染色體微陣列分析在單純不良孕產(chǎn)史孕婦產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用(全文)

1、染色體微陣列分析在單純不良孕產(chǎn)史孕婦產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用（全文）我國(guó)母嬰保健法規(guī)定，對(duì)曾經(jīng)分娩過(guò)先天性嚴(yán)重缺陷嬰兒的孕婦應(yīng)進(jìn)行產(chǎn)前診斷 。先天缺陷兒發(fā)生的病因復(fù)雜，遺傳學(xué)異常是造成 先天缺陷的重要原因。目前產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷的主要方法是染色體微陣列分析（ chromosomal microarray an alysis, CMA），其檢測(cè)范圍包括了部分染色體病和基因組病，一些臨床指南認(rèn)為該技術(shù)可用于所有需要產(chǎn)前診斷的孕婦2-3。由此產(chǎn)生了一種認(rèn)知，認(rèn)為不 良孕產(chǎn)史的孕婦均需要進(jìn)行產(chǎn)前CMA檢測(cè)。然而，不良孕產(chǎn)史的遺傳學(xué)病因復(fù)雜多樣，包括染色體病、基因組病、單基因病等，而CMA并不能覆蓋所有遺傳異常。對(duì)

2、于不同病因造成的不良孕產(chǎn)史， 再次妊娠時(shí)，如胎兒未出現(xiàn)明確的CMA檢測(cè)指征（如超聲結(jié)構(gòu)異常）時(shí)，CMA 檢測(cè)是否可成為普適性的檢測(cè)值得思索。本研究總結(jié)單中心6年間單純因“不良孕產(chǎn)史”行CMA檢測(cè)的病例，分析不同先證者遺傳學(xué)病因時(shí)CMA產(chǎn)前診斷的異常檢出情況，探討CMA在單純不良孕產(chǎn)史孕婦中應(yīng)用的注意事項(xiàng)。一、資料與方法1. 研究對(duì)象：2014年6月至2020年7月間，共5 563例孕婦在南京 大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院應(yīng)用CMA進(jìn)行產(chǎn)前診斷，本研究回顧性納入其中單純因“不良孕產(chǎn)史”既往生育/妊娠異?；純?胎兒（遺傳學(xué)診 斷明確或不明確）進(jìn)行產(chǎn)前診斷的病例。納入標(biāo)準(zhǔn)：既往生育或妊娠出生缺陷患兒，本次

3、妊娠已進(jìn)行超聲檢查確定宮內(nèi)妊娠，且暫未發(fā)現(xiàn)胎兒有明確異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：（ 1 ）此次妊娠產(chǎn)前篩查實(shí)驗(yàn)提示“高風(fēng) 險(xiǎn)”；（2 ）不良孕產(chǎn)史僅是反復(fù)早孕期自然流產(chǎn)。最終納入孕婦169例（胎兒 172 例），包括 2 例雙胎妊娠孕婦和 1 例孕婦 2 次單胎妊娠。 所采集樣本 27 例為絨毛， 145 例為羊水。孕婦年齡為（ 32.3 4.68 ） 歲（ 2353 歲）。2. CMA 檢測(cè)方法：基因組 DNA 提取、 CMA 實(shí)驗(yàn)及分析、驗(yàn)證流程 按本中心常規(guī)操作流程 4 進(jìn)行。所用芯片為 Affymetrix CytoScan 750K （美國(guó) ThermoFisher 公司），分析軟件為 ChAS

4、 4.0 ?？截悢?shù) 變 異 （ copy number variations, CNVs ）的 性 質(zhì) 主 要 依 據(jù) ClinGen2019 年頒布的指南 5 進(jìn)行判讀。 CNVs 的報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)為：（ 1 ） 在具有重要臨床意義的區(qū)域，DNA拷貝缺失100 kb ; （ 2）在已知具有重要臨床意義的區(qū)域外，連續(xù) DNA 拷貝缺失達(dá) 500 kb 以上，連 續(xù)拷貝重復(fù)達(dá) 1 MB 以上（在這些區(qū)域內(nèi)的探針密度達(dá)到每 100 kb 具有 20 個(gè)以上探針，同時(shí)存在一個(gè)在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳基因）。3. 分組及分析：根據(jù)先證者遺傳學(xué)異常的類(lèi)型和遺傳來(lái)源以及CMA預(yù)期檢出情況，分為高風(fēng)險(xiǎn)組、低風(fēng)險(xiǎn)組和風(fēng)險(xiǎn)

5、不明組。高風(fēng)險(xiǎn)組 19 例，包括先證者為父母來(lái)源的病理性 CNVs 11 例，先證者為父 /母來(lái) 源的染色體異常 8 例；低風(fēng)險(xiǎn)組 113 例，包括先證者全外顯子測(cè)序和/ 或 CMA 未發(fā)現(xiàn)異常 6 例，先證者為明確的單基因病 31 例，新發(fā)致病性CNVs 47例，新發(fā)染色體異常29例；風(fēng)險(xiǎn)不明組 40例，先證者均未進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)。見(jiàn)表1表1不良孕產(chǎn)史病因分類(lèi)及染色體微陣列分折 產(chǎn)前診斷異常檢出情況分組及先證者情況例數(shù)檢出異常胎兒例數(shù)商風(fēng)險(xiǎn)組19R遺傳性荷切數(shù)變界116父母來(lái)源的遺傳科訕色體異常2低鳳險(xiǎn)組1131全外妊于組測(cè)序丿染色體微陣列分折木見(jiàn)并常&0單基胃病310常染色林顯性遺傳性疾病9

6、0常湮色體隱性遺傳性疾病160X連犠遺傳性挨病51新發(fā)挎処數(shù)變界470新發(fā)染色體舁常29021-三體生育史140性染色體界第3(其他120風(fēng)險(xiǎn)不明組400先證看未行遺傳學(xué)檢測(cè)400合計(jì)1729注；包括 1 例先證者 der(21;21)(ql0;ql0)型 21-三休.我父小染色休為45AYJ&r(2L2l)(qlO:qlO)女方再婚疳妊皈行產(chǎn)前 診斷二、結(jié)果172 例胎兒中， CMA 共檢出異常 9 例，占 5.2% 。見(jiàn)表 1。1. 高風(fēng)險(xiǎn)組： 19 例中檢出異常 8 例。其中先證者為遺傳性 CNVs 者11 例中，檢出 6 例胎兒異常，均與父母所攜帶的異常相關(guān)。先證者為 父母來(lái)源的遺傳性

7、染色體異常 8 例中檢出異常 2 例。其中 1 例(表 2 例 7 )因前次妊娠外院 CMA 提示 4p- 三體要求產(chǎn)前診斷，行 CMA 檢 測(cè) 前 未 行超 聲 結(jié) 構(gòu) 篩 查 和 雙親 遺 傳 學(xué) 檢 測(cè) ， 羊水 CMA 提 示 arrGRCh37 4p16.3q11(68,345-52,685,982)X3，夫妻雙方染色體檢查提示男方染色體為 46,XY,t(4;14)(p10;q10)，證明胎兒 CMA 異常與其父親染色體異常相關(guān)； 另 1 例(表 2 例 8) CMA 提示為 21- 三體， 先證者胎兒染色體為 46,XX,+21,der(21;21)(q10;q10) ，夫妻雙方

8、染 色體檢查發(fā)現(xiàn)男方染色體為 45,XY,der(21;21)(q10;q10)。 CMA 檢出異常胎兒情況見(jiàn)表 2 。2. 低風(fēng)險(xiǎn)組： 113 例中檢出 1 例異常(表 2 例 9)， CMA 結(jié)果為arrGRCh3722q11.22q11.23(22,997,928-25,002,659) X 3 ， 為22q11.22q11.23 微重復(fù)， 屬于新發(fā)變異， 該家系先證者為 Duchenne 肌營(yíng)養(yǎng)不良( Duchenne muscular dystrophy, DMD)基因變異。3. 風(fēng)險(xiǎn)不明組：未檢出 CMA 異常胎兒。 2 g PT，色佯逆阡刖打忻姑甲亓松骯兒*j孕卵BED卽娠神此C

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11、三、討論CMA除可檢出染色體水平的劑量改變外，還可檢出傳統(tǒng)G顯帶染色體分析無(wú)法檢出的亞顯微水平的變異，分辨率提高了近 100倍。CMA可檢出100400 kb以上的基因組不平衡改變（缺失 /重復(fù)），包括 染色體非整倍體改變、整倍體改變以及基因組小片段缺失或重復(fù)。1. CMA可作為染色體異?；蚧蚪M不平衡家系產(chǎn)前診斷的一線方法： 經(jīng)典的細(xì)胞遺傳學(xué)理論認(rèn)為，相互易位個(gè)體可形成18種配子，僅 2種為基因組平衡的配子。但是由于其中一些配子無(wú)法受孕，因此對(duì)于大多數(shù)易位來(lái)說(shuō)，活產(chǎn)兒異常的風(fēng)險(xiǎn)小于理論風(fēng)險(xiǎn)。一般來(lái)說(shuō)，因 活產(chǎn)兒異常而進(jìn)行雙親染色體檢查發(fā)現(xiàn)的易位攜帶者，再孕時(shí)約有5%30% 的風(fēng)險(xiǎn)生育基因組不

12、平衡的后代7】。本研究中8例因雙親之一染色體易位而導(dǎo)致不良孕產(chǎn)史的孕婦中，1 例在早孕期行絨毛活檢CMA 檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)了與易位相關(guān)的病理性變異， 繼而在中孕期超聲檢查 中 發(fā) 現(xiàn) “胎 兒 室 間 隔 缺 損 ”； 另 1 例 父 親 染 色 體 異 常 45,XY,der(21;21)(q10;q10)， 理 論 上 分 裂 時(shí) 可 產(chǎn) 生 帶der(21;21)(q10;q10) 和不帶 der(21;21)(q10;q10) (即 21 號(hào)染色體 缺失)的 2 種配子。由于 21- 單體胚胎難以存活，因此可存活至中孕 期的幾乎都是 21- 三體。當(dāng)然，對(duì)于染色體相互易位造成子代不平衡 易位

13、而導(dǎo)致的表型效應(yīng)，應(yīng)進(jìn)行個(gè)體分析。本組病例數(shù)有限，尚不足 以展開(kāi)討論。 需要注意的是， CMA 無(wú)法區(qū)分平衡易位攜帶者和核型正 常者。親本來(lái)源的 CNVs ，理論上再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)為 50% 。本研究中， 11 例先證者 的 CNVs 由父/母遺傳而來(lái)， 再次妊娠時(shí)產(chǎn)前 CMA 檢測(cè)檢出 6 例異常。 即使在同一家系中，攜帶同一 CNVs 的個(gè)體之間，也可出現(xiàn)表型的差 異。因此，不能以親本的表型來(lái)推測(cè)胎兒的表型。胎兒表型因受到發(fā) 育階段和影像學(xué)檢查的局限，即使 CNVs 與超聲結(jié)構(gòu)異常高度相關(guān)， 通常也需要在中晚孕期才能發(fā)現(xiàn)， 如本研究中 17q12 缺失的多囊腎家 系(表 2 例 1 )。對(duì)于遺傳性

14、 CNVs ，早孕期通過(guò)絨毛穿刺進(jìn)行 CMA 檢測(cè)，可以將診斷時(shí)間大大前移。因此， CMA 檢測(cè)可作為這一組孕婦 的一線產(chǎn)前檢測(cè)手段 32. 低風(fēng)險(xiǎn)組孕婦 CMA 異常檢出率與無(wú)產(chǎn)前診斷指征孕婦相當(dāng)：大樣 本臨床研究和 meta 分析發(fā)現(xiàn)，即使羊水染色體核型正常，超聲也沒(méi) 有異常發(fā)現(xiàn)， CMA 仍可檢出 0.5%1.7% 的病理性變異 8-9 ，因此美 國(guó)母胎醫(yī)學(xué)會(huì)認(rèn)為所有進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷的孕婦均可選擇 CMA 10 。我國(guó)最新發(fā)布的“拷貝數(shù)變異檢測(cè)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用指南” 也明確列出了若干適應(yīng)證， 不明原因的不良孕產(chǎn)史即是適應(yīng)證之一 3 。 本研究 113 例低風(fēng)險(xiǎn)孕婦中僅 1 例孕婦在進(jìn)

15、行羊水單基因病 （前一胎 兒 DMD 基因變異，孕婦為攜帶者）檢測(cè)同時(shí)行 CMA ，意外檢出胎兒 新發(fā) 22q11.22-q11.23 重復(fù)， 該變異攜帶者個(gè)體表型輕重不等， 呈現(xiàn) 出從正常至嚴(yán)重發(fā)育落后、語(yǔ)言發(fā)育遲緩的譜系。低風(fēng)險(xiǎn)組孕婦總體 胎兒 CNVs 異常檢出率為 0.9% （1/113 ），與文獻(xiàn)報(bào)道的無(wú)指征或單 純高齡孕婦 CMA 異常檢出率 8 相當(dāng)。因此，不良孕產(chǎn)史孕婦如果無(wú) 染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)因素且胎兒無(wú)超聲異常發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)前CMA 檢出率與無(wú)指征產(chǎn)前診斷孕婦相比并無(wú)明顯增加，是否行產(chǎn)前CMA 檢測(cè)需要結(jié)合家屬意愿進(jìn)行綜合評(píng)估，而并非一線推薦。曾妊娠過(guò)染色體非整倍體胎兒的婦女再次

16、妊娠時(shí)，通常認(rèn)為胎兒染色 體異常的風(fēng)險(xiǎn)增加，但這一結(jié)論源于上世紀(jì)80 年代歐洲羊水穿刺的數(shù)據(jù) 11 。 2004 年的一項(xiàng)研究認(rèn)為這種風(fēng)險(xiǎn)增加可能與再孕時(shí)孕婦年 齡增加有關(guān)，因?yàn)樾Ｕ袐D年齡后，既往有染色體三體妊娠史的婦女 與沒(méi)有染色體異常胎兒妊娠史的婦女相比，再孕時(shí)胎兒染色體三體的 發(fā)生率并無(wú)增加（ OR=1.3 ， 95%CI ：0.72.1 ）12 。本研究低風(fēng)險(xiǎn)組 中有 14 例 21- 三體患兒生育史和 3 例性染色體非整倍體患兒生育史， 無(wú)一例胎兒 CMA 異常。與 21 世紀(jì)初相比，對(duì)于常見(jiàn)的非整倍體，目 前有更多靈敏度、特異度以及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值更高的篩查手段，因此對(duì)于 這一組不良孕產(chǎn)史的婦女，再孕時(shí)是否將侵入性產(chǎn)前診斷作為一線檢 測(cè)方法，值得探索。對(duì)于 CMA 分辨率以下的基因組變異， 或者單個(gè)基因內(nèi)部的缺失 / 重復(fù)、 單堿基突變， CMA 均無(wú)法檢測(cè)，因此先證者為單基因突變時(shí)，應(yīng)選擇 基因序列檢測(cè)方法。 再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)按孟德?tīng)栠z傳定律計(jì)算， CMA 可檢測(cè)的 CNVs