常用限制性內切酶酶切位點保護殘基

1、酶切位點保護堿基-PCR引物設計用于限制性內切酶發(fā)布：2010-05-24 20:19|來源：生物吧|編輯：劉浩|查看：161 次本文給出了分 子克隆中常用限制 性內切酶的保護堿基 序列，如Accl , Afllll , Asci , Aval ，BamHI ，Bglll ，BssHll ，BstEll ，BstXl ，Clal，EcoRl，Haelll ，Hindlll ，Kpnl ，Mlul，Ncol，Ndel，Nhel，Notl，Nsil，Pacl，Pmel ，Pstl，Pvul ， Sacl ， Sacll ， Sall ， Scal ， Smal ， Spel ， Sphl ， St

2、ul ， Xbal ，Xhol ，Xmal ，為什么要添加保護堿基？在分子克隆實 驗中，有時我們會在待擴增的目的基因片段兩端加上特定的酶切位點，用于后續(xù)的酶切和連接反應。由于直接暴露在末端的酶切位點不容易直接 被限制性核酸內切酶切開，因此在設計PCR引物時，人為的在酶切位點序 列的5端外側添加額外的堿基序列，即保護堿基，用來提高將來酶切時的 活性。其次，在分子克隆實驗中選擇載體的酶切位點時，相臨的兩個酶切位點往往不能同時 使用，因為一個位點切割后留下的堿基過少以至于影響旁邊的酶切位點切害嘰該如何添加保護堿基？添加保護堿基時，最關心的應該是保護堿基的數(shù) 目，而不是種類。什么 樣的酶切位點，添加幾

3、個保護堿基，是有數(shù)據可以參考的。添加什么保護 堿基，如果嚴格點，是根據兩條引物 的Tm值和各引物的 堿基分布 及GC含量。如果某條引物 Tm值偏小，GC%較低，添加時多加 G或C，反之亦反。為了解不同內 切酶對識別位點以外最少保護堿基數(shù)目的要求，NEB采用了一系列含識別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進行實驗。實驗結果對于確定雙酶切順序將會有幫助（比如在多接頭上切割位點很接近時），或者當切割位點靠近DNA末端時也很有用。在本表中沒有列出的酶，則通常需在識別位點兩端至少加上 6個保護堿基，以確保酶切反應的進行。實驗方法：用y- 32 PATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下標記0.1A 260單位的

4、寡核苷酸。取1 g已標記了的寡核苷酸與 20單位的內切酶，在 20 C條件下分別反 應2小時和20小時。反應緩沖液 含70mM Tris-HCl （pH 7.6）,10 mM MgCl 2 , 5 mMDTT 及適量的 NaCI 或 KCl （視酶的具體要求而定）。20%的PAGE （ 7M尿素）凝膠電泳分析，經放射自顯影確定酶切百分率。本實驗采用自 連接的寡核苷酸作為對照 。若底物有較長的回文結 構，切 割效率則可能 因為出現(xiàn)發(fā)夾結構而降低。酶寡核苷酸序列切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCGACCo0CGGTC GACCGo0CCGGTC GACCGGo0Afl IIICACATG

5、TGo0CCACATGTGG9090CCCACATGTGGG9090Asc IGGCGC GCC9090AGGCGC GCCT9090TTGGCGC GCCAA9090Ava ICCCCGGGG5090CCCCCGGGGG9090TCCCCCGGGGGA9090BamH ICGGATCCG1025CGGGATCCCG9090CGCGGATCCGC G9090Bgi IICAGATC TGGAAGATC TTCGGAAGATCTTCC0752509090BssH IIGGCGC GCCAGGCGC GCCTTTGGCGC GCCAA00500090BstE IIGGGT(A/T)ACCC010B

6、stX IAACTGCAGAACCAATGCATTGGAAAAC TGCAGCCAATGCATTGGAACTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT0252505090Cla ICATC GATGGATC GATCCCATCGATGGCCCATCGATGGG009050009050EcoR IGGAATTCCCGGAATTCCGCCGGAATTCCGG909090909090Hae IIIGGGGCCCCAGC GGCC GCTTTGCGGCCGCAA909090909090Hi nd IIICAAGC TTG00CCAAGC TTGG00CCCAAGCTTGGG1075Kpn IGG

7、GTACCC00GGGGTACCCC9090CGGGGTACCCCG9090Mlu IGAC GCGTC00CGACGC GTCG2550Neo ICCCATGGG00CATGCCATGGCATG5075Nde ICCATATGG00CCCATATGGG00CGCCATATGGC G00GGGTTTC ATATGAAACCC00GGAATTCCATATGGAATTCC7590GGGAATTCCATATGGAATTCCC7590Nhe IGGCTAGCC00CGGC TAGCCG1025CTAGC TAGC TAG1050Not ITTGCGGCCGCAAATTTGC GGCCGC TTTAAA

8、ATATGC GGCCGC TATAAAATAAGAATGCGGCCGCTAAAC TATAAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA010102525010109090Nsi ITGCATGCATGCACCAATGCATTGGTTCTGCAGTT10909090Pac ITTAATTAAGTTAATTAACCCTTAATTAAGG00002590Pme IGTTTAAACGGTTTAAACCGGGTTTAAACCCAGC TTTGTTTAAACGGCGC GCCGG000750255090Pst IGC TGCAGCTGCAC TGCAGTGCAAACTGCAGAACCAATGC

9、ATTGGAAAAC TGCAGCCAATGCATTGGAACTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT0109090001090900Pvu ICCGATCGG00ATC GATC GAT1025TC GCGATC GCGA010Sac ICGAGCTC G1010Sac IIGCCGCGGC00TCCCCGCGGGGA5090Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC00GCGTC GAC GTC TTGGCCATAGC GGCCGCGG1050ACGCGTC GAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA1075Sca IGAGTAC TC1025A

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