細(xì)菌污染。（ 5）稀釋血液可降低紅細(xì)胞的凝集，提高淋巴細(xì)胞售貨量，但是如果要保留血漿成分作為其他實(shí)驗(yàn)用時(shí)， 則不能稀釋血液， 以免影響血漿成分。5、所需材料：（1）儀器：凈化工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱（ 4、-20、-80）、倒置相差顯微鏡、 培養(yǎng)箱、液氮冰箱（ 2）玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸（ 3）塑料器皿： 吸頭、槍頭、膠塞、 移液管（ 10ml）、15ml 離心管、凍存管（ 12ml）其他物品：微量加樣槍、紅血球計(jì)數(shù)板、記號(hào)筆、醫(yī)用橡皮膏、移液槍（5）試劑 :D-Hanks液、小牛血